犬细小病毒VP2基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

根据GenBank上发表的犬细小病毒（CPV）VP2蛋白基因序列，设计并合成1对引物，通过PCR扩增VP2基因全长。将其克隆到pET一30a载体中，构建了原核表达载体pET—VP2，转化大肠杆菌Rosetta，表达并纯化了重组蛋白，Western—blotting证明该重组蛋白具有免疫原性。利用重组蛋白为抗原，通过方阵试验确定了包被抗原的最佳包被量为15．8ng／孔，血清的最佳稀释倍数为1：100，建立了检测CPV血清抗体的间接ELISA方法。     

羊种布鲁氏菌wzt基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

为建立检测血清中布鲁氏菌抗体的间接ELISA方法,本试验采用PCR技术从羊种布鲁氏菌QY1菌株中扩增得到wzt基因片段,连接到pET-30a载体上,构建质粒pET-30a-wzt,将鉴定正确的质粒转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞,经原核表达系统对其进行表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blotting进行分析后,用亲和层析镍柱纯化wzt重组蛋白备用。以wzt重组蛋白为检测抗原,逐步优化条件后建立布鲁氏菌间接ELISA检测方法。结果显示,试验成功构建了pET-30a-wzt原核表达载体,并在BL21（DE3）宿主菌中表达;SDS-PAGE和Western blotting结果表明,重组蛋白约为35 ku,表达形式为上清,条带单一、无杂带,有很好的反应原性和特异性。ELISA优化试验确定了最佳包被浓度为15 μg/mL,血清最佳稀释度为1：80,酶标抗体的最佳稀释度为1：5 000;通过检测24份阴性样品确定临界值,当样品D_{450 nm}值≥ 0.30为阳性,样品D_{450 nm}值<0.30时为阴性;特异性试验表明,该方法不与小肠耶尔森菌、大肠杆菌发生交叉反应;批内及批间变异系数均<10%;用该方法对120份血清样本进行检测,并与虎红凝集试验进行相符性验证,符合率为96%。本试验建立的间接ELISA方法为布鲁氏菌病的检测提供了可靠的技术手段。     

鹅源新城疫病毒F基因的原核表达及间接ELISA诊断方法的建立

参照GenBank公布的鹅源新城疫病毒NA-1株F基因(DQ659677)的核苷酸序列设计1对引物,通过PCR扩增F基因全长,将其克隆到pET-22b( )载体中,构建了原核表达载体pET-22b( )-F,转化大肠杆菌BL21(DE3),表达并纯化了重组蛋白,Western-blot证明该重组蛋白具有免疫原性。利用重组蛋白为包被抗原,通过方阵试验确定了包被抗原的最佳包被量为0.21μg/孔,建立了检测鹅源新城疫病毒抗体的间接ELISA诊断方法。     

布鲁菌Rev.1株eryA基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

通过对布鲁菌优势抗原eryA基因进行原核表达,在获得目的蛋白的基础上建立以该蛋白为包被抗原的间接ELISA方法。构建原核表达载体pET-30a-eryA,并将其转入大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达,镍柱亲和纯化eryA重组蛋白,SDS-PAGE 鉴定纯化蛋白,Western-Blotting检测反应原性后建立间接ELISA方法。反应条件优化后,抗原包被浓度为0.312 5 μg/mL,37 ℃包被2 h;封闭液为5%猪源明胶,37 ℃作用2 h;血清稀释度为1∶100,37 ℃作用1 h;酶标抗体稀释度为1∶8 000,37 ℃作用45 min。血清稀释度为1∶1 600时,仍然检测为阳性,证明建立的间接ELISA方法灵敏性良好;其他菌种及病毒经过特异性检测,均为阴性,证明建立的间接ELISA方法特异性良好;通过重复性检测,批间及批内变异系数均小于10%,证明建立的间接ELISA方法重复性良好。检测临床血清样品,建立的方法与试管凝集试验总符合率为95.7%,证明该方法可初步应用于临床诊断。     

隐孢子虫P23基因的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

将隐孢子虫鼠基因型（Cryptosporidium mouse genotype）P23基因亚克隆到pGEX-4T-1载体中,并用大肠杆菌BL21（DE3）为宿主菌诱导表达。以纯化的rP23为诊断抗原,建立隐孢子虫间接ELISA检测方法,观察其敏感性、特异性和重复性,并对临床血清样品进行检测。结果隐孢子虫鼠基因型P23基因在大肠杆菌中获得了高效表达,Western blot检测显示rP23能被隐孢子虫感染兔血清识别。以纯化rP23为诊断抗原,成功地建立了检测兔隐孢子虫病的间接ELISA技术。对23份临床血清检测结果显示,该方法检出率高于Sheather＇s蔗糖漂浮法、套式PCR法。本研究结果为研制兔隐孢子虫病诊断试剂盒打下了基础。     

