高粱抗病基因SbSGT1的克隆及原核表达

为探究高粱抗病基因SbSGT1的功能,以高粱BTx623为材料,利用RNA反转录得cDNA,以cDNA为模板扩增出全长SbSGT1基因,并对其进行生物信息学分析。进一步构建pET-28a-SbSGT1重组质粒进行原核表达,并分别对表达菌株、诱导温度以及异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导浓度进行了优化。结果表明,SbSGT1全长1 095 bp,编码364个氨基酸,蛋白理论分子大小约为40.45 kDa,蛋白质等电点为5.0。进化树分析表明,SbSGT1与玉米和水稻的亲缘性较高;蛋白质序列分析表明,SbSGT1蛋白为亲水性蛋白,定位在细胞质中;二级结构预测发现其α螺旋和无规则卷曲占比最高,分别达到43.41%和45.88%。原核表达结果表明,SbSGT1最佳表达菌株为大肠杆菌BL21(DE3),最佳诱导温度和IPTG浓度分别为25℃和0.8 mmol·L^-1。本研究为进一步探究SbSGT1基因在高粱抗病机理中所发挥的生物学功能奠定了基础。     

高粱SbJAZ1基因克隆与表达分析

JAZ1基因是编码TIFY家族JAZs蛋白的基因之一。为克隆高粱SbJAZ1基因及研究其响应胁迫表达特性,本试验以高粱品种BTx623为研究材料,提取其总RNA,反转录获得cDNA,以cDNA为模板扩增SbJAZ1基因,并对其进行生物信息学、基因表达和原核表达分析。结果显示,SbJAZ1基因全长606 bp,编码201个氨基酸,蛋白质等电点为7.70,分子量大小为21.15 kDa;SbJAZ1与玉米相应同源基因亲缘关系最近,为亲水性蛋白;二级结构中α螺旋占25.37%、延伸链占9.95%、β转角占4.98%,无规则卷曲占59.70%。qRT-PCR分析表明,SbJAZ1在高粱根、茎、芽和叶组织中均有表达,且具有组织表达特异性,在茎中表达量最高;茉莉酸(JA)处理1 h后,SbJAZ1在高粱茎中表达量最高;吲哚乙酸(IAA)和PEG-6000可诱导SbJAZ1的表达。原核表达结果显示,SbJAZ1在大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株诱导表达的最佳条件为:温度30℃,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)浓度0.8 mmol·L~(-1)。本研究结果为SbJAZ1基因的生物学功能研究提供了基础。     

高粱转录因子SbWRKY71基因的克隆及其在逆境胁迫下的表达分析

为了探究WRKY转录因子在植物抵抗逆境胁迫方面的重要作用,本研究通过基因克隆的方法,从高粱BTx623中克隆得到一个WRKY转录因子基因(SbWRKY71),该转录因子基因全长1335 bp(phytozome登录号:Sb04g005520),编码364个氨基酸,分子量为38.95 kDa;预测该转录因子定位于细胞核,...     

玉米尿卟啉原Ⅲ脱羧酶同功酶生物信息学分析、基因克隆和原核表达

尿卟啉原Ⅲ脱羧酶是生物卟啉类化合物分支合成的关键酶。从GenBank中搜寻到4种玉米尿卟啉原Ⅲ脱羧酶：Les22、UROD1、UROD2和截短UROD,氨基酸序列比对显示N端的同源性较差;玉米les22基因比urod1基因在开放阅读框的上游少3个碱基,导致阅读框移码。植物除玉米外存在高度同源的UROD1和UROD2,具有结构完整性。本文以玉米幼叶总RNA为模板,通过RT-PCR克隆了玉米les22和urod2基因,并对突变位点进行校正,同时通过定点突变获得urod1基因,它们都编码去除叶绿体导肽的尿卟啉原Ⅲ脱羧酶。再分别将les22、urod2和urod1基因插入大肠杆菌的不同表达载体,转化表达菌株BL21（DE3）,16℃诱导表达18h,SDS-PAGE分析显示,Les22的N端含有组氨酸标签或SUMO蛋白,重组蛋白表达为包涵体,UROD2的N端含有组氨酸标签或SUMO、TRX、GST或MBP蛋白,未检测到目的蛋白在上清液的特异表达,而UROD1和MBP融合为可溶性表达,表明玉米UROD的N端氨基酸残基可能参与蛋白在大肠杆菌的折叠。这为研究玉米UROD的种类和功能奠定基础。     

