侵染云南烟草的番茄斑萎病毒（TSWV）的RT-PCR检测

 番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus, TSWV）寄主广泛,危害多种作物,近年发现侵染烟草引起严重经济损失。研究该病毒的分子检测方法,对健康烟草种苗培育和指导病害防控具有重要意义。本文根据 TSWV核壳体蛋白基因(N基因)序列设计引物,用RT PCR方法对采于云南疑似番茄斑萎病毒症状的5个烟草病害标样（102,514,自10,自16,自58）进行检测,PCR产物连接pMD载体并测序。测序结果表明：这5种烟草病害分离物与已报道TSWV N基因核酸序列相似性大于9704%,所编码氨基酸序列的相似性达9767%以上。这说明获得的5种病毒分离物均属于TSWV。本研究建立了侵染云南烟草的番茄斑萎病毒（TSWV）的RT PCR检测方法。     

辣椒上TRV介导的番茄斑萎病毒N基因沉默体系构建及鉴定

【目的】研究番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt orthotospovirus,TSWV)核衣壳蛋白基因(N)对辣椒抗病性的影响。【方法】以易感TSWV的辣椒湘研11为研究对象,采用同源序列克隆获得辣椒CaPDS基因和TSWV N基因;利用烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)和病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术构建辣椒CaPDS基因沉默载体(pTRV2-CaPDS)和TSWV N基因沉默载体(pTRV2-N),农杆菌GV3101注射接种辣椒,通过qRT-PCR检测重组载体沉默效率。【结果】湘研11接种含pTRV2-CaPDS载体菌液3周后,新叶出现白化现象,说明辣椒上的pTRV2-CaPDS沉默载体构建成功。qRT-PCR结果表明:pTRV2-N载体可高效沉默N基因,其表达量仅为6.79%±2.56%,说明沉默N基因后,湘研11不易感染TSWV。【结论】本研究成功构建了pTRV2-N沉默载体,沉默TSWV的N基因后辣椒对入侵的TSWV产生一定的抗性。     

番茄斑萎病毒外壳蛋白原核表达及Dot blot ELISA检测方法的建立

     将番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus, TSWV)全长外壳蛋白基因亚克隆到原核表达载体pET-32a中,经限制性酶切分析及测序结果表明插入方向正确且阅读框架无移码突变.将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),SDS-PAGE分析结果证实IPTG可诱导1个分子量约为48 kDa的融合蛋白表达.利用6×His标签单抗和TSWV FoPaTs1多抗证实所表达的蛋白为TSWV外壳蛋白.以纯化的重组外壳蛋白免疫小鼠,制备杂交瘤细胞培养上清单抗,并用杂交瘤细胞培养液上清建立了可靠、有效检测TSWV的Dot-blot ELISA方法.     

水稻条纹病毒外壳蛋白自身互作的活性区段研究

水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)的外壳蛋白(coat protein,CP)参与病毒转录、复制等多个生物学过程。病毒蛋白之间的互作对病毒侵染活性非常重要,在明确RSV外壳蛋白CP能够自身互作的基础上,通过构建CP蛋白N端、M区段和C端(CP-N、CP-M和CP-C)的酵母表达载体,利用酵母双杂交系统确定外壳蛋白CP自身互作的活性区段。结果表明,N端和C端第1~81个氨基酸是参与水稻条纹病毒CP蛋白自身互作的活性区段。这一研究结果不仅有助于加深理解RSV CP蛋白在病毒基因组稳定、复制过程中的作用,也有助于加深了解RSV、寄主和传播介体之间关系。     

昆明番茄斑萎病毒不同分离物N基因遗传多样性分析

2009年至2011年对昆明地区番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)发生分布进行调查,并根据保守序列设计引物扩增得到21个TSWV昆明分离物S RNA 3’-末端长861nt的核苷酸序列,该序列包括N基因部分序列(710nt)。测序分析表明,所获得的21个TSWV昆明分离物N基因序列氨基酸同源性较高(97.5%～100%);构建系统进化树,昆明21个TSWV分离物与TSWV韩国分离物(TSWV-Korea)聚为1支;而在21个分离物中,鬼针草分离物与其它分离物聚为不同分支。     

