澳洲坚果MiSTPP6基因克隆及低温胁迫下表达分析

【目的】克隆澳洲坚果丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶（PP1）家族基因（MiSTPP6）,并分析其不同组织及低温胁迫下的表达模式,为澳洲坚果PP1家族基因的抗寒分子机制提供理论依据。【方法】基于澳洲坚果转录组测序结果,利用RT-PCR技术克隆MiSTPP6基因,对其序列进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR检测其在不同组织及低温胁迫下的表达情况。【结果】从澳洲坚果中克隆获得MiSTPP6基因（GenBank登录号为MT374553）,其cDNA全长2129bp,最大的阅读框（ORF）长度为948bp,编码315个氨基酸残基,含有PP1蛋白家族的典型结构域（MPP_PP1_PPKL）和特征性序列（LRGNHE）。MiSTPP6蛋白为稳定的亲水性蛋白,以丝氨酸磷酸化为主,可能定位于细胞质,属于非分泌型蛋白或膜蛋白,与已知植物PP1蛋白的氨基酸序列具有很高的相似性。MiSTPP6蛋白的二级结构由α-螺旋(占40.00%)、无规则卷曲(占32.38%)、延伸链（占18.41%）和β-转角（占9.21%）,其三级结构与模板蛋白4v0u.1.A的结构相似度为80.60%,GMQE值为0.89。MiSTPP6基因在根、茎、叶、刚开放的小花和谢花后30~45d的小果中均有表达,其中,MiSTPP6基因在刚开放的小花中的相对表达量最高。4 ℃低温胁迫后0.5~24.0h,MiSTPP6基因在澳洲坚果苗期叶片中的相对表达量较对照明显下调,整体上呈持续下降的趋势。【结论】MiSTPP6属于PP1家族基因,具有组织表达特异性,可能在澳洲坚果抗寒分子机制中发挥重要的调控作用。     

耐盐杜梨蛋白磷酸酶基因PbPP2C的克隆及表达分析

2C型丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(PP2C)是植物体内脱落酸ABA信号传导关键负调控酶,在植物耐非生物胁迫中发挥着重要的作用。本研究利用RT-PCR技术,克隆出编码杜梨PP2C蛋白的基因Pb PP2C,其核苷酸序列全长1 353 bp,开放阅读框长1 263 bp,编码422个氨基酸残基,这些残基中包括了与二价金属离子结合的MED、DGH、DG和D结构域。系统发生分析结果表明,该氨基酸与拟南芥AHG3亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析结果表明:盐胁迫条件下,Pb PP2C基因在根、茎、叶中的表达12 h达到峰值,同时在根中72 h达到第二个峰值;干旱胁迫条件下,Pb PP2C基因在根、茎、叶中表达72 h达到峰值。说明Pb PP2C与杜梨耐盐和耐干旱胁迫存在紧密关联。     

黑灵芝免疫调节蛋白基因的克隆和生物信息学分析

黑灵芝(Ganoderma astum)是灵芝家族中一个重要成员,克隆和分析黑灵芝免疫调节蛋白基因,可为进一步了解真菌免疫调节蛋白在种群中的分布打下基础。以黑灵芝为材料,采用同源克隆方法,对真菌免疫调节蛋白(FIPs)基因进行PCR扩增,并对其核苷酸编码序列进行了生物信息学分析。结果表明:黑灵芝真菌免疫调节蛋白基因序列包含336bp,可编码111个氨基酸残基,命名为FIP-gas。FIP-gas分子量为12.4kD,理论等电点为4.80,符合FIPs的特性,是FIPs家族一新成员。对FIP-gas进行序列分析发现其氨基酸序列具有FIPs的保守序列模式,与紫灵芝(G.japoncium)、紫芝(G.sinensis)、小孢灵芝(G.microsporum)、赤灵芝(G.lucidum)、松杉灵芝(G.tsugae)、金针菇(Flammulina velutipes)及草菇(Volvariella volvacea)的FIP序列的同源性分别为99%、98%、87%、86%、86%、61%、55%。系统进化树分析表明黑灵芝的FIP与紫芝的FIP亲缘性最高,与金针菇和草菇的FIP亲缘性相对较远。该研究为进一步了解免疫调节蛋白在灵芝种群中的分布提供了较详细的数据。     