葡萄VvJAZ9蛋白原核表达与多克隆抗体制备

JAZ蛋白是茉莉酸(JA)信号调控途径中的重要组分,也是调节JA参与植物生长发育以及逆境应答的关键因子。JAZ9基因是编码TIFY家族JAZs蛋白的基因之一。为研究欧洲葡萄VvJAZ9蛋白参与低温胁迫的功能,本试验以欧洲葡萄霞多丽叶片为研究材料,通过同源克隆获得了VvJAZ9基因序列,其全长807 bp,编码268个氨基酸,定位于第11条染色体,有5个外显子和4个内含子;VvJAZ9蛋白具有JAZs家族蛋白中特有且高度保守的TIFY和CCT＿2结构域,与拟南芥AtJAZ1和AtJAZ2亲缘关系最近。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析结果表明,VvJAZ9基因在低温处理1～24 h后表达量呈上升趋势,在24 h表达量最高。亚细胞定位结果证实VvJAZ9定位于细胞核。将VvJAZ9的开放阅读框(ORF)序列克隆至原核表达载体pET28b上,在大肠杆菌(E. coli BL21)中经37℃、1.0 mmol·L^-1异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达获得VvJAZ9-His融合蛋白,再经抗原免疫,血清纯化后制备anti-VvJAZ9兔源多克隆抗体。蛋白...     

高粱AGO蛋白家族基因鉴定及表达分析

Argonaute (AGO)蛋白是RNA介导的沉默复合物RISC的核心成分,在小RNA、Dicer?like酶等的协同下共同激发RNA沉默反应。为阐明高粱中AGO蛋白的功能,本研究采用生物信息学的方法首次在高粱全基因组水平鉴定15个SbAGOs,分别定位于高粱的7条染色体上,根据氨基酸序列将其划分为三个亚家族。亚家族Ⅲ中SbAGO7和SbAGO3都含有3个外显子,亚家族Ⅱ中SbAGO4和SbAGO6都具有22个外显子,成员最多的亚家族Ⅰ中基因外显子数量介于19~24之间。其中,亚家族Ⅰ中SbAGO1-1和SbAGO1-3、SbAGO1-3和SbAGO1-4、SbAGO5-2和SbAGO5-4发生过基因复制事件,可能存在功能冗余现象。NCBI表达谱数据库分析发现,SbAGO1-1、SbAGO1-2、SbAGO1-3和SbAGO4在高粱不同组织器官和生长发育阶段均有较高表达,其中SbAGO1-1和SbAGO1-2、SbAGO1-3和SbAGO4表达时期和表达量基本一致,可能在调控高粱生长发育方面发挥协同作用。高温、干旱及高温与干旱复合逆境表达谱芯片数据分析发现,高温处理引起5个SbAGOs基因差异表达,干旱处理SbAGOs表达变化不明显,复合逆境引起7个SbAGOs基因差异表达;2个处理共同差异表达基因为SbAGO1-3、SbAGO1-1、SbAGO5-2和SbAGO3,表达量变化趋势相近。其中SbAGO1-1、SbAGO1-2、SbAGO1-3和SbAGO5-6下调表达,SbAGO3、SbAGO5-2、SbAGO1-4和SbAGO10上调表达。本研究结果为揭示SbAGO蛋白功能和发掘高粱的抗逆育种靶向基因资源提供了一定的理论依据。     