禽偏肺病毒C型核衣壳N蛋白的哺乳动物细胞表达系统表达及鉴定

利用哺乳动物细胞表达系统对禽偏肺病毒C型核衣壳N蛋白进行表达,并检测所表达融合蛋白的抗原性。首先将N基因克隆到真核表达载体pEGFP-C1中,构建重组真核表达载体,然后将阳性重组质粒转染BHK-21细胞,通过倒置荧光显微镜和共聚焦显微镜检测N蛋白的表达,并用Western blot检测表达蛋白的抗原性。结果显示,禽偏肺病毒核衣壳N蛋白主要表达在细胞浆中,在转染后48h后表达量最高;与抗N蛋白抗体有抗原性,所表达核衣壳N融合蛋白大小为72kDa左右,与预期结果一致。结论,本试验成功应用哺乳动物表达系统表达了禽偏肺病毒C型核衣壳N蛋白,表达蛋白具有抗原性,为与禽偏肺病毒核衣壳N蛋白的相关研究奠定了基础。     

犬瘟热病毒N蛋白基因融合蛋白原核表达条件的优化与蛋白纯化

[目的]提高犬瘟热病毒N蛋白基因在大肠杆菌中表达可溶性GST融合蛋白的含量.[方法]研究诱导剂(IPTG)的最佳加入时间、诱导剂(IPTG)浓度、诱导时间以及不同温度条件对GST - CDV N融合蛋白表达的影响,获得在大肠杆菌中的最佳的表达条件,然后再在最佳条件下大量的表达,用GST - Sepharose 4B亲和层析柱对GST - CDV N融合蛋白进行纯化,得到最大量的可溶性融合蛋白,并对蛋白含量进行测定.[结果]大肠杆菌BL21 (DE3)转化菌在37℃培养3.5 h(OD600 =1.314)时,加入IPTG使终浓度为1 mmol/L,然后在27℃诱导8h,GST - CDV N融合蛋白可溶性表达量最高,达到0.862 mg/mL.[结论]确定了犬瘟热病毒N蛋白基因的优化表达条件,为犬瘟热病毒分子免疫学诊断和亚单位疫苗的研制奠定了基础.     

大麦黄矮病毒外壳蛋白基因和移动蛋白基因酵母表达载体的构建

根据已知的大麦黄矮病毒GPV株系的外壳蛋白(Coat protein,CP)和移动蛋白(Movement protein,MP)基因序列合成了CP和MP基因的上下游引物,通过PCR扩增获得目的片段,经过Sal I和Pst I双酶切、连接、转化、重组质粒的酶切鉴定及基因测序,构建了酵母表达载体pGBKT7-GPV-CP和pGBKT7-GPV-MP,用于在酵母双杂交分析中表达诱饵融合蛋白,为进一步筛选小麦cDNA文库内与大麦黄矮病毒互作的寄主因子和克隆寄主因子,以及其种类和功能打下坚实的基础.     

模块化质粒系统用于水稻条斑病菌基因表达的分析

水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)侵染水稻,引起细菌性条斑病(bacterial leaf streak,BLS)。近几年,在我国南方水稻产区,条斑病大面积发生,对水稻的安全生产构成严重威胁。为了准确地在Xoc中进行基因功能的分析,本研究设计出模块化的质粒系统,用于基因转录表达和蛋白表达的分析。为了验证该系统的可行性,选取hrpG、hrpX和hrpB1基因构建了相应的启动子载体和蛋白表达载体,将这些载体导入相应的hrp调控子基因trh、hrpG和hrpX的突变体中。GUS活性测定的结果显示,在XOM3培养基、寄主水稻组织和非寄主烟草组织中,启动子模块元件能够准确反映这3个hrp基因的调控表达模式。蛋白免疫杂交结果显示,HrpX蛋白表达水平反映的调控模式与hrpX启动子活性呈现的调控表达模式一致。水稻上致病性测定结果显示,有效表达的HrpG蛋白能够恢复hrpG突变体在寄主水稻上的致病性。这表明,这套模块化的载体系统能够有效应用于基因转录表达、蛋白表达和功能互补的分析。这将为Xoc-水稻互作研究提供有效的技术支持,加快Xoc毒性相关基因功能的研究。     