BVDV E2蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

本试验克隆、表达了牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的E2蛋白,以表达纯化后的E2蛋白作为包被抗原,通过优化反应条件建立了间接ELISA检测法.确定该方法的阴阳判定临界值为0.33,抗原包被浓度为8μg/mL,一抗的最佳稀释度为1:100,10％PEG4000为最佳封闭液,酶标二抗最佳稀释度为1:6000.用建立的ELISA...     

O型口蹄疫病毒VP1基因的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

表达O型口蹄疫病毒VP1蛋白,用于O型口蹄疫病毒的检测.以质粒T234/FMDV为模板,PCR扩增VP1基因片段,构建重组质粒pET-41b/VP1,转化表达菌BL21(DE3),IPTG诱导,SDS-PAGE凝胶电泳和Western blot进行分析检测,目的蛋白经镍离子亲和层析纯化,以纯化的目的蛋白包被,建立了间接...     

纹皮蝇Hypodermin C基因原核表达及间接ELISA检测方法的建立

为建立牛皮蝇蛆病的抗体检测方法,本研究从纹皮蝇I期幼虫中提取总RNA,采用RT-PCR扩增了Hypodermin C(HC)基因.将该基因片段插入到原核表达载体pET-30a(+)中进行原核表达.获得了31ku以包涵体形式表达的重组HC蛋白.Western blot结果表明表达产物能够与阳性牛血清IgG特异性结合,具有良好的抗原活性.以纯化的重组HC作为包被抗原建立了牛皮蝇蛆病间接ELISA诊断方法,实验确定抗原最佳包被浓度为15.63 μg/mL,血清最佳稀释度为1:80,阳性标准判定为待检血清OD值＞0.256.所建立的诊断方法具有较好的特异性、敏感性和可重复性.应用该检测方法对230份临床血清进行检测,阳性率为20.6％.研究结果表明该间接ELISA方法是一种有效的牛皮蝇蛆病血清学检测方法.     

溶血性曼氏杆菌PCR检测方法的研究

溶血性曼氏杆菌是导致牛、羊呼吸道传染病的一种病原菌。为快速、准确诊断由本菌导致的疾病 ,从基因库中获得溶血性曼氏杆菌( M.haemolytica )的基因序列 ,再从其基因序列中获得与其它细菌包括 M.annheimiagranulomatis,M.varigena ,M.ruminalis,M.glucosidal ,M.annheimiaspp和多杀性巴氏杆菌等不同的基因片段 ,设计成引物 ,建立了特异性好、敏感性高的 M.haemolytica PCR检测方法。结果表明 ,除溶血性曼氏杆菌为阳性外 ,其余所有细菌均为阴性 ,特异性为 1 0 0 % ,最小检出量为 8× 1 0 2 cfu/ m L 曼氏杆菌或 1 / 1 0个单个菌落。检验人工感染牛 ,检出率为 75%。此PCR检测方法的建立 ,为 M.haemolytica提供了一个快速诊断方法     

PRV SD株gE基因主要抗原区域原核表达及间接ELISA方法的建立

参考猪伪狂犬病病毒(PRV)SD株g E基因序列,设计1对引物,通过PCR方法扩增一段包含g E主要抗原表位编码区的618 bp片段,将其用Bam HⅠ和Xho L I双酶切后,插入到原核表达载体pET-32a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),进行表达、SDS-PAGE电泳、Western-blot检测和纯化;利用表达的PRV SD g E蛋白进行g E-ELISA鉴别检测方法研究。结果发现:gE重组蛋白得到了高效表达,融合蛋白的分子量约为42ku;表达产物存在于上清液中,表达量可达菌体总蛋白的30%以上,并且能被PRV抗体所识别。将纯化后的g E蛋白作为抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗猪Ig G为二抗,建立检测PRV抗体的间接ELISA方法。结果显示:确定的抗原最佳包被浓度为36μg/m L,最佳包被时间为37℃、1 h并4℃过夜,待检血清(1:50稀释)37℃作用1 h,二抗(1:3 000)37℃作用1 h。重复性试验、交叉试验证明该方法重复性好、特异性强、灵敏度高。用g E-ELISA和IDEXX g E-ELISA同时对采集的92份猪血清进行平行检测,发现该方法的特异性为85.71%,敏感性为90.63%,二者符合率为89.13%。该方法为我国猪伪狂犬病的鉴别监测提供了一种可供选择的技术手段。     

鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白A原核表达及间接ELISA方法的建立和初步应用

为建立鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,以RA贵州分离株RAG06基因组为模板扩增并克隆鸭疫里默氏杆菌OmpA基因,构建pET32a-OmpA重组原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,重组菌经诱导、超声、纯化后,通过SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定获得OmpA重组蛋白大小约57 KD;以OmpA重组蛋白为包被抗原初步建立ELISA方法并优化,经多次方阵检测结果显示,OmpA蛋白以2.243 mg/mL的浓度进行包被,血清以1∶100稀释,抗原包被条件为4℃过夜、封闭条件为37℃120 min、血清反应时间为37℃60 min、酶标抗体工作浓度为1∶1000、酶标抗体反应时间为37℃60 min、显色时间为15 min为最佳条件。确定临界值为0.389。特异性试验表明RA阳性血清有较好反应外,其他血清均无明显反应。批内变异系数2.77%～8.00%,批间变异系数为1.10%～7.80%。当阳性血清稀释比例为1∶1600时,仍可判断为阳性,敏感性较高。应用该方法检测贵州...     

牛白血病病毒env(gp51)基因的克隆和原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

从持续感染牛白血病病毒（BLV）的羊胎肾细胞（FLK-BLV）中提取前病毒DNA,用PCR方法扩增编码牛白血病病毒gp51蛋白的env（gp51）基因,序列测定结果表明扩增片段全长828 bp。将扩增基因插入原核表达载体pET-32a构建pET-32a-gp51重组质粒,转化BL21（DE3）进行诱导表达,SDS-PAGE电泳结果表明重组融合蛋白大小约为43 000,Western-blot结果表明重组表达蛋白具有免疫反应性。以纯化的重组蛋白gp51作为抗原,建立检测BLV抗体的间接ELISA诊断方法。结果表明,抗原gp51的最佳包被浓度为2.19μg.mL^-1,血清的最佳稀释倍数为1∶80,阳性判定标准确定为样品OD450 nm大于0.451。用该方法对12份参考血清进行检测,准确率为91.67%。     

水貂肠炎病毒VP2基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

为了对水貂肠炎病毒(MEV)疫苗免疫后抗体水平的监测和疫苗免疫效力的评价,本研究在分析MEV VP2蛋白抗原性的基础上,设计1对特异性引物克隆VP2蛋白抗原性较好的基因片段,将克隆的基因片段定向插入到pProEXHTb原核表达载体中,构建了VP2基因原核表达重组质粒pProEXHTb-VP2A,并实现在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达,经鉴定表达的重组蛋白以包涵体形式存在,免疫印迹试验表明获得的重组蛋白具有与抗体较好的反应原性.应用His-Bind亲和层析柱纯化重组蛋白VP2A,以纯化后的重组蛋白作为ELISA诊断抗原,并对反应条件进行优化,初步建立了检测MEV抗体的VP2A-ELISA方法.确定了抗原最佳包被浓度为9.65 μg/mL,血清最佳稀释倍数为1:10.判定标准为S/P值≥0.312为阳性,S/P值≤0.243为阴性,介于两者之间为疑似.该抗原不与犬瘟热病毒、阿留申病毒阳性血清反应,具有良好的特异性.采用VP2A-ELISA对180份水貂血清样品进行检测,结果显示VP2A-ELISA与HI试验的符合率达到87.8%,表明建立的间接ELISA方法具有较高的敏感性和特异性,为现地免疫貂群抗体检测和MEV流行病学调查提供了一种简便的血清学诊断方法.     

非洲猪瘟病毒p30基因的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测血清中非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）抗体的间接ELISA方法,本试验将ASFV p30基因进行原核表达,采用SDS-PAGE和Western blotting方法对重组蛋白进行表达鉴定和免疫原性分析,随后以纯化的重组蛋白为包被抗原,经条件优化、特异性试验、敏感性试验和重复性试验,建立一种血清中ASFV抗体的检测方法。结果显示,ASFV p30基因成功克隆到原核表达载体pET-32a （+）中,获得pET-32a-p30重组质粒;转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞进行诱导表达,得到P30重组蛋白,重组蛋白大小约为42 ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果显示,纯化后的蛋白具有良好的免疫原性;以纯化的P30重组蛋白为包被抗原,建立了检测ASFV抗体的间接ELISA方法,通过方阵试验对间接ELISA方法进行优化,最终确定了抗原最佳包被浓度为1.2 μg/mL,待检血清最佳稀释倍数为1：100,最佳封闭液为1% BSA,酶标抗体最佳稀释度为1：4 000,以此建立的ASFV间接ELISA方法临界值为0.322。本方法仅与ASFV阳性血清发生特异性反应,与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型及猪流行性腹泻病毒阳性血清均无交叉反应,具有较强的特异性。该方法检测ASFV阳性血清灵敏度可达到1：1 600;批内重复性和批间重复性变异系数均<10%。本试验建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、灵敏度和重复性,可初步应用于ASFV抗体的检测。     