蓖麻延伸因子基因的克隆与表达分析

为探讨蓖麻延伸因子基因(RcEF-1α)作为参考基因进行相关研究的可行性,以蓖麻雌性花为试验材料,扩增RcEF-1α(GenBank登录号: XM_002518027.3)的编码序列(CDS),并将其亚克隆至原核表达载体pET32a(+)构建成重组载体pET32a(+)-RcEF-1α;将pET32a(+)-RcEF-1α转化至大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3)中进行优化表达,表达蛋白经纯化后进行Western blot验证。结果表明,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)可诱导一个分子量约66 kD的特异蛋白;采用纯化的表达蛋白免疫新西兰白兔制备抗RcEF-1α的多克隆抗血清,用多克隆抗血清进行Western blot验证,发现多克隆抗血清具有针对RcEF-1α的特异性,经ELISA检测,其效价为1∶51 200;以抗血清为一抗,通过Western blot分析RcEF-1α在时空条件一致且正常生长的根、茎、叶、雌花、雄花和果实中的表达量,结果显示,蓖麻各组织中RcEF-1α蛋白质的含量存在显著差异,其中雌花和雄花中的含量显著高于其他组织。RT-qPCR分析结果表明,蓖麻各组织中RcEF-1α mRNA差异不显著。本研究结果为蓖麻功能基因表达分析参考基因的筛选提供了一定的理论依据。     

茶树CsSNAT基因的克隆与表达分析

为明确茶树SNAT基因的序列特征和表达特点,在茶树转录组测序的基础上以茶树(Camellia sinensis)品种舒茶早为试验材料,通过SMART^TM RACE技术克隆茶树褪黑素合成途径中关键限速酶5-羟色胺-N-乙酰转移酶CsSNAT基因的cDNA全长序列,并分析其基因结构和表达模式。结果表明,CsSNAT基因序列全长1 014 bp,其中包含742 bp的完整开放阅读框(ORF),编码247个氨基酸,预测等电点7.64,蛋白分子量27.36 kDa。氨基酸序列比对显示,CsSNAT蛋白与其他高等植物的SNAT蛋白具有较高同源性,与葡萄 VvSNAT(CBI31163)同源性最高,为66.19%。诱导蛋白最佳条件为温度28℃,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度0.5 mg·L^-1,诱导时间6 h,在上清液中可获得大量分子量为66 kDa的可溶性融合蛋白。实时定量 PCR 分析表明,CsSNAT在褪黑素处理6 h后表达量最高,为对照的3倍;茶尺蠖取食6 h后,CsSNAT表达显著上调。不同激素处理结果显示,CsSNAT受脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)和水杨酸(SA)诱导表达。本研究结果为5-羟色胺-N-乙酰转移酶功能研究奠定了一定的基础。     

鸡破骨细胞分化因子（chRANKL）的克隆、表达和活性分析

为探讨RANKL以及OPG/RANKL/RANK通路在笼养蛋鸡骨质疏松发生中的作用,进行鸡破骨细胞分化因RANKL（receptor activator of NF-κB ligand）的克隆、表达并鉴定其活性。以成骨细胞总RNA为模板,利用RT-PCR和SOE-PCR技术体外扩增RANKL 基因,将PCR产物克隆至组氨酸标签的融合蛋白表达载体pET-32a(+),在异丙基－β－D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导下,实现了chRANKL的有效表达,表达产物纯化后稀释成不同浓度梯度作用成熟破骨细胞观察其生物学活性。结果表明,凝胶电泳显示PCR扩增产物的长度为1200 bp左右,插入片段与Genebank上报道的鸡RANKL序列完全一致。重组表达载体转化BL21后经IPTG诱导获得大小约为64 Kd的重组蛋白,Western印迹表明重组蛋白具有抗原活性;并且纯化后的蛋白能刺激成熟破骨细胞,使骨吸收指数呈剂量依赖性增加,表明具有一定的活性。     

高粱病程相关基因非表达子1(NPR1)基因家族鉴定及胁迫应答分析

非表达因子基因(NPR1)是植物系统获得抗性的激活子,也是植物响应病原菌侵染过程中的核心因子之一,在植物抗病性方面发挥着非常重要的作用.为明确高粱NPR1基因家族成员及SbNPR1的表达特性,本研究通过生物信息学及实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法,对高粱NPR1基因家族进行鉴定和表达分析.结果表明,共鉴定到5个...     

