全基因组基因嵌入突变体库用于发掘野生稻有用基因及超级杂交稻分子育种的策略

纵观水稻育种的历程,每一次新突破都离不开新技术的利用和新遗传种质资源的发掘.超级杂交稻在达到第二期12 000kg/hm^2的目标后,进一步挖掘产量潜力实现13 500kg/hm^2的第三期目标需要基因资源创新和分子育种技术的加盟.利用可转化大片断基因组文库和基因嵌入突变体库是发掘野生稻有利基因的新策略,它包括构建野生稻可转化大片断基因组文库,通过转基因技术,将大片段克隆导入栽培稻中,建立全基因组基因嵌入突变体库.在构建突变体库前可根据保守序列、分子标记等对大片段克隆进行筛选,减少需要鉴定的大片段克隆数量,并可利用遗传转化效率高的模式植物拟南芥来进行大片段克隆初步鉴定,避开水稻转化效率仍然不高这个瓶颈.然后通过突变体田间鉴定,筛选出抗寒、抗虫、抗病、高产等突变体材料并应用到超级杂交稻育种中;同时对控制突变性状的大片段克隆进行亚克隆、功能补偿分析和序列分析,最终克隆野生稻有利基因.这一技术也适用于发掘和克隆其他植物基因.     

绿豆荚粒数增多突变体snpp1的表型分析及基因定位

荚粒数是食用豆产量性状的构成因子,是食用豆遗传改良的育种目标之一。目前,调控绿豆荚粒数形成的遗传网络和分子基础尚不清楚。通过构建绿豆突变体库,本研究筛选获得了荚粒增加突变体snpp1,遗传分析发现该突变体受半显性基因控制。通过构建F2代分离群体,筛选群体中的极端单株构建2个DNA混池(每个池包含35个极端单株),利用全基因组重测序结合集团分离分析法,将SNPP1基因初步定位在绿豆5号染色体上3.49 Mb (92 640～3 584 000 bp)区域,包含233个注释基因。本研究将为进一步克隆SNPP1基因提供参考,为绿豆高产品种培育提供新的基因资源。     

一个控制水稻侧生小穗形成基因的遗传定位分析

水稻的穗是一个典型的圆锥花序,其发育形态直接影响水稻产量。本研究利用本课题组创建的水稻"中花11号"T-DNA插入突变体库,通过表型筛选鉴定了一个稀穗突变体。该突变体在营养生长阶段表现为分蘖数减少,生殖生长阶段稻穗一次枝梗发育正常、但二次枝梗数和侧生小穗数目显著减少,表现为明显的稀穗表型。分子检测结果表明该突变体不是由T-DNA插入导致的。通过与籼稻品种"珍汕97"构建F2遗传定位群体遗传分析表明:该突变性状受一个隐性基因所控制。采用图位克隆的方法将目标基因定位于4号染色体上的SSR标记RM16880和RM1205之间约120 kb范围内。基因组序列分析表明:该突变体是由于LAX2基因序列缺失60 bp所导致。该突变体是LAX2的一个新的等位突变体,命名为lax2-4。lax2-4为研究LAX2控制水稻穗形态建成的分子机制积累了遗传材料。     

基于PCR的两步法丝状真菌基因敲除方法

基因敲除是研究真菌基因功能的重要方法之一,目前,丝状真菌敲除多采用基因两侧的同源臂对基因组的靶标进行同源替换,然后采用抗生素对转化子进行筛选,但这存在着筛选效率低、假阳性率高、操作复杂等问题。本研究以稻瘟菌为研究对象,采取以下步骤对此进行优化:1)构建HPH-GFP(潮霉素-绿色荧光蛋白)融合表达载体; 2)分别用带有接头序列的引物克隆待敲除基因上、下游片段; 3)克隆上、下游片段与HPH-GFP组成嵌合体片段; 4)嵌合体片段转化真菌原生质体; 5)对敲除突变体进行筛选。结果表明,该法操作简便、高效,除了用潮霉素HPH作为筛选标记外,还可用GFP作为荧光筛选标记,极大提高了筛选效率,可用作丝状真菌基因功能研究。     