澳洲坚果MYB1基因克隆及生物信息学分析

[目的]从澳洲坚果(Macadamia integrifolia)叶片中克隆MYB1转录因子基因(MiMYB1)并进行生物信息学分析,为揭示R2R3-MYB家族转录因子成员在澳洲坚果中的抗逆作用机制提供参考依据.[方法]利用PCR从澳洲坚果品种桂热一号叶片中克隆MiMYB1基因,采用ProtParam、TMHMM Server v.2.0和SMART:Main page等在线分析软件对MiMYB1蛋白进行生物信息学分析,运用DNAMAN 7.0进行蛋白氨基酸多序列比对分析,并从NCBI中选取126个拟南芥R2R3-MYB家族成员,以Geneious Pro v4.8.4中的邻接法(Neighbor-joining,NJ)构建系统发育进化树.[结果]从澳洲坚果品种桂热一号叶片中克隆获得的MiMYB1基因序列全长1205 bp,包含1062 bp的开放阅读框(ORF),共编码353个氨基酸,GenBank登录号为MN254975.MiMYB1蛋白具有2个SANT保守结构域,属于R2R3-MYB家族,是无跨膜结构、无信号肽且定位于细胞核的不稳定亲水性蛋白.MiMYB1氨基酸序列(MN254975)与荷花NnMYB39氨基酸序列(XP_010277911.1)的亲缘关系最近,相似性为71.81%;与哥伦比亚锦葵HuMYB102-like(XP_021293847.1)、榴莲DzMYB102-like(XP_022777375.1)、木薯MeMYB102-like(XP_021596793.1)和高山栎QsMYB102-like(XP_023877052.1)的MYB氨基酸序列相似性分别为67.47%、68.63%、64.44%和67.28%.MiMYB1蛋白与126个拟南芥R2R3-MYB家族成员的系统发育进化分析结果显示,MiMYB1与AtMYB41的亲缘关系最近,与AtMYB41、AtMYB74和AtMYB102同属于S11亚族,具有相似的生物学功能,即与植物抗逆性功能相关.[结论]MiMYB1是典型的植物R2R3-MYB转录因子,在澳洲坚果的抗逆反应中发挥作用.     

澳洲坚果营养成分分析

对澳洲坚果的营养成分进行了分析.结果表明,澳洲坚果营养成分以粗脂肪为主,含量高达78.52％,其中大部分是不饱和脂肪酸,含量高达69.03％,同时还富含可溶性总糖、淀粉、蛋白质、氨基酸和Ca、Zn、Mg、Fe、Cu、Mn等矿质营养元素.     

板栗蛋白磷酸酶PP2A催化亚基基因的克隆与同源性分析

利用RACE技术从板栗雄花序中扩增得到1 347 bp的板栗蛋白磷酸酶2A的催化亚基(protein phospha-tase PP2A catalytic subunit,PP2Ac)cDNA片段。序列分析表明该片段包含基因的5′非翻译区4 bp,3′非翻译区407 bp,开放阅读框为936 bp,编码311个氨基酸,预计分子量为35.6 KD,等电点为5.94。基因序列数据库(GenBanK)登录为FJ840479(基因)和ACO57639(蛋白)。与葡萄、拟南芥、水稻等其他物种PP2Ac氨基酸序列相似性约为92%。     

西瓜半胱氨酸蛋白酶基因ClCP1克隆及其生物信息学分析

[目的]克隆西瓜半胱氨酸蛋白酶基因CICP2,并对其进行生物信息学分析。[方法]以西瓜花蕾cDNA为模板,借助西瓜全基因组数据库,采用RT—PCR方法对西瓜半胱氨酸蛋白酶基因进行克隆并进行生物信息学分析。[结果]克隆得到一个开放阅读框长度为960bp的序列,命名为C1CP1。该基因编码3t9个氨基酸。C1CP1基因的保守结构域分析结果表明,CICP1属于木瓜蛋白酶家族基因,与已知其他植物半胱氨酸蛋白酶在氨基酸序列上有56％～85％的相似性。聚类分析结果显示,C1CP1与同为葫芦科的黄瓜cP基因亲缘关系较近。[结论]CICP1属于西瓜木瓜蛋白酶家族新基因,为进一步研究西瓜半胱氨酸蛋白酶基因C1CP1的表达和功能奠定了基础。     

