猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白多克隆抗体的制备及其中和活性研究

为了制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)N蛋白鼠源多克隆抗体并验证其中和活性,试验采用RT-PCR方法扩增了PRRSV的ORF7基因,将其克隆至原核表达载体pET-32a中,并在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中表达重组N蛋白,纯化重组N蛋白制成弗氏佐剂抗原,采用皮下多点注射法免疫Balb/c小鼠,经3次免疫后获得多克隆抗体,用间接ELISA法检测抗体效价,以血清中和试验和间接免疫荧光法验证其中和活性。结果表明:试验成功扩增了大小为390 bp的ORF7基因片段,经双酶切和序列测定,重组表达质粒pET-32a-N构建成功,重组N蛋白分子质量约为28.0 ku,制备的多克隆抗体效价较高,重组N蛋白多克隆抗体按照1∶2、1∶4和1∶8比例稀释时,荧光数量与不加多克隆抗体时比较无明显区别。说明在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中成功表达了PRRSV重组N蛋白,制备的鼠源多克隆抗体能够与重组N蛋白发生特异性反应,但没有抗PRRSV中和活性。     

TGEV S基因原核表达及表达蛋白间接ELISA方法的建立与初步应用

为了建立检测猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA),试验参照GenBank公布的TGEV TH-98株S基因序列,设计合成1对引物,RT-PCR扩增相应的核苷酸片段。将PCR扩增产物连接至原核表达载体pET-32a中,以大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞为表达菌株进行诱导表达。再以纯化重组蛋白作为诊断抗原,通过探索最佳抗原包被量和抗体血清稀释倍数等参数建立检测TGEV S蛋白抗体的间接ELISA方法。结果表明:试验成功克隆了TGEV S基因,扩增片段长度为4 003 bp;构建了重组表达质粒pET-S,并在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中获得高效表达,表达蛋白分子质量约为148 ku;经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及Western-blot分析显示,重组蛋白具有良好的抗原性;以纯化的S重组蛋白作为包被抗原,建立了TGEV S蛋白抗体检测间接ELISA方法;该ELISA方法的抗原最佳包被浓度为18.85μg/mL,最适血清稀释比例为1∶40。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp9蛋白多克隆抗体的制备及其中和活性研究

为了制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)Nsp9蛋白鼠源多克隆抗体并检验其中和活性,试验采用RT-PCR方法扩增了PRRSV的Nsp9基因保守区域片段,将其克隆至原核表达载体pET-28a中,并在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中表达重组Nsp9蛋白;纯化后的重组Nsp9蛋白与弗氏佐剂充分混合乳化,采用皮下多点注射免疫Balb/c小鼠,经3次免疫后获得多克隆抗体;用间接ELISA法检测抗体效价,以血清中和试验和间接免疫荧光试验检验其中和活性。结果表明:试验成功扩增了大小为951 bp的Nsp9基因片段,经双酶切和序列测定,重组表达质粒pET-28a-Nsp9构建成功;重组Nsp9蛋白的分子质量约为36.0 ku;制备的多克隆抗体效价较高,重组Nsp9蛋白多克隆抗体经2～8倍倍比稀释时,与PBS对照相比荧光数量递增。说明在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中成功表达了PRRSV重组Nsp9蛋白,制备的鼠源多克隆抗体有一定的抗PRRSV中和活性。     

猪伪狂犬病病毒EP0蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

为了对猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)EP0蛋白进行原核表达并制备其多克隆抗体,试验以PRV HeN1毒株为模板,构建了EP0基因原核重组质粒pET28a-EP0,经测序鉴定后,将pET28a-EP0重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中以表达重组蛋白His-EP0;确认重组蛋白His-EP0表达后,用Ni-NTA柱纯化重组蛋白,并用纯化的重组蛋白免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,进行Western-blot测定,用间接ELISA法测定多克隆抗体效价,用间接免疫荧光法测定多克隆抗体的特异性。结果表明：EP0蛋白原核表达成功,His-EP0蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中以可溶性蛋白形式表达,大小在55～70 ku之间;EP0蛋白多克隆抗体制备成功,抗体效价在1∶160 000以上,且能与表达的重组蛋白His-EP0及PRV感染的细胞发生特异性反应。说明试验成功表达了EP0蛋白,并成功制备了EP0蛋白多克隆抗体,抗体效价可达到1∶160 000以上,且特异性较好。     