二倍体马铃薯基因编辑载体快速验证体系的建立

基于马铃薯熟性基因StCDF1的序列,构建了含有绿色荧光蛋白CRISPR/Cas9-StCDF1载体,并建立了农杆菌介导二倍体马铃薯遗传转化快速验证基因编辑载体的实验体系。结果表明,在发根农杆菌介导的遗传转化过程中,在生根培养基中添加2mg·L^-1的抗生素特美汀,能有效抑制发根农杆菌且不影响发状根的生长。利用荧光检测可实现对转化再生的阳性发状根进行快速筛选。结合对阳性根中拟编辑靶标序列的测序分析,发现所筛选出的阳性发状根中出现多种缺失类型,证明所构建的基因编辑载体和荧光筛选方法的可靠性。进一步利用根癌农杆菌介导转化马铃薯茎段,通过稳定的遗传转化最终获得1株StCDF1缺失5bp的杂合突变体。本研究在二倍体马铃薯中建立了快速验证基因编辑载体的方法,并获得了1株基因编辑植株,为后续研究StCDF1基因的调控网络提供了材料。     

博落回愈伤抗除草剂Bar基因的转化以及抗性功能的检测

本研究成功建立了一个全新的以博落回愈伤为外植体的遗传转化体系。该遗传体系将抗草丁膦的Bar基因整合到pcambia2301质粒,构建植物载体,通过农杆菌介导转染博落回愈伤,选用Bar基因为筛选标记,采用PPT进行筛选,对转染的愈伤和组培苗用PCR、RT-PCR、GUS染色等方法验证为阳性,获得了抗除草剂的博落回植株。该遗传体系相比以叶片为外植体、抗生素为筛选标记的遗传体系,更能加快转化时间,缩短转化周期,而且假阳性更低,对于博落回生物学研究具有一定帮助。     

尖孢镰刀菌T-DNA插入突变体的筛选及插入基因分析

在建立T-DNA插入突变体库的基础上,为筛选出致病力明显下降的突变体并明确其插入位点信息,对突变体的培养表型和致病性差异进行测试,研究结果为进一步阐明尖孢镰刀菌致病分子机制奠定基础。在前期构建的T-DNA插入突变体库中,采用PCR检测筛选了300株T-DNA插入突变体,观察和测定菌落形态、生长速率、产孢量、遗传稳定性等生物学性状,用海棠胚根接种法比较突变体致病力差异,对筛选到的致病力明显减弱的突变体进行插入位点侧翼序列分析及Southern杂交分析。结果显示,283个供试突变体都已插入目的基因,并伴有绿色荧光。将T-DNA插入突变体连续转接培养5代后,在含潮霉素B的培养基上能稳定遗传,且菌落形态和颜色无明显改变;在对283株突变体进行致病性测定中,87.9%的突变菌株致病力减弱,在致病力减弱的突变体中,HS2-520、HS2-1016和HS2-2109几乎丧失了致病性。选取8株致病力明显减弱的突变体进行Southern杂交分析,结果显示,其中6株突变体为单拷贝插入菌株,1株为双拷贝插入菌株。对这8株突变体进行了TAIL-PCR侧翼序列扩增,经公司测序,与野生菌株HS2基因组序列比对后获...     

贝莱斯芽孢杆菌HN-1突变体文库的构建及Arp基因的鉴定

贝莱斯芽孢杆菌HN-1是一株对香蕉枯萎病4号生理小种尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense race 4)具有良好抑制活性的生防芽孢杆菌。本研究旨在构建生防菌HN-1的突变体库,在突变体库的基础上深入研究生防芽孢杆菌的抑菌机理,针对香蕉枯萎病的生物防治夯实理论基础。将携带转座子TnYLB-1的温敏型质粒载体pMarA质粒利用化学法转化进入贝莱斯芽孢杆菌HN-1中,通过50℃高温诱导后构建了由1 800个HN-1突变体组成的贝莱斯芽孢杆菌HN-1突变体文库,质粒消除率达99.7%。通过平板抑菌法筛选得到一株对尖孢镰刀菌Foc4的抑制活性降低的突变体,利用反向PCR技术确定插入破坏的基因与贝莱斯芽孢杆菌模式菌株FZB42 arsenic resistance protein (RBAM-550730)基因同源性为99%,在系统进化树中与贝莱斯芽孢杆菌模式菌株FZB42中的该基因属于同一分支。通过筛选鉴定HN-1突变体文库中抑菌活性丧失突变体发现HN-1中Arp基因与生防芽孢杆菌HN-1抑制尖孢镰刀菌的活性有密切的关系。     

Mu转座子介导的玉米插入突变体的鉴定

选取5个对干旱胁迫响应的玉米蛋白磷酸酶基因,从Mu突变体库中定向筛选到这些基因共92个Mu转座子插入的候选突变体.在田间种植这些候选突变体的后代,每个12粒.利用巢式PCR对这些后代植株的目标插入位点进行鉴定,选择阳性植株与B73杂交或回交.在92个候选突变体中,有21个为可遗传的Mu转座子插入突变体;其中8个突变体的...     