口蹄疫病毒2C3AB基因的原核表达及ELISA方法的建立

口蹄疫病毒(FMDV)的2C蛋白中存在对自然感染和灭活疫苗免疫动物具有鉴别诊断意义的抗原表位。为建立一种敏感的血清学鉴别诊断方法,本研究截取FMDV 2C蛋白的C端B细胞表位较为富集的区域与全长3AB基因组合,经原核表达获得分子量约为44 ku的目的蛋白。Western blot分析表明,表达产物2C3AB与FMDV感染动物的阳性血清呈特异性反应。以纯化的目的蛋白作为包被抗原建立间接ELISA方法,敏感性检测表明该方法比3ABC-ELISA具有更高的敏感性;同时检测猪圆环病毒、猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒、猪瘟病毒标准阳性血清均无交叉反应。批内和批间重复性试验显示,OD450nm值的变异系数小于9%。采用该方法检测不同背景的临床样品,并与3ABC-ELISA及进口试剂盒比较,总符合率分别为98.5%和90%。结果表明,该ELISA检测方法具有更高的敏感性和良好的特异性、重复性。     

溶血性曼氏杆菌PCR检测试剂盒的研制及初步应用

在溶血性曼氏杆菌PCR检测方法研究的基础上,进行溶血性曼氏杆菌PCR检测试剂盒的研究及初步应用.结果表明,试剂盒特异性好,批内和批间的试剂盒无差异;试剂盒在-20℃可保存30个月,4℃可保存12个月;应用试剂盒从1000多份临床样品中筛选分离到6株溶血性曼氏杆菌.     

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的原核表达及抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立检测牛病毒性腹泻病毒抗体的间接ELISA检测方法,利用大肠杆菌表达系统成功表达E2蛋白并纯化,利用纯化后的蛋白作为包被抗原,用方阵法对影响ELISA试验的各个因素进行优化,并进行特异性、敏感性和重复性试验。确定E2抗原最佳包被浓度为1μg/mL,最佳血清稀释度为1∶40,最佳封闭液为1%明胶,最佳血清作用方式为37℃作用30 min,酶标抗体的最佳作用方式为1∶2000稀释、37℃作用30 min;最佳底物作用时间为室温20 min,阳性临界值为OD_450nm≥0.255。与血清中和试验和商品化试剂盒进行比较,总符合率分别为98%和96%,批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%。该方法与其它常见牛病毒阳性血清均无交叉反应。本研究成功建立了间接ELISA方法,为进一步用于大批量牛血清样本的抗体检测和流行病学研究奠定了基础。     

鸭瘟病毒胸苷激酶基因的原核表达及其蛋白间接ELISA检测方法的建立

本研究旨在以表达纯化的鸭瘟病毒胸苷激酶(thymidine kinase,TK)重组蛋白作为包被抗原,建立检测鸭瘟病毒抗体的间接ELISA方法。根据GenBank上收录的鸭瘟病毒TK基因序列设计出1对引物,采用PCR扩增出鸭瘟病毒TK基因。将TK基因与原核表达载体pET-32a连接,通过PCR、双酶切和测序鉴定,将阳性重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)工程菌,IPTG诱导表达。采用切胶纯化的方法纯化蛋白,Western blotting分析鉴定表达产物。用纯化的TK重组蛋白作为包被抗原,并优化其他条件,最终建立检测鸭瘟病毒抗体的间接ELISA方法。结果显示,重组质粒构建成功,经Western blotting检测得到目的蛋白,TK重组蛋白能被阳性血清识别,说明该重组蛋白具有较好的抗原性。确定了最佳反应条件:酶标二抗的最佳稀释度为1:200,最佳抗原、抗体的稀释度分别为1:400和1:200,抗原抗体作用时间为60 min,最佳封闭液为5% BSA,最佳封闭时间为60 min,最佳显色时间为10 min。结果表明,该方法具有良好的稳定性及较高的敏感性,为鸭瘟的检疫、监测和防制工作提供了一种有效的手段。