鸡堆型艾美耳球虫特异性单抗重链可变区基因的克隆与测序

提取堆型艾美耳球虫子孢子杂交瘤细胞总RNA,进行RT PCR,扩增出重链可变区基因。将已扩增出的鸡堆型艾美耳球虫特异性单抗重链可变区基因片段与pMD 18T载体连接,重组载体转化于感受态细胞JM109,筛选出阳性重组子,提取阳性重组子质粒并进行测序,得到单抗重链可变区的基因序列,为单链抗体基因的构建及免疫毒素的构建奠定了基础。     

鸡堆型艾美耳球虫特异性单抗轻、重链可变区基因的克隆与序列测定

将已扩增出的鸡堆型史美耳球虫特异性单抗轻、重链可变区基因进行纯化,并用纯化的2基因片段与pMD-18T载体连接,将重组载体转化于感受态细胞JM109,筛选出阳性重组子,提取阳性重组子质粒并进行测序.得到单抗轻、重链可变区的基因序列.轻链基因为312 bp,重链基因为381 bp,为单链抗体基因的构建及免疫毒素的构建奠定了基础.     

鸡堆型艾美耳球虫特异性单抗轻链可变区基因的制备及测序

研究提取了鸡堆型艾美耳球虫特异性杂交瘤的RNA,成功地扩增出了轻链可变区基因,并对扩增的轻链可变区基因进行了克隆测序,为单链抗体基因的构建奠定了基础.     

天然鼠源噬菌体抗体库的构建及抗鸡堆型艾美耳球虫裂殖子单链抗体的筛选（英文）

从未经主动免疫的BALB/c小鼠脾脏淋巴细胞中提取总RNA,用RT-PCR扩增鼠抗体重链(VH)和轻链(VL)可变区基因,将轻链和重链可变区基因经重叠延伸拼接PCR反应,构建成单链抗体(ScFv)基因。将ScFv基因克隆到噬菌体载体PCANTAB-5E,转化入大肠杆菌TG1中,筛选出阳性克隆,接种于LB培养基,经辅助噬菌体M13KO7拯救,构建天然鼠源噬菌体抗体库,并进行抗体库滴度测定,通过DNA finger printing技术及单链抗体基因序列分析鉴定抗体库的多样性。以堆型艾美耳球虫裂殖子为靶抗原,对构建的噬菌体抗体库进行亲和筛选,将强阳性重组噬菌体克隆感染大肠杆菌HB2151,经IPTG诱导表达可溶性ScFv抗体,并对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot鉴定,用ELISA法鉴定其对堆型艾美耳球虫裂殖子抗原的结合活性。结果表明,天然鼠源噬菌体抗体库成功构建,库容量约为2.50×10~(11) CFU/mol,单链抗体库具有一定的多样性。经过4轮亲和筛选,携带抗鸡堆型艾美耳球虫裂殖子表面抗原的特异性噬菌体抗体得到了富集。特异性ScFv抗体在E.coli中分泌表达,表达产物具有免疫活性。筛选出5个与鸡堆型艾美耳球虫裂殖子抗原结合活性较高的克隆,构建的单链噬菌体抗体库的有效表位具有多样性。本研究为进一步认识鸡球虫的各个发育阶段奠定理论基础,为鸡球虫病免疫控制研究提供参考。     

抗堆型艾美耳球虫子孢子单抗对阶段特异性抗原的识别

为了用针对堆型艾美耳球虫子孢子的5株单抗检测各代裂殖子的反应性,分别用甲醇、丙酮、戌二醛和自然干燥等4种固定方法处理裂殖子,观察其对染色结果的影响;并运用免疫荧光技术（IFA）,对单抗和裂殖子进行染色。结果显示,5株单抗中,单抗Easp-3H6和单抗Easp-5G10识别堆型艾美耳球虫裂殖子的抗原位于裂殖子的顶端,单抗5B4对各阶段裂殖子有较弱的反应,而单抗Easp-3G3和5G7不与堆型艾美耳球虫任何一代的裂殖子发生反应,表明鸡堆型艾美耳球虫的侵入阶段存在共有抗原,即种内各发育阶段的抗原。     