3种基因突变方法在微生物中的应用研究进展

为了解某个基因的功能,最常用的方法就是构建该基因缺失的突变体,通过测定突变体的某些性状来分析该基因的功能,因此,获得由基因型决定的表型突变体在生物学研究中极为重要。本研究主要介绍了3种构建基因突变体的方法：转座子插入突变、同源重组和定点突变技术,转座子插入方法多用于构建突变体库,同源重组多用于基因功能的研究,定点突变多用于蛋白质功能的研究。3种方法各自侧重点不同,将同源重组和定点突变技术结合起来是将来研究基因突变的一个方向。最后,论述了基因突变技术存在的缺陷和不足,提出该技术还亟待完善。     

棉花黄萎病菌致病的分子机理

阐述了大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb)产生的细胞壁降解酶、蛋白酶和毒素在致病中的作用及微菌核形成机制,全面分析了基因组学途径、RNA干涉和农杆菌介导的转化等真菌功能基因组学技术在大丽轮枝菌致病分子机理研究上的进展.     

农杆菌介导的基因敲除技术在丝状真菌基因功能研究中的应用

 近年来不少丝状真菌全基因组测序已经完成或正在进行,基因功能研究已成为真菌研究的一个热点。利用反向遗传学的方法敲除基因是研究丝状真菌功能基因的常用方法之一,基因敲除是通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组,可以敲除整个基因,或者将一个基因替换成该基因的等位基因,或者用一个调控启动子替换一个基因正常的启动子,从而精细地定点修饰和改造基因DNA片段的技术。本文简述了利用农杆菌介导的遗传转化方法（ATMT）进行基因敲除的技术在丝状真菌基因组功能研究中的应用。     

The art of attrition: development of robust oat microsatellites

Microsatellite or simple sequence repeat (SSR) markers are important tools for genetic analyses, especially those targeting diversity. The primary objective of this study was to develop robust oat‐based microsatellite markers from newly enriched genomic libraries to expand on a relatively small existing oat SSR toolbox. Microsatellite motifs characterized by (CA/GT), (AAT/TTA), (ATG/TAC) and (CATC/GTAG) repeats were targeted for enrichment. Preliminary screening showed that 90% of clones from the (CA/GT) and 79% of the clones from the (ATG/TAC) libraries contained repeats, while < 11% of the clones from (AAT/TTA) and (CATC/GTAG) libraries contained repeats. Subsequent sequencing of 1536 clones from the (CA/GT) and (ATG/TAC) libraries resulted in 539 and 578 SSRs for which primers were designed, respectively. A total of 246 SSRs were polymorphic across 11 oat lines. One hundred and twenty‐five of the markers produced highly reproducible assays that interrogated 369 alleles at 193 loci. Of these, 79 robust assays interrogated 146 codominant alleles. These markers will be useful for a wide range of genetic analyses in oat including assessment of diversity and marker‐assisted breeding.     

小麦幼胚组织培养研究进展

小麦组织培养是利用基因工程改良小麦品种的重要基础和保证,小麦幼胚转化体系的建立对促进小麦基因工程研究和功能基因组研究具有重要的意义。以幼胚为外植体进行小麦组织培养的方法被大多数学者认为是最有效的培养方式。笔者就目前中国小麦幼胚组织培养研究现状,对品种、胚龄、培养基、外源激素、预处理、接种方式等研究现状进行了综述,目的是为了进一步建立和完善小麦幼胚再生体系和转化体系提高参考。     

基于抗草甘膦基因的棉花茎尖农杆菌介导转化方法的研究

以中棉所49、珂字棉201和YZ-1为受体材料,通过对培养基草甘膦浓度、农杆菌侵染时间和浓度、共培养时间以及恢复培养条件等因素的优化,建立了基于抗草甘膦基因的棉花茎尖农杆菌转化技术体系,并将抗草甘膦基因(EPSPS-G6)导入3个受体材料,获得转基因抗草甘膦棉花植株.研究结果表明,适合于棉花茎尖农杆菌介导的草甘膦筛选浓度为10 mg·L-1;茎尖转化体系为农杆菌菌液OD600为0.9～1.0,侵染时间为20min,共培养时间为48 h,选用SH培养基并加入适量活性炭(0.5 g·L-1)作为恢复培养基.用本研究创制的转化技术体系,转化处理3个陆地棉受体360个茎尖,共获得60株抗性再生植株,经PCR检测,获得阳性抗性植株26株,移栽成活23株.以茎尖外植体数计算,本体系的转化成功率6.4％.该转化体系适合于转化抗草甘膦基因或以抗草甘膦基因为筛选基因的外源基因,具有转化频率高、嵌合体少、转化周期短等优点.     

棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体库的构建及其表型分析

 以棉花强致病力黄萎病菌株V592为材料,利用农杆菌介导的T-DNA插入技术构建了一个含15000个转化子的突变体库,对突变体的生物学特性、致病力及T-DNA插入拷贝数进行研究,结果显示：(1) 突变体的菌落形态分为菌核型、中间型、菌丝型和菌膜型,分别占92.12%,4.54%,3.19%和0.15%;（2）菌核型、中间型和菌丝型菌株,在菌落生长速度和孢子大小方面无明显差异;而在产孢量方面,菌核型普遍强于中间型和菌丝型;（3）致病性测定显示,菌核型的致病力普遍强于中间型和菌丝型;（4）Southern杂交显示,T-DNA单拷贝数插入的突变体比率约为70.99%,而菌核型的单插入率为80.00%,明显高于中间型(69.23%)和菌丝型(64.71%)。以上结果表明,农杆菌介导转化技术可用于棉花黄萎病菌突变体库的快速构建,突变体的菌落表型与其产孢能力、致病力及T-DNA插入拷贝数等之间存在一定的相关性。     

农杆菌介导大豆子叶节遗传转化的研究

直接以农杆菌转化系统为平台,以栽培大豆(Glycine max L.) 吉林35、中黄28、南农、铁丰29、铁丰30、开育12的子叶节为外植体,用LBA4404 农杆菌（含pPC-KSA质粒）研究了影响大豆子叶节转化的因素。结果表明,大豆品种之间转化存在着差异,吉林35转化率最高,平均转化率为2.16%,单次最高转化率达6.12%;中黄28次之,平均转化     

一种水稻真空渗透转化装置及方法的研究

探究适用于水稻的真空渗透转化装置及方法,旨在解决目前水稻转基因效率低、转化体变异多、周期长等问题。以抽穗期的‘云资粳41号’幼穗作为受体,应用自制的水稻真空渗透装置对其短暂抽真空渗透浸染导入外源基因。本试验共计转化水稻30株,收获19860粒T0代种子。研究发现不同浓度除草剂对T0代种子的萌发影响不显著,但对T1代材料的生长发育却具有明显抑制作用,因此选择苗期喷施法进行抗性转化子筛选,最佳筛选浓度为20 mg/L。经除草剂抗性筛选,获得抗性苗135株。经PCR分子检测,最终获得阳性苗114株,表明外源DNA已成功导入到受体水稻基因组中。本研究首次应用真空渗透法快速实现了水稻外源基因的转化,为水稻及其他作物的基因转化提供了一种快速、有效的新装置和新途径。     

黏类小麦育性相关基因SSH文库的构建

为了深入研究黏类小麦雄性不育的分子遗传机制, 利用抑制差减杂交技术构建了黏类小麦育性相关基因的cDNA文库。文库质量检测表明, 差减杂交效率较高, 质量较好。在不育和可育cDNA文库中随机挑选120个阳性克隆进行测序, 获得100余条高质量的表达序列标签(EST)。对序列进行BLAST比对及功能注释, 比较了不育和可育cDNA文库的基因表达谱, 发现在可育cDNA文库中参与能量代谢的基因出现频率较高, 在不育cDNA文库中检测到了与花发育调控相关的MADS-box转录因子、细胞凋亡相关的泛素结合酶及阻遏淀粉合成的腺苷二磷酸葡萄糖磷酸化酶等相关基因。这些基因很可能与育性相关。     

用磁珠富集法分离亚麻基因组微卫星分子标记

应用Dynal磁珠-生物素标记的微卫星探针(CT)₁₅与亚麻基因组DNA酶切片段杂交,捕获300~1 500 bp含有微卫星序列的DNA片段,连接到pMD18-T载体中,构建富集微卫星序列的小片段插入文库。利用接头引物和根据微卫星核心序列设计的引物VRV(CT)₁₅使用PCR方法直接对文库筛选,从422个转化子中获得了104个阳性克隆,对其进行测序分析,获得了97个微卫星序列,微卫星序列的富集效率达到22.99%,PCR扩增筛选效率93.27%。对97个微卫星序列进行比对分析,其中51个重复序列的两端序列高度相似,据其设计的特异引物对阳性克隆进行2次筛选,能淘汰相似度高的同类序列,提高筛选亚麻微卫星标记的效率。