芙蓉李PsACO1基因的克隆与生物信息学分析

采用RT-PCR和RACE技术从芙蓉李分离得到1条长度为1 309bp的PsACO1基因cDNA全长序列。该基因包含长度为957bp的开放阅读框,编码319个氨基酸。PsACO1蛋白的分子量为36.24kD,等电点为5.28,含有9个ACO特有的保守结构域。系统进化分析结果表明PsACO1与碧桃、梅、枇杷、苹果和欧洲李的ACO蛋白的亲缘关系较近。     

澳洲坚果优良株系桂研1号选育初报

澳洲坚果优良株系桂研1号是从8# 编号自然杂交实生苗中选出 ,经无性繁殖而成。经多年观察 ,植株表现出结果性能好 ,果穗挂果数量多 ,果粒紧密呈串状 ,大小均匀 ,产量高。2003年8月14日 ,经有关专家验收 ,认为这一株系有发展前景。     

菠菜SpNHX1基因的克隆及生物信息学分析

从菠菜(Spinacia oleracea L.)栽培种中克隆得到1个NHX1基因,命名为SpNHX1。利用生物信息学软件对获得的基因核苷酸序列及编码的蛋白质序列进行分析,结果发现SpNHX1属于Vac亚家族,序列长度为6 090 bp,开放阅读框为1 662 bp,编码553个氨基酸残基。利用相关软件或在线工具对SpNHX1进行生物信息学分析,结果表明其编码蛋白分子式为C2 818H4 363N697O772S25,属于稳定的疏水性蛋白;进化树分析表明SpNHX1蛋白与拟南芥AtNHX1、AtNHX2亲缘关系较近,属于定位在液泡膜上的蛋白,SpNHX1蛋白与双子叶植物的NHX蛋白亲缘关系较近。     

牦牛CYGB基因CDS区克隆与生物信息学分析

【目的】丰富牦牛CYGB基因研究的基础数据,对牦牛CYGB基因的CDS区进行克隆和生物信息学分析。【方法】提取牦牛大脑海马区组织的总RNA并运用RT-PCR技术反转录为cDNA,并根据GenBank中普通牛CYGB基因cDNA序列（GenBank登录号：DV874786.1）,使用Primer3.0在线软件设计特异性引物,运用PCR扩增技术、TA克隆技术和核酸测序技术获得CYGB基因的完整CDS区序列及部分5′端和3′端UTR区,并使用ProtParam、PredictProtein、SWISS-MODEL等在线分析软件与Lasergene7.1软件包分析CYGB的一级结构、二级结构、三级结构与理化性质,并进行同源性分析及构建系统进化树;利用PyMol软件修饰并输出三维结构;使用在线亚细胞定位工具PSORT II Prediction预测蛋白质的亚细胞定位;使用Protfun软件对蛋白质的功能进行预测分析。【结果】克隆获得牦牛CYGB基因650 bp,包括CDS区573 bp(GenBank登录号：KF669898),碱基组成为A 20.59%、T 16.40%、G 33.33%、C 29.67%,编码190个氨基酸残基组成的蛋白质。与普通牛比对,牦牛CYGB基因在CDS区存在4个碱基突变,同源性为99.3%,这个突变未导致氨基酸序列的改变,4个突变均属同义突变。牦牛CYGB基因编码蛋白的分子式为C964H1513N263O278S7,分子量约为21.5 kD,理论等电点（pI）为6.32,消光系数为24075,不稳定系数为48.43,疏水指数为83.63,平均亲水性为-0.301,属不稳定可溶性酸性蛋白质,在哺乳动物网织红细胞内的半衰期为30 h。二级结构以α-螺旋和无规卷曲为主,其中α-螺旋占64.21%,无规卷曲占35.79%,属全α类蛋白质。三级结构是一个呈“three-over-three”三明治夹心型的α-螺旋折叠结构。亚细胞定位CYGB分布在细胞质(65.2%)、细胞核(17.4%)、线粒体(13.0%)、分泌系统的囊泡(4.3%)中,主要在细胞质,推测可能在能量代谢和辅因子的生物合成过程中发挥信号转导和转录因子调控的作用。牦牛CYGB氨基酸序列与普通牛、绵羊、家犬、小鼠、褐家鼠、原鸡、猴、黑猩猩、人的CYGB氨基酸序列的同源性分别为100%、98.9%、97.8%、95.3%、93.7%、78.8%、98.4%、95.8%和96.8%,物种之间同源性较高,系统进化情况与其亲缘关系远近一致,说明CYGB基因编码区在进化过程中比较保守。【结论】通过RT-PCR与TA克隆技术及核酸测序技术获得了牦牛CYGB基因全长573 bp的CDS区,并对其核苷酸序列和编码蛋白氨基酸序列及其蛋白结构和功能进行了分析,得知牦牛的CYGB是一个由190个氨基酸残基构成的可溶酸性蛋白质,在能量代谢和辅因子生物合成过程中发挥重要作用。CYGB基因编码区在长期生物进化过程中具有较强的保守性。该基因的成功克隆及分析为揭示牦牛CYGB基因的遗传特性提供了理论依据。     

