人工改造甜瓜钾离子通道基因ΔAT2/MIRK转拟南芥的生理特性分析

K~+通道是介导植物K~+吸收转运的主要途径之一。甜瓜K~+通道MIRK对外源Na~+敏感,生物信息学分析其敏感位点可能位于孔区外(即S5-P-S6)。为了验证MIRK受Na~+抑制位点,本研究将拟南芥中不受Na~+抑制的同源K~+通道基因KAT2孔道区替换到MIRK序列上,生成人工改造甜瓜K~+通道基因ΔAT2/MIRK。电生理实验结果显示ΔAT2/MIRK仍保持了MIRK介导K~+的属性,但其内向电流则不受外源Na~+的抑制。将MIRK和ΔAT2/MIRK分别转化到拟南芥K~+通道KAT1突变体kat1中,抗性筛选和PCR检测结果表明成功获得p35S::MIRK-kat1和p35S::ΔAT2/MIRK-kat1转基因植株。分别用50、100mmol/L的NaCl溶液处理转基因拟南芥和kat1突变体,发现MIRK及ΔAT2/MIRK在kat1中的过表达可以介导K~+内流,并参与植株对盐胁迫的响应。     

异源表达CmSAMDC基因拟南芥的耐盐性分析

利用含50 mg/L潮霉素(Hyg)的MS固体培养基成功筛选出转CmSAMDC基因的拟南芥株系TA1和TB1,并对T_3代转基因植株的耐盐性进行了分析。研究结果表明:转SAMDC基因的拟南芥在含不同浓度NaCl的培养基中发芽率、侧根数均显著高于野生型拟南芥的;转CmSAMDC基因拟南芥幼苗在200 mmol/L NaCl条件下能正常生长,且具有较低的丙二醛(MDA)含量,而野生型拟南芥在相同胁迫条件下明显萎蔫、失绿甚至死亡。说明过量表达SAMDC基因可以显著提高拟南芥的耐盐性。     

异源表达CmSAMDC基因拟南芥的耐盐性分析

利用含50 mg/L潮霉素(Hyg)的MS固体培养基成功筛选出转CmSAMDC基因的拟南芥株系TA1和TB1,并对T_3代转基因植株的耐盐性进行了分析。研究结果表明:转SAMDC基因的拟南芥在含不同浓度NaCl的培养基中发芽率、侧根数均显著高于野生型拟南芥的;转CmSAMDC基因拟南芥幼苗在200 mmol/L NaCl条件下能正常生长,且具有较低的丙二醛(MDA)含量,而野生型拟南芥在相同胁迫条件下明显萎蔫、失绿甚至死亡。说明过量表达SAMDC基因可以显著提高拟南芥的耐盐性。     

转PcRS基因拟南芥植株表型分析

为了研究虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.)白藜芦醇合酶基因PcRS的功能,以转PcRS基因拟南芥为材料,对其进行分子鉴定和表型研究.利用Southern blot和Northern blot验证了外源PcRS基因在转基因拟南芥基因组中的整合和表达.对经过选育得到的T3代纯合株系(L4、L6、L15)进行性状观察.在体视显微镜下观察野生型和转基因拟南芥植株表型;采用分光光度法测定低氮培养基上的子叶花青素含量.结果显示,与野生型拟南芥相比,转基因拟南芥的种皮颜色发生改变呈浅黄褐色,并且子叶中花青素含量显著减少.这表明PcRS基因可能导致转基因拟南芥的黄酮类物质合成受阻.     

转StBADH基因T1代番茄植株的耐盐性研究

以转StBADH基因的T1代番茄植株(SBTT)和未转基因对照品种‘金棚一号’(WT)为材料,在200 mmol/L NaCl的胁迫下,对番茄盐害级别、生长指标、相对叶绿素含量(SPAD值)、相对电导率、游离脯氨酸含量、抗氧化酶活性和活性氧代谢进行了研究.结果表明:转基因番茄的生长量、相对叶绿素含量、游离脯氨酸含量和保护酶活性均显著高于对照,而O2·-生成速率、H2O2含量、膜脂过氧化产物MDA含量、相对电导率及盐害级别均显著低于对照.以上结果显示,在NaCl胁迫下,转基因番茄耐盐性的提高与其较高的抗氧化酶活性及较小的氧化损伤有关.     