大麦黄矮病毒外壳蛋白基因和运动蛋白基因酵母表达载体的构建

根据已知的大麦黄矮病毒GPV株系的外壳蛋白（Coat Protein CP）和移动蛋白（Movement Protein MP）基因序列合成了CP、MP基因的上下游引物。通过PCR扩增获得含有目的基因的片段，经过SalⅠ和PstⅠ双酶切、连接、转化、重组质粒的酶切鉴定及基因测序，构建了酵母表达载体pGBKT7-GPV-CP和pGBKT7-GPV-MP，用于在酵母双杂交分析中表达诱饵融合蛋白，为进一步筛选小麦cDNA文库内与大麦黄矮病毒互作的寄主因子、克隆寄主因子、推测其种类和功能奠定了基础。     

苹果茎沟病毒外壳蛋白基因的克隆、表达及其生物信息学分析

从中国苹果寄主上分离苹果茎沟病毒(Apple Stem Grooving Virus,ASGV),克隆并表达外壳蛋白(Coat Protein, CP)基因,并进行生物信息学分析。利用RT-PCR从苹果寄主上克隆了苹果茎沟病毒外壳蛋白基因,序列测定后构建了原核表达载体pET30a(+),转化大肠杆菌(Escherichia coli)进行原核表达。分析比较苹果茎沟病毒外壳蛋白基因核酸序列,分析并预测苹果茎沟病毒外壳蛋白的结构和性质。克隆,表达了苹果茎沟病毒外壳蛋白基因。序列分析显示本研究ASGV CP开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)全长714个核苷酸,与其他分离物CP基因核酸同源率为88.80%～91.90%,与来自日本苹果的P-209进化关系最近。ASGV CP是由237个氨基酸残基组成的27.13 kD蛋白,等电点PI为7.67的疏水性,非跨膜蛋白。二级结构由7个α-螺旋,5个β-片层和无规则卷曲构成。三级结构由于缺少同源蛋白而无法预测。本研究成功诱导表达了ASGV-CP蛋白,分析了ASGV-CP的核酸序列和进化关系,蛋白性质和蛋白结构,为进一步的功能研究和检测应用奠定了基础。     

利用病毒诱导的基因沉默技术沉默TSWV的NSm基因

【目的】番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt orthotospovirus,TSWV)在全球范围内严重危害农业生产,病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术主要用于植物内源基因的功能研究,而其沉默植物外源病毒基因用于病毒防控鲜有报道。本研究利用VIGS技术在辣椒中沉默植物外源病毒TSWV的NSm基因,为辣椒产业防控TSWV病害奠定技术基础。【方法】以辣椒(Capsicum annuum L.)为研究材料,首先构建辣椒PDS基因的沉默载体pTRV2-PDS以评估该沉默载体在辣椒中的有效性,再构建TSWV NSm基因的沉默载体pTRV2-NSm评估该沉默载体对TSWV NSm基因的沉默效果。【结果】构建的沉默载体pTRV2-PDS在辣椒中有效,沉默载体pTRV2-NSm可以高效沉默TSWV的NSm基因,NSm的表达量仅为对照组的4.6%,且表现出对TSWV的抗性。【结论】构建的沉默载体pTRV2-NSm可以沉默TSWV的NSm基因,并使辣椒对TSWV产生一定的抗性。     

纤细病毒属病毒病害特异蛋白的研究进展

纤细病毒属的病害特异蛋白是由毒义链编码的非结构蛋白，由174－179个氨基酸组成。该蛋白的出现与病害症状密切相关。文章就近几年来对纤细病毒属病害特异性蛋白基因复制与表达及其在寄主体内的积累、血清学特性、同源分析等相关方面的研究进展进行综述。     

犬瘟热病毒N蛋白基因真核表达质粒的构建与瞬时表达

[目的]构建犬细小病毒(CPV) VP2基因真核表达质粒,为研究核酸疫苗奠定基础.[方法]参考GenBank中发表的CDV N蛋白基因序列设计引物,采用RT - PCR方法从疑似犬瘟热病犬全血样品中扩增CDV N蛋白基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+).经测序验证后,小白鼠尾静脉注射瞬时表达CDV N蛋白基因,8h取其肝脏提取总RNA,进行RT - PCR方法扩增.[结果]在病犬的全血样品中扩增得到1 572 bp的CDV N蛋白基因片段,并构建了真核表达质粒pcDNA3.1(+)- CDV N,从瞬时表达的小白鼠肝脏总RNA中可扩增到目的条带.[结论]构建了犬瘟热病毒N蛋白基因真核表达质粒,并在小白鼠体内进行了瞬时表达.     