花生谷氨酸脱氢酶基因AhGDH1的克隆与生物信息学分析

运用电子克隆技术获得花生1个谷氨酸脱氢酶基因cDNA序列,同时设计引物以花生cDNA为模板进行扩增,经测序得到证实,命名为AhGDH1,GenBank登录号:KT933119。采用生物信息学方法,对该基因编码蛋白从氨基酸组成、基本理化性质、亚细胞定位、跨膜结构域、信号肽导肽、二级结构和三级结构等方面进行了预测和分析。结果表明:该基因cDNA序列长度为1 713bp,包含1个1 236bp开放阅读框,编码411个氨基酸;该编码蛋白含有谷氨酸脱氢酶两个典型的保守结构域。同源比对分析显示,该基因编码的氨基酸序列与鹰嘴豆等植物的谷氨酸脱氢酶基因具有高度的相似性,进一步确定该蛋白为谷氨酸脱氢酶。     

猪IFIT1基因的克隆、生物信息学和组织表达分析

采用cDNA末端快速扩增(RACE)方法,对荣昌猪IFIT1基因进行克隆测序,利用生物信息学方法分析其结够和功能,并用Real-ti me PCR方法分析初生个体和1月龄个体11个不同组织(肺、心、肾、舌头、膀胱、卵巢、脾、肝、肌肉、胃和小肠)的表达情况.结果表明:IFIT1基因cDNA序列为1971 bp(GenBank登录号:HQ679904),包含5 UTR48 bp,全部CDS序列1437 bp和3 UTR487 bp,编码478个氨基酸,相对分子质量为55 232.9×103,等电点为6.18.其二级结构以α-螺旋和无归卷曲为主,三级结构具有典型的三角四肽和螺旋转角螺旋重复结构.荧光定量结果显示IFIT1表达量在初生个体和1月龄个体各组织间均存在着显著性差异(p<0.01),初生个体在脾脏中的表达量高于其它各组织(p<0.01),1月龄个体在肌肉中的表达量高于其它组织(p<0.01).     

白菜型油菜PDAT1基因的克隆及生物信息学分析

磷脂二酰甘油酰基转移酶(phospholipid:diacylglycerol acyltransferase 1,PDAT1)催化三酰甘油合成的最后一步反应,在生物质能源领域有良好的应用前景。本试验克隆得到白菜型油菜PDAT1的2条编码区序列,分别命名为BrPDAT1-1和BrPDAT1-2。BrPDAT1-1CDS全长2 007bp,编码668个氨基酸残基组成的肽链;BrPDAT1-2CDS全长1 794bp,编码597个氨基酸残基组成的肽链。生物信息学分析表明:BrPDAT1-1与AtPDAT1的相似度为91.08%,BrPDAT1-2与AtPDAT1的相似度为82.86%,两序列都编码一个无信号肽的亲水性稳定蛋白,跨膜结构域分析表明AtPDAT1和BrPDAT1-1都有1个跨膜结构域,而BrPDAT1-2无跨膜结构域。BrPDAT1-1和BrPDAT1-2蛋白序列均含有卵磷脂-胆固醇-酰基转移酶超家族保守结构域。     