转mangrin基因水稻的耐盐性研究

以转mangrin基因水稻的阳性植株(11#,59#,86#)和阴性植株为材料,在0,100,150,200 mmol/L的NaCl溶液中经盐胁迫7 d后,测定叶片相对含水量、质膜透性、超氧化物歧化酶(SOD)活性和脯氨酸含量4项耐盐指标。结果表明:盐胁迫下,转基因植株的叶片相对含水量、脯氨酸含量、SOD活性明显高于阴性植株,叶片电导率则低于阴性植株。对转基因植株和阴性植株的耐盐性综合评定结果是11#59#86#阴性植株。     

转几丁质酶基因甜瓜植株的获得及生物学鉴定

以农杆菌介导法将水稻几丁质酶基因导入甜瓜品种“雪脆蜜2号”,PCR检测发现目的基因业已导入甜瓜植株,Southern blot杂交分析证明目的基因已整合到转基因甜瓜植株的染色组上,即获得了甜瓜转基因植株;田间抗病的生物学鉴定结果证明转基因植株提高了对白粉病的抗性,同对照比较,抗性提高2~4级,转基因甜瓜植株的其它农艺性状与阴性对照基本一致。结论为通过转基因技术能够筛选和培育出高抗白粉病的甜瓜新品种。     

转TaCRT基因拟南芥植株表型分析及抗性鉴定

为了进一步揭示小麦钙网蛋白基因TaCRT是否参与植物对环境胁迫响应,通过根癌农杆菌GV3101介导法将该基因cDNA克隆转入拟南芥,使其异源过量表达,分析转基因拟南芥纯系和野生型植株在表型上的差异,并对转基因株系的抗盐性进行鉴定。结果表明,过表达TaCRT基因的拟南芥纯系植株在正常培养条件下,植株生长相对旺盛,根系较短,分化的不定根数目较多,而在盐胁迫条件下,与野生型相比,转基因株系的耐盐性较强。     

Dip法获得转反义磷脂酶Dγ( PLDγ)基因拟南芥植株

在含反义PLDγ基因的质粒根癌农杆菌的介导下，以生长到初果期的健壮拟南芥植株为转基因材料，用Dip法进行转基因实验，对影响转化率的浸染条件进行了比较研究。适宜的转化条件是将拟南芥的整个花序浸泡于农杆菌悬浮液中(含5％蔗糖，0．04％吐温—80)，每次浸染10min，间隔3天浸染一次，共浸染3次。每次浸染后将植株横放于暗箱中24h，再置于22—24℃的光照下正常生长。待种子收获后在含有卡那霉素70mg/L的选择培养基中选择转化植株。PCR及PCR—Southem blot分析检测，该方法的转化率每100粒种子可高达2％。     

转OsMAPK4基因水稻耐盐性分析

构建了由组成型启动子E12启动子调控的OsMAPK4基因植物表达载体pCME12,利用农杆菌介导法转化黑龙江省主栽品种五优稻1号水稻愈伤组织,Southern杂交检测表明,OsMAPK4基因整合到水稻基因组上,获得了转基因水稻植株。对转基因水稻在种子发芽期和苗期进行了耐盐性分析,结果表明,转基因水稻种子在含0.2mol·L-1NaCl的培养基上能正常萌发;转基因水稻幼苗在0.4mol·L-1NaCl处理时茎部仍然为绿色,种子萌发与幼苗生长情况略优于非转基因植株栽至无盐土壤中,植株能萌发出新叶片。     

葡萄钾离子通道基因VviSKOR的克隆、表达及电生理功能

【目的】从葡萄中克隆并鉴定钾离子通道基因VviSKOR,在转录水平分析其组织特异性表达特征及对缺钾、氯化钠(NaCl)与脱落酸(ABA)等胁迫的响应情况,通过膜片钳电生理技术研究其生理学功能。【方法】通过同源克隆法,在葡萄基因组中筛选并鉴定钾离子通道基因VviSKOR;借助多种生物信息学软件分析葡萄SKOR及其编码蛋白的特征;利用MEGA 7.0软件建立葡萄、拟南芥、水稻、玉米、高粱、短柄草、大豆、番茄、黄瓜、白杨、桃、梨、草莓、苹果、木瓜、柑橘、香蕉、凤梨等18种不同科属植物SKOR同源蛋白成员的系统进化树;利用实时荧光定量PCR分析VviSKOR在葡萄不同组织部位的表达模式及对缺钾、NaCl、ABA与sorbitol等胁迫的响应情况;利用膜片钳电生理系统分析葡萄VviSKOR的生理学功能。【结果】在葡萄基因组中克隆获得一个钾离子通道基因VviSKOR,其编码蛋白含有环核苷酸结合域、离子通道跨膜域、Ankyrin repeats和KHA功能结构域,属于典型的Shaker类钾离子通道;18种不同科属植物SKOR蛋白在氨基酸水平具有58.92%的一致性,系统进化树表明葡萄VviSKOR与...     