间接血凝检测鸡柔嫩艾美耳球虫血清抗体方法的建立

为了快速检测免疫球虫后宿主血清中特异性抗体的水平,以DE-52层析纯化子孢子、裂殖子,超声裂解获取可溶性蛋白;原核表达EtMIC4-N蛋白,致敏戊二醛醛化后的红细胞,以人工免疫柔嫩艾美耳球虫后分离的血清为阳性血清,以SPF鸡分离的血清为阴性血清,建立柔嫩艾美耳球虫间接血凝试验。结果显示,稀释度为1:2万鞣酸处理戊二醛醛化后的红细胞,使用100μg/mL可溶性裂殖子、子孢子蛋白或12.5μg/mL表达的重组蛋白EtMIC4-N均可以与阳性血清发生反应(可达1:1024),与鸡的阴性血清及大肠杆菌病的阳性血清无反应.与堆型艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫阳性血清有微弱反应(不超过1:8)。试验证明,该方法具有简单、方便、快捷、灵敏等优点。     

鸡柔嫩艾美耳球虫SO7基因的原核表达及动物免疫试验

为了研究鸡柔嫩艾美耳球虫SO7基因原核表达重组蛋白的免疫效力,分析其在鸡抗柔嫩艾美耳球虫感染中对鸡平均增重、抗球虫指数(ACI)、减少盲肠病变和卵囊数量中的作用,从柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊中提取总RNA作为模板,用RT-PCR扩增出SO7基因片段,再应用DNA重组技术将SO7基因克隆到原核表达载体pET32a(+)中并用IPTG诱导表达。SDS-PAGE结果显示,pET32a(+)-SO7表达的目的蛋白约为40ku,主要以包涵体形式存在。用纯化的重组蛋白进行动物免疫试验显示,SO7重组蛋白在鸡抗柔嫩艾美耳球虫感染中有较好的免疫保护作用,能够显著提高鸡柔嫩艾美耳球虫感染鸡的平均增重和抗球虫指数(ACI),对减少盲肠病变和卵囊数量也有部分作用。     

斯氏艾美耳球虫Rhomboid基因抗原优势区的筛选与鉴定

为了筛选并鉴定斯氏艾美耳球虫Rhomboid基因抗原优势区,试验采用预测斯氏艾美耳球虫Rhomboid基因跨膜结构域,PCR扩增4段目的片段,构建表达载体,并通过SDS-PAGE和Westernblot技术分析目的蛋白。结果表明:成功克隆出4段斯氏艾美耳球虫Rhomboid基因,片段大小分别为102 bp、75 bp、93 bp、99 bp,重组原核表达质粒p ET-32a-Rho1~4构建成功;经SDS-PAGE和Western-blot分析,构建的4段重组质粒都得到了表达且与理论值相符,且重组蛋白中p ET-32aRho4可与兔斯氏艾美耳球虫阳性血清发生特异性反应。     

鸡毒害艾美耳球虫表面抗原基因(EnSAG)的克隆表达及其免疫保护力

为了研究鸡毒害艾美耳球虫表面抗原基因(EnSAG)的功能,以毒害艾美耳球虫(扬州株)第二代裂殖子的总RNA为模板,RT-PCR扩增其EnSAG,连接至pGEM-T-Easy载体,鉴定后构建pET28a(+)-EnSAG表达载体,转化至大肠杆菌BL21,鉴定后进行诱导表达和纯化。用纯化重组蛋白免疫BALB/c小鼠,制备抗EnSAG蛋白的多克隆抗体。利用多克隆抗体,用Western blot技术检测子孢子和第二代裂殖子中的天然EnSAG蛋白。用重组蛋白按高剂量(200μg/羽)、中剂量(100μg/羽)和低剂量(50μg/羽)免疫雏鸡,同时设置未免疫攻虫组和未免疫未攻虫组为对照,以成活率、平均增重、相对增重率、卵囊减少率、病变记分和抗球虫指数(ACI)为指标,评价重组蛋白的免疫保护力。结果显示：该基因全长768 bp,编码255个氨基酸,分子质量24.63 ku;重组蛋白大小约为30 ku,以包涵体形式为多,能被组氨酸单抗和鸡抗毒害艾美耳球虫阳性血清特异性识别;在第二代裂殖子中检测到天然EnSAG蛋白,其分子质量大约为27 ku。各试验组的成活率均为100%;免疫组的平均增重增加,病变记分...     