黄独赤霉素受体基因DbGID1s克隆及生物信息学分析

【目的】克隆黄独赤霉素受体（GID1）基因DbGID1s,并对其进行生物学信息分析,为深入探究DbGID1s蛋白在黄独生长发育中的作用机制提供理论参考。【方法】采用RT-PCR技术克隆DbGID1s基因,利用生物信息学软件对其理化性质、结构域、磷酸化位点及系统发育进化进行预测分析。【结果】克隆获得4个DbGID1s基因序列,命名为DbGID1A、DbGID1B1、DbGID1B2和DbGID1C,GenBank登录号为MT648372、MT648374、MT648375和MT648373,长度分别为862、1273、1081和1164 bp,编码292、340、289和360个氨基酸残基。4个DbGID1s蛋白的分子量为32079.17~40301.83 Da,理论等电点（pI）为6.05~8.62,为不稳定的外在膜亲水性蛋白,不存在信号肽序列,其磷酸化位点主要以丝氨酸（Ser,S）为主,且4个蛋白的磷酸位点均有重合位点和突变位点,不仅具有α/β折叠水解酶超级家族羧酸脂肪酶水解活性区域,还具有激素脂肪酶（HSL）的保守结构域（HGG和GXSXG）和催化联合位点（S、D和H）。DbGID1s蛋白与其他植物GID1蛋白序列具有较高的氨基酸序列相似性,其中与山药的相似性达90%以上。【结论】DbGID1s基因具有多种植物GID1基因的基本特征,其编码的蛋白具有GID1蛋白典型的结构域,其可能参与赤霉素（GA）信号转导,调节黄独的生长发育。     

4种澳洲坚果品种主要性状对比研究

本文对引进的4种澳洲坚果makai(800)、keauhou(246)、kau(344)、Ikai-ka(333)开展种植性状研究,通过品种对比试验结果表明,澳洲坚果333品种3年的株高、冠幅、径粗等生长量最好,但与其他3个品种差异不显著(P0.05),说明对引进的4种澳洲坚果品种均能适应当地气候条件。澳洲坚果品种333的第3年平均带壳果鲜重最高,为0.211±0.016kg,并显著高于其他3个品种(P0.05)。4个澳洲坚果品种的出仁率在30.2%~34.3%,这与澳大利亚的水平基本相同,其中澳洲坚果品种333的果仁均重、出仁率均达到澳大利亚产区坚果的水平。     

星星草类萌发素蛋白基因(PutGLP2)的克隆及生物信息学分析

类萌发素蛋白是一类种子萌发相关的特异性标记,其在植物生物和非生物胁迫应答过程中起到了重要作用。本研究通过酵母cDNA文库筛选,获得全长为1 065 bp的PutGLP2基因,其5′非翻译区164 bp,开放读码框666 bp,编码221个氨基酸,3′非翻译区235 bp。利用PCR技术,克隆获得PutGLP2的ORF序列。生物信息学分析发现,PutGLP2在氨基端(N端)具有一个跨膜结构域及N端信号肽,预测定位于细胞壁或胞外间质。将PutGLP2与水稻的43种GLP蛋白进行聚类分析,发现PutGLP2属于类萌发素亚家族2成员之一,并与水稻OsGLP1-1相似性最高。本研究将为丰富植物类萌发素蛋白基因信息提供参考。     

澳洲坚果脂肪酸成分分析

采用气相色谱-质谱联用技术对澳洲坚果果仁中的脂肪酸进行分析。结果表明,澳洲坚果果仁有12种脂肪酸,主要有油酸、棕榈油酸、11-二十碳烯酸等不饱和脂肪酸(相对含量69.03%),棕榈酸、硬脂酸、花生酸等饱和脂肪酸(相对含量31.32%),其中油酸相对含量高达49.24%。该结果有助于对澳洲坚果的深入研究,促进其资源的充分利用。     

澳洲坚果脱皮机的研制与应用

采用挤压和碾磨相结合的原理,设计开发出澳洲坚果脱皮机,并通过试验检验其性能和脱皮效果.试验结果表明,通过合理的调节链条限位螺栓,对不同大小的澳洲坚果脱皮率可达90％以上,种子的完好率可达到92％以上.澳洲坚果脱皮机已成功投入了生产实践应用,与人工脱皮比较,该机器极大地提高了澳洲坚果加工的经济效益.     

澳洲坚果破壳技术研究进展与发展对策

澳洲坚果破壳一直是产品深加工中的关键环节。为此,文章主要介绍了澳洲坚果破壳作业发展历程和国内外对澳洲坚果破壳技术的研究现状,并重点围绕对历年来澳洲坚果破壳设备的发展历程以及破壳原理进行了概述,同时还针对澳洲坚果破壳技术的发展前景,提出相应的发展对策,旨在对澳洲坚果加工产业及进一步研究坚果破壳机械提供参考。