沙棘耐盐基因HrNHX1的克隆及3'UTR序列分析

以沙棘(Hippophae rhamnoides L.)叶片为材料,用改良SDS法提取总RNA,反转录合成第一链cDNA作为模板,根据已公布NHX1家族同源序列保守区设计简并引物,扩增出沙棘中HrNHX1基因的中间序列,然后用快速扩增cDNA末端(rapid amplification on of cDNA end,RACE)方法,从沙棘中克隆到HrNHX13'cDNA序列.该序列(GenBank登录号:EU718492)长度为1 373 bp,与已知NHXI序列同源性最大为80;,其编码区1 094 bp,编码364个氨基酸,3'非翻译区(3'-untranslated resion,3'trm)长度为239 bp.3'UTR序列分析显示沙棘的3'UTR与陆地棉、葡萄柚和小盐芥的同源性分别为43.97;、45.63;和40.64;,明显低于编码区的同源性.结果表明,NHX1基因编码区具有较高的保守性,3'UTR序列的同源性较低,显示了非编码区在环境适应中的重要性,并为进一步研究沙棘对生境的适应分子机制奠定了基础.     

盐角草PsaH基因的克隆及生物信息学分析

【目的】从盐生植物盐角草(Salicornia europaea)中克隆得到一个参与光合反应光系统I(PSI)复合蛋白H亚基的Psa H基因,分析该基因进行生物信息学,为研究该基因的作用奠定基础并为改良作物耐盐性分子育种提供候选基因。【方法】以盐生植物盐角草为实验材料,采用RT-PCR方法克隆Psa H基因,利用NCBI、MEGA、Expasy等生物信息学工具对其核酸序列、编码的氨基酸序列及蛋白质的结构和功能进行分析。【结果】克隆得到一个与耐盐有关的基因,命名为Se Psa H,属于光系统I(PSI)家族H亚基成员,其开放阅读框(ORF)为438 bp,基因编码145个氨基酸,预测蛋白分子量为15.3 k D,等电点9.84,是亲水性蛋白;系统进化树分析表明其与菠菜亲缘关系较近,通过对该蛋白保守性分析发现其含有4个保守性结构域。【结论】获得盐角草Se Psa H基因,为进一步研究该基因耐盐功能及其在盐生植物耐盐机制中的作用提供了基础。     

甜瓜AMS基因结构分析及基因编辑载体构建

【目的】研究鉴定甜瓜雄性不育候选基因ABORTED MICROSPORES(AMS)的基因家族,分析CRISPR基因编技术并构建其敲除载体,为甜瓜雄性不育基因AMS功能验证提供依据。【方法】采用生物信息学技术鉴定甜瓜雄性不育候选基因ABORTED MICROSPORES(AMS)家族基因,分析其进化关系、保守基序及理化性质。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术以甜瓜AMS基因外显子区设计gRNA引物,以载体pHSN401为模板,扩增获得sgRNA克隆框,使用Bsa I酶切pHSN401载体,利用DNA重组酶构建重组载体并转化农杆菌,挑选单克隆进行培养,随后进行菌液PCR鉴定。【结果】甜瓜AMS基因编码的蛋白质长度从501～605 aa不等,平均分子量约为59 351 Da,等电点为5.04～6.45,甜瓜大部分AMS基因定位在细胞核;利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,在AMS基因的CDS区设计3个靶位点,分别是AMS-pHSN401-1、AMS-pHSN401-2和AMS-pHSN401-3。【结论】AMS基因主要被预测在细胞核中表达,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建...     