鸡柔嫩艾美耳球虫EtMIC2和SO7蛋白的原核表达及SIgA抗体间接ELISA检测方法建立

【目的】建立检测鸡肠道黏膜柔嫩艾美耳球虫SIgA抗体的间接ELISA检测方法以期对鸡柔嫩艾美耳球虫特异性黏膜免疫水平进行评价。【方法】将鸡柔嫩艾美耳球虫EtMIC2和SO7基因克隆至pET-28a(+)原核表达载体,构建EtMIC2-SO7重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后,通过SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定。采用镍柱亲和层析法对EtMIC2-SO7重组蛋白进行纯化,用Bradford法测定蛋白浓度。以纯化的重组蛋白作为包被抗原,通过方阵滴定法,确定ELISA检测抗原、待检黏膜的最佳工作浓度,通过单一变量法确定最佳待检黏膜孵育时间、封闭液种类、酶标二抗、显色液工作条件,参照ELISA抗体检测试剂盒阴阳性判定标准,以S/P≥0.4为阳性,S/P<0.4为阴性作为黏膜样品阴阳性判定标准,对ELISA检测方法的重复性、特异性、敏感性进行验证并与鸡柔嫩艾美耳球虫全蛋白包被ELISA板检测结果进行符合率比较。【结果】SDS-PAGE和Western blotting结果显示,获得大小约70 ku的EtMIC2...     

重组辛德毕斯病毒E基因痘苗病毒的构建

为了构建表达辛德毕斯病毒E基因的重组痘苗病毒,本研究通过基因重组的方法将辛德毕斯病毒E基因及绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）基因分别连接至痘苗病毒转移载体pSTK,酶切鉴定得到阳性重组质粒pSTK-SINE-EGFP。采用脂质体转染的方法,将该重组质粒与痘苗病毒天坛株共转染BHK-21细胞,通过同源重组获得重组痘苗病毒。利用EGFP筛选阳性重组痘苗病毒vTTVV-SINE-EGFP,收集感染重组痘苗病毒的BHK-21细胞,SDS-PAGE电泳检测辛德毕斯病毒E基因在细胞中的表达情况,Western blot分析表达产物的免疫原性。结果证明辛德毕斯病毒E基因能在重组痘苗病毒vTTVV-SINE-EGFP中获得表达,且表达产物具有良好的免疫原性。表达辛德毕斯病毒E基因的重组痘苗病毒的成功构建,为研制辛德毕斯病毒活载体疫苗奠定了基础。     

利用Red重组系统敲除大肠杆菌菌株ClpP基因方法的研究

为了研究ClpP基因的功能,试验利用Red系统的重组功能,通过PCR扩增出两端与大肠杆菌菌株ClpP基因上、下游序列同源,中间为氯霉素抗性基因cat的DNA片段,电击转化含质粒pKD46的大肠杆菌菌株DH091,筛选替换ClpP基因的阳性转化子,再导入质粒pCP20去除氯霉素抗性基因。结果表明:成功敲除大肠杆菌菌株ClpP基因。     

PCV2衣壳蛋白羧基端基因在T4噬菌体表面的展示及ELISA方法的建立

用PCR扩增猪圆环病毒Ⅱ型广东分离株的衣壳蛋白羧基端基因,将PCR产物连接到pR质粒,转化DH5α细胞,筛选阳性克隆进行PCR鉴定并测序后,转化E2菌,将重组E2菌与缺陷型噬菌体T4-Z1同源重组后,得到重组噬菌体,经SDS-PAGE和Western blotting分析,表明衣壳蛋白片段在噬菌体表面正确展示,表达的融...     