番茄斑萎病毒属病毒S RNA序列比对

从生物信息数据库NCBI中搜索并下载最新有关番茄萎斑病毒属Tospovirus各种间S RNA片段全长序列以及该片段上NSs、N的核酸和蛋白质序列着手,运用DNAstar和DNAMAN以及NPSA等生物信息软件对其进行比对分析,结果发现,以NSs蛋白序列建立的系统进化树显示CCSV和TZSV之间的同源性为85.8%,IYSV和TYRV之间的同源性达90%,MYSV和PSMV间的同源性为97.5%;通过N蛋白序列分析显示,Tospovirus属中有7组同源性较高的种;在Tospovirus属病毒中非极性氨基酸含量最高,极性酸性氨基酸最少,比较TSWV中抗性破坏RB株系与普通株系在NSs、N核酸、蛋白质序列、氨基酸含量和蛋白质二级结构之间的差异,发现差异不显著.     

SARS病毒核蛋白基因的克隆、序列分析及其在E．coil中的高效表达

对SARS病毒核蛋白(N)基因进行了克隆和序列测定。根据GenBank中已发表的SARS全基因组序列，设计合成了1对特异性引物，对SARS病毒N蛋白基因进行了RT—PCR扩增。将PCR产物纯化后与pGEM—T连接得到重组质粒pGEM—N，进行核苷酸序列测定。结果该基因全长1269bp，编码422个氨基酸。与Tor2、Urbani和TW1株相比，核苷酸和推导的氨基酸序列的同源性均为100％。将pGEM—N双酶切．回收目的基因片段并克隆到大肠杆菌表达载体pE328a中，构建了重组质粒pET—N；将其转化表达菌BI21(DE3)用IPTG进行诱导表达。SDS—PAGE结果表明：重组菌可表达相对分子量约为53kD的蛋白。Westem—blotting证实，重组N蛋白可以与SARS免疫血清发生特异性反应。经凝胶薄层扫描分析，重组N蛋白表达量约占菌体蛋白的43％。     

猪流行性腹泻病毒安徽分离株N基因的克隆与表达

[目的]克隆和表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)的N基因。[方法]采用RT-PCR方法对PEDV FD株的N基因进行扩增,将扩增产物连接pET-28B载体,阳性质粒转入大肠杆菌BL21感受态细胞,诱导表达目的蛋白。[结果]PEDV FD株N基因序列全长为1 326个核苷酸,编码441个氨基酸;重组N蛋白为可溶性表达,大小约58 ku;Western blot检测结果表明,重组N蛋白与PEDV抗体阳性血清发生特异性反应。[结论]该试验制备的PEDV重组N蛋白具有较好的免疫原性,可用于PEDV诊断方法的开发及相关研究。     

犬瘟热病毒N和H蛋白拮抗IFN-β信号通路的研究

为研究犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)不同毒株N、H蛋白调控宿主β-干扰素(IFN-β)表达的作用,将CDV野毒株LN(10)1、SD(14)7和疫苗株CDV3感染提前转染了pGL3-IFN-β报告基因质粒和pRL-TK内参质粒的MDCK细胞,分别在感染0h、8h、12h和24 h后通...     

SARS病毒核蛋白基因的克隆、序列分析及其在E.coli中的高效表达

对SARS病毒核蛋白(N)基因进行了克隆和序列测定。根据GenBank中已发表的SARS全基因组序列,设计合成了1对特异性引物,对SARS病毒N蛋白基因进行了RT-PCR扩增。将PCR产物纯化后与pGEM-T连接得到重组质粒pGEM-N,进行核苷酸序列测定。结果该基因全长1269bp,编码422个氨基酸。与Tor2、Urbani和TW1株相比,核苷酸和推导的氨基酸序列的同源性均为100%。将pGEM-N双酶切,回收目的基因片段并克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中,构建了重组质粒pET-N;将其转化表达菌BL21(DE3)用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE结果表明:重组菌可表达相对分子量约为53kD的蛋白。Western-blotting证实,重组N蛋白可以与SARS免疫血清发生特异性反应。经凝胶薄层扫描分析,重组N蛋白表达量约占菌体蛋白的43%。     

几种水稻病毒非结构蛋白研究进展

对水稻病毒编码的病毒基质、管状蛋白、逆转录酶、基因沉默抑制子、核酸结合活性蛋白、转录调节功能蛋白6种非结构蛋白及其功能进行了介绍,为发现水稻病毒的潜在药物靶标以及研究病毒与寄主互作关系提供了参考。