大蒜蔗糖:蔗糖1-果糖基转移酶基因As-1-SST的克隆与表达分析

植物果聚糖是一类重要的可溶性碳水化合物,其在植物中的积累可提高植物的抗逆性。为了解大蒜蔗糖:蔗糖1-果糖基转移酶的序列特征和功能,本研究采用TA克隆方法(Original TA Cloning Kit)得到乐都紫皮大蒜As-1-SST基因全长序列,利用BLAST、DNAMAN、ProtParam、SWISS-MODEL、MEGA等生物信息工具分析其序列特征,通过荧光定量PCR(qRT-PCR)分析As-1-SST基因在大蒜根、假茎、叶片和鳞芽中的表达差异及其对低温和干旱胁迫的响应情况。结果表明,大蒜As-1-SST基因全长1 872 bp, 编码623个氨基酸,推测蛋白质分子质量为69.76 kDa,理论等电点为5.19,为不稳定亲水性蛋白;亚细胞定位预测结果显示,As-1-SST蛋白主要定位于液泡,该蛋白无信号肽,包含2个特异位点,属于糖苷水解酶32(GH32)家族。在进化关系上,大蒜As-1-SST与百合科的洋葱1-SST亲缘关系最为接近。qRT-PCR分析表明,As-1-SST基因在根中的表达量最高,其次是假茎,在鳞芽和叶片中表达水平较低,具有明显的组织特异性;不同组织As-1-SST对于低温及干旱胁迫的响应差异显著,低温胁迫显著诱导了根、假茎、叶片中As-1-SST的表达,而干旱胁迫只显著提高了鳞芽中As-1-SST的表达量,说明大蒜各组织As-1-SST对逆境信号的响应机制不同。本研究为进一步鉴定大蒜果聚糖合成酶基因的生物信息学功能和表达调控机制提供了一定的理论依据。     

猪小脂肪细胞因子1（SMAF1）基因cDNA的克隆及表达谱分析

采用比较基因组学和RT-PCR方法，根据人和小鼠SMAF1基因的保守序列，设计简并引物，克隆了猪SMAF1基因的cDNA序列。所克隆片断全长256bp（GeneBank登录号 DQ191892），包括一个编码了81个氨基酸的完整编码区，该序列与人和小鼠的SMAF1基因的相似性分别为86%和78％，预测的氨基酸序列与人、小鼠、大鼠和牛的相似性分别为81％、67％、70%和84%。猪SMAF1基因在脂肪组织中高丰度表达，在4月龄瘦肉型猪（大白猪）脂肪组织中的表达量显著低于脂肪型猪（梅山猪）（P＜0.05）。本研究结果表明，猪SMAF1基因可能具有和其它物种SMAF1基因相似的功能，推测其在脂肪细胞发生和/或脂肪细胞功能中具有重要的调控作用。     

印度南瓜Na+/H+逆向转运蛋白基因CmaSOS1的克隆与表达分析

Na⁺/H⁺逆向转运蛋白(SOS1)是植物耐盐的关键因子之一,在植物响应非生物胁迫过程中发挥着重要作用。为解析印度南瓜SOS1基因的序列特征和功能,利用生物信息学和分子生物学方法对其进行研究。结果表明,克隆获得印度南瓜SOS1基因cDNA全长序列,命名为CmaSOS1,GenBank登录号:NW_019272028。序列分析表明,CmaSOS1基因的cDNA全长3 940 bp,包含一个3 429 bp的开放阅读框架,编码1 142个氨基酸。CmaSOS1基因含有23个外显子和22个内含子,全长46 314 bp。CmaSOS1蛋白的分子量为126.7 kDa,理论等电点为5.92,包含12个跨膜结构区域,具有一个Na_H_Exchanger superfamily结构域和一个CAP_ED superfamily结构域;CmaSOS1蛋白属于疏水性稳定蛋白,二级结构元件多为无规卷曲和α-螺旋。CmaSOS1蛋白与葫芦科的中国南瓜、西葫芦、甜瓜、黄瓜和苦瓜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的同源性较高,序列一致性分别为98%、98%、90%、89%和89%。实时荧光定量PCR分析表明,CmaSOS1基因在印度南瓜的根和叶中表达量较高,在茎、花、果实中的表达量较低;该基因受NaCl和聚乙二醇(PEG)诱导后均呈上调表达,推测CmaSOS1基因可能在印度南瓜抵御盐分胁迫和干旱胁迫过程中发挥重要作用。本研究为进一步揭示CmSOS1在非生物胁迫下的功能奠定了基础。     