牛病毒性腹泻病毒E2基因在毕赤酵母GS115中的表达与鉴定

将牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhoea-mucosal disease virus,BVDV)河北分离株HB-bd毒株E2基因去除跨膜区获得sE2基因,将sE2基因克隆入巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)分泌型表达载体pPIC9K中,筛选培养后提取阳性重组质粒,经酶切和PCR鉴定,命名为pPIC9K-sE2。重组质粒pPIC9K-sE2经SalⅠ酶切后,电穿孔导入P.pastorisGS115基因进行整合,使外源基因sE2稳定地整合到P.pastoris染色体中,G418筛选得到阳性高拷贝转化子GS115-pPIC9K-sE2。经甲醇诱导表达后,sE2融合蛋白获得了表达,表达产物经SDS-PAGE、Western-blot和Dot-ELISA分析,确定其表达的sE2融合蛋白相对分子质量大小为37 000,且具有天然蛋白的抗原特异性。免疫活性研究证明,P.pastoris表达的sE2蛋白能刺激动物产生抗体。     

利用Cre-loxP自动去除禽痘病毒重组体的报告基因

在含痘病毒早晚期启动子的绿色荧光蛋白(GFP)基因表达盒侧翼各引入1个loxP序列。以禽痘病毒282E4株作为候选载体,通过同源重组将其插入到病毒基因组的FPV030区域,获得了表达GFP的重组禽痘病毒。然后在Cre酶介导下,利用loxP位点特异性重组剪除了重组病毒基因组中的GFP报告基因。结果表明,以GFP作为筛选标记使重组病毒的构建更为简便,同时利用Cre-loxP系统可以轻松地去除报告基因。这种技术有利于其它抗原性基因重组禽痘病毒的构建。     

禽致病性大肠杆菌ibeA基因缺失及其特性分析

运用大肠杆菌Red同源重组系统,对禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)DE02株的ibeA基因进行了缺失,其结果为揭示IbeA的功能奠定了基础.通过对APEC ibeA基因缺失株与人脑微血管内皮细胞(Human brain microvascular endothelial cells,HBMECs)的黏附与侵袭,发现ibeA基因缺失后与HBMECs的黏附率为45%,侵袭率为1.2%,相对于野生型APEC均显著降低;提示ibeA基因是APEC的重要致病因子.     

表达牛冠状病毒S1基因的重组人腺病毒的构建及鉴定

为构建表达牛冠状病毒(BCV)S1基因的重组人腺病毒疫苗,本实验通过人工合成密码子优化的截短BCV S1的基因片段(55 bp～1 650 bp)。将其克隆到重组腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中,并以PmeⅠ线性化后转化含有人5型腺病毒骨架的BJ5183感受态细胞,通过细菌内同源重组的方式获得重组腺病毒质粒pAdV-BCV-S1,经PacⅠ线性化后转染AD-293细胞获得重组腺病毒rAdV-BCV-S1。利用间接免疫荧光法和western blot法检测该重组腺病毒的S1基因在AD-293细胞中的表达情况,同时用一步生长曲线法,测定该重组腺病毒的复制能力。结果表明:BCV S1基因在感染细胞中获得了高效表达:子代重组腺病毒在感染细胞后60 h滴度最高,为6.8×108 pfu/mL。该重组腺病毒的构建为BCV重组疫苗的研究奠定了基础。     

口蹄疫病毒3ABC绿色荧光蛋白载体构建及表达

将O型口蹄疫病毒Akesu／58株适应细胞培养。用RT—PCR技术从适应细胞株中克隆了3ABC基因,将其克隆入pGEM-T载体,测序鉴定。然后将目的基因与线性化的绿色荧光蛋白（PEGFPNl）栽体连接筛选阳性质粒命名为PEGFPN1-3ABC。将阳性质粒转入JM109大肠埃希茵增殖。提取PEGFPN1—3ABC质粒转染入BHK细胞,在荧光显微镜下直接观察表达结果。     