拟南芥抗盐突变体筛选中盐浓度的确定

将拟南芥种子播种于1/2 MS培养基上,竖直培养,待根生长至1.5~2.0 cm时,转入含有不同NaCl浓度的1/2 MS培养基上,倒置培养,观察各个盐浓度下根的生长情况。试验结果表明,在170、180、190 mmoL/L的NaCl浓度下,拟南芥的根生长虽然都表现出一定的延迟,但最终还能够生长;而在200 mmoL/L时,根生长完全受到抑制,最终白化死亡,由此确定其生长的临界盐浓度为200 mmoL/L。     

甜瓜种皮颜色控制基因CmSC1的精细定位及候选基因分析

[目的]通过对甜瓜种皮颜色进行遗传分析及基因精细定位,并推测其候选基因和开发特异分子标记,为下一步该基因的功能研究及合理利用奠定基础.[方法]利用白色种皮材料HP22和黄色种皮材料B8、B150分别配制杂交组合,获得后代遗传分离群体并进行种皮颜色的表型调查及遗传分析,通过基因图位克隆方法完成基因的精细定位.通过对定位区...     

拟南芥基因组NBS-LRR类基因家族的生物信息学分析

【研究目的】本研究对拟南芥（Arabidopsis thaliana）中含有核苷酸结合位点（Nucleotide binding site,NBS）和富含亮氨酸的重复序列（Leucine-rich repeat,LRR）类基因进行了分析。【方法】利用TAIR、Pfam网站,数据库和Chromosome Map Tool、MEGA 3.0、ClustalX软件,分析确定NBS-LRR基因及其类型、染色体物理分布、系统发育学关系。【结果】在拟南芥全基因组中共有204 个NBS-LRR 类基因,大多位于1号和5号染色体上,其中71.6%的NBS-LRR 类基因分布在基因簇内。对NBS-LRR 类基因家族进行了氨基酸多序列比对和系统进化树分析,NBS-LRR 类基因家族可分为四个亚家族。另外,NBS-LRR基因在进化过程中存在较多的复制现象。     

外源GO基因导入番茄后对叶霉病的抗性机制

【目的】研究转GO基因番茄的抗病机制。【方法】通过测定转GO基因番茄和对照未转基因番茄接种叶霉菌Fulvia fulva后，体内超氧物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性变化。【结果】接种后转基因番茄株系的SOD、POD、CAT活性均比对照明显增加，且转基因番茄的活性高峰比对照早。转基因番茄在接种后PAL和PPO活性都出现2个活性高峰，且第2个峰值比第1个高，而对照只有1个活性高峰,其总体水平明显低于转基因番茄。用番茄叶霉病（Fulvia fulva）病原菌1.2.3.4生理小种侵染T1代转基因植株。【结论】 结果显示转基因番茄植株的抗病性有不同程度的提高，多数发病时间推迟，病情明显减轻。     

不同生态型拟南芥FLC基因的序列分析

[目的]对拟南芥春化作用相关基因FLC的序列分析。[方法]先期经过对拟南芥自然群体的春化反应的QTL分析,发现拟南芥5号染色体上有一个与开花有关的QTL,本实验就是运用序列分析确定它与FLC基因是否具有同源性。[结果]意大利拟南芥与瑞典拟南芥在第27位、第461位、第501位、第638位、第738位、第884位碱基上不同。虽然这些碱基有所不同,但是密码子编码出来的第9个氨基酸、第167个氨基酸、第246个氨基酸,由于密码子的简并性,编码的蛋白质均相同。[结论]拟南芥具有丰富的遗传多样性,其FLC基因序列长度高度保守、碱基变异位点丰富密码子的简并性它们均编码同一种氨基酸对拟南芥生长没有影响。这表明拟南芥的基因序列会受到环境的影响。     

土壤农杆菌介导的转GST基因拟南芥的选育

将耐盐相关基因盐地碱蓬谷胱甘肽转移酶基因(Glutathione s—transferase，GST)克隆到表达栽体pROKⅡ中以构建植物表达栽体pGST，直接转化法转化土壤农杆菌，PCR验证后的阳性土壤农杆菌利用花序浸泡法转化拟南芥．转化子通过含有卡那霉素的培养基初步筛选，用PCR方法进一步验证外源基因插入到拟南芥基因组中．通过几代选育得到了稳定遗传的转基因拟南芥纯合品系．