高粱KNOX基因家族鉴定及SbKNOX22基因表达分析

KNOX基因家族是植物生长发育过程中所特有的一类转录因子,其在植物的形态建成方面发挥着重要的作用。为研究高粱KNOX基因家族特征及SbKNOX22的表达特性,本研究利用生物信息学和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的分析方法,对高粱KNOX基因家族进行了鉴定和表达分析。结果表明,在高粱中共鉴定到23个KNOX基因(SbKNOX1~SbKNOX23),亚细胞定位显示均定位于细胞核中,氨基酸序列长度介于184~802 aa之间,分子量大小介于20.23~86.14 kDa之间,理论等电点介于7.28~4.76之间,高粱KNOX基因家族蛋白均属亲水性蛋白,分布在8条染色体上。系统进化结果显示,高粱KNOX基因家族分为Class Ⅰ和Class Ⅱ两类;基因结构分析表明,Class Ⅱ类中各亚类家族成员之间的外显子和内含子数量存在较大差异;Motif分析显示,Homeobox KN结构域最为保守。qRT-PCR分析表明,SbKNOX22在高粱叶片中表达,水杨酸处理6 h时表达量最高,PEG 6000和甘露醇模拟干旱胁迫处理0.5 h后表达量开始降低,NaCl胁迫处理9 h时表达量最高。本研究结果为进一步探索KNOX家族在调节高粱生长发育、信号转导和植物激素调控等过程中的作用提供了基础。     

杜梨精氨酸脱羧酶基因PbADC的克隆与表达分析

精氨酸脱羧酶(ADC)是植物多胺生物合成途径中的关键酶.为探索ADC基因在杜梨中的序列特征及其对非生物胁迫的应答特性,采用反转录PCR(RT-PCR)技术从杜梨中克隆PbADC基因,利用生物信息学软件进行序列分析,并通过荧光定量PCR技术检测其在不同组织中的表达水平和对多种非生物胁迫的响应.结果表明,PbADC基因的开...     

烟夜蛾泛素延伸蛋白基因的克隆与表达

应用RT-PCR技术，从烟夜蛾(Helicoverpa assulta)幼虫脂肪体组织总RNA中反转录扩增泛素延伸蛋白基因的cDNA片段，扩增得到的片段全长390bp，编码一个长为129个氨基酸残基的蛋白质，预测分子量14.8kDa。同源性分析表明，此cDNA序列为ubiquitin-53aa extension protein(ubi-53，UBE)基因，在泛素蛋白后融合了一个核糖体L40蛋白(ribosomal L40 protein)。使用Clustal W软件，对cDNA编码的氨基酸序列进行了同源性分析，分析表明：烟夜蛾的泛素延伸蛋白氨基酸序列与其他真核生物泛素延伸蛋白氨基酸序列高度同源（90%－98%），与棉铃虫核多角体病毒(HaSNPV)泛素的同源性为69%。将烟夜蛾的UBE基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-2上，转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG进行诱导表达，电泳检测到一条约40kDa大小的外源蛋白，用鼠抗GST抗体进行Western blot检测表明原核表达蛋白是目的蛋白。     

小麦B类MADS-box基因WPI1和WPI2的克隆及表达分析

为探究小麦雌蕊化现象的分子遗传机制,本文从CSTP和HTS-1 2个小麦品系的幼穗中克隆得到了2个B类MADS-box基因WPI1和WPI2。WPI1基因c DNA序列长816 bp,ORF长627 bp,编码208个氨基酸残基;WPI2基因c DNA序列长983 bp,ORF长630 bp,编码209个氨基酸残基。WPI1和WPI2基因均含有典型的MADS-MEF2-like和K-box结构域,C端均具有PI结构基序。系统进化树分析表明WPI1和WPI2基因属于PI/GLO亚家族成员。Real-time PCR分析表明WPI1和WPI2基因在CSTP和HTS-1小穗中的表达模式明显不同。雌雄蕊原基形成期,WPI1和WPI2基因在HTS-1中的表达量较高,而在CSTP中表达量较低,接近为0;药隔期,WPI1和WPI2基因在HTS-1中的表达水平明显低于CSTP中的表达。WPI1和WPI2基因表达模式的改变与HTS-1雌蕊化表型有关。本研究结果为进一步探讨B类基因WPI1和WPI2在HTS-1雌蕊化中的作用奠定了基础。