禽传染性支气管炎病毒S1基因玉米表达载体的构建

禽传染性支气管炎病毒主要编码3种结构蛋白,其中S蛋白的S1蛋白是宿主的主要保护性抗原,能诱导机体产生中和抗体和血凝抑制抗体,并与病毒的组织嗜有关.本研究选取具有代表性的禽传染性支气管炎病毒分离株SAIB14和SAIB4,以其S1基因克隆质粒pUCSAIB14和pUCSAIB4为模板,用具有高保真度的pfu酶分别扩增,得到含先导序列的S1基因片段.把扩增产物分别通过ClaⅠ和BamHⅠ酶切纯化,替换中间载体pUGFPocs的GFPm1基因,构建中间表达载本pUSAIB14和pUSAIB4.用KpnⅠ和HindⅢ双酶切重组质粒pUSAIB14和pUSAIB4,回收Ubi-S1-Tocs片段,定向插入到pCAMBIA 300载体的多克隆位点.经酶切和PCR鉴定,证明获得了S1基因的玉米表达载体pCUSAIB14和pCUSAIB4.外源基因导入受体植物能否有效表达,表达载体构建是关键因素,构建时选用表达载体的类型、启动子和终止子、目的基因插入位点等都有影响.本研究用BarHⅠ和ClaⅠ双酶切载体pUGFPocs,用S1基因扩增片段替换GFPm1基因,将S1基因置于Ubi启动子和T-ocs终止子的控制之下,有助于S1蛋白的高效表达,最后将Ubi-S1-Tocs单元HindⅢ和KpnⅠ双酶切下来,插入到pCAMBIA1300的多克隆位点,得到可用于农杆菌介导的转化或直接转化的植物表达载体pCUSAIB4和pCUSAIB14. Ubi启动子来自玉米,属组成型启动子,内含有一个内含子和外显子,是已知的最强的单子叶植物启动子,外源基因在Ubi启动子的控制下,在转基因植物的所有部位和所有的发育阶段都会表达.pCAMBIA1300是中国农业科学院作物遗传育种中心构建的植物表达载体,可用于农杆菌介导的转化或直接转化,载体中T-DNA左右边界内带有多克隆位点和筛选标记Hyg基因,Hyg基因是玉米和水稻转化试验中广泛使用的标记基因,编码潮霉素磷酸转移酶,适于玉米和水稻转化后用化学试剂潮霉素进行筛选转化体.多克隆位点处可插入外源基因,在农杆菌介导的转化中,由于卸甲载体的作用,植物表达载体T-DNA左右边界内的序列,包括外源基因和筛选标记基因部分,发生转移并进入植物细胞内,用筛选试剂潮霉素可有效筛选出整合有外源基因的转化体.转基因植物疫苗生产技术是利用分子生物学技术把重组的疫苗基因导入植物,并使植物能够大量表达重组蛋白的一类生物技术.与常规疫苗及其它新技术疫苗相比,转基因植物疫苗具有生产简单、安全、廉价及保存和运输方便等优点,由于其应用前景可观,已引起免疫学家、分子生物学家和植物学家的极大兴趣与关注.利用该技术国外至今已获得成功的有乙型肝炎表面抗原、不耐热的肠毒素B亚单位(LT-B)、诺沃克病毒外壳蛋白、流感病毒血凝素和艾滋病病毒抗原、口蹄疫病毒抗原和鼻病毒抗原、痢疾抗原等10多种疫苗,国内在利用转基因植物生产疫苗的研究方面还远远滞后于其他国家.本研究利用含先导序列的禽传染性支气管炎病毒S1基因,构建了玉米表达载体系统,为进一步在玉米中表达IBV S1基因提供了基础材料.