犬瘟热病毒N基因原核表达及多克隆抗体的制备

采用PCR方法扩增犬瘟热病毒N基因,将其克隆至原核表达载体p ET-32a(+)中,构建犬瘟热N基因原核表达重组质粒,然后转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达重组N蛋白。从包涵体中纯化重组蛋白,制备多克隆抗体,采用Western blot检测其特异性。结果显示PCR扩增得到犬瘟热N基因,重组N蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中得到表达,制备的多克隆抗体能与N蛋白特异性反应。     

禽网状内皮组织增生症病毒CA蛋白的表达纯化及多克隆抗体制备

根据禽网状内皮组织增生症病毒(REV)DBYR1102株的前病毒基因组c DNA序列设计并合成1对引物,以p T-G质粒为模板,通过PCR扩增获得该病毒CA基因片段。将其克隆于pET-30a(+)中,构建原核表达质粒pET30a-CA。重组质粒经双酶切和测序鉴定,转化BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS-PAGE鉴定蛋白表达情况。利用Ni-NTA His Bind Resin纯化重组蛋白,并经蔗糖浓缩,Western blot法检测重组蛋白的反应原性。纯化后的目的蛋白免疫新西兰白兔,制备兔抗CA多克隆抗体并对其进行鉴定。结果表明构建的重组质粒pET-30a-CA在大肠杆菌BL21中呈可溶性高效表达。经Ni柱纯化和蔗糖浓缩后得到纯度较高的融合蛋白,以纯化的融合蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,抗体效价达1∶25 600。该研究为REV的检测及CA基因的深入研究奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒S蛋白原核表达及多克隆抗体的制备与鉴定

【目的】探索猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)S蛋白的结构和功能,为建立PEDV感染的诊断方法和疫苗开发提供理论依据。【方法】以PEDV经典CV777株为模板,通过PCR扩增获得S、S1基因片段;PCR扩增产物分别克隆pET-30a(+)原核表达载体和pFLAG-CMV-3真核表达载体,构建原核表达质粒pET-30a-PEDV-S和真核表达质粒pFLAG-CMV-3-PEDV-S1;将pET-30a-PEDV-S转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达PEDV-S重组蛋白,通过变性、复性、浓缩纯化重组蛋白并进行Western blotting检测;将PEDV-S重组蛋白免疫C57BL小鼠制备多克隆抗体,获得的多克隆抗体经间接免疫荧光试验(IFA)检测特异性,通过间接ELISA法检测多克隆抗体效价;将pFLAG-CMV-3-PEDV-S1转染至HEK293T细胞,以制备的多克隆抗体为一抗,经IFA测定PEDV-S1蛋白的抗原性和多克隆抗体的反应性。【结果】成功克隆出PEDV S和S1基因,构建了可表达PEDV-...     

补体C9分子原核表达与多克隆抗体的制备

通过大肠杆菌表达系统表达补体C9重组蛋白,并制备其多克隆抗体,用于检测沉积菌体表面的补体C9分子;方法:通过PCR以兔肝细胞cDNA文库为模板扩增获得补体C9部分基因,并将其克隆至原核表达载体pEASY.-Blunt E1,经测序鉴定成功获得重组质粒pBlunt-C9。将其转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中,经IPTG诱导,Ni-NTA亲和层析柱纯化后,获得重组蛋白。将纯化的重组蛋白免疫BALB/c雌鼠,制备抗C9的鼠源多克隆抗体。结果显示,ELISA测得鼠抗C9多克隆抗体效价为1∶12800,Western Blotting表明,制备的多克隆抗体可以特异性识别沉积在金黄色葡萄球菌和链球菌表面的C9分子,为进一步研究补体的生物学功能以及巩膜复合体(MAC)抗细菌感染机制奠定了基础。     

牛病毒性腹泻病毒衣壳蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

试验旨在通过原核表达获得牛病毒性腹泻病毒(BVDV)衣壳蛋白(C),以制备抗C蛋白多克隆抗体。根据BVDV C蛋白的编码序列设计一对特异性引物,利用PCR扩增编码BVDV C蛋白片段,定向插pPET-42a载体中,转化大肠杆菌BL21 Rosetta (DE3) pLysS感受态细胞,筛选重组阳性菌株,IPTG诱导表达,金属离子层析法纯化得到分子质量为45 kDa的重组C蛋白。利用纯化的重组C蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,间接ELISA检测多克隆抗体效价达到1∶25 600。经间接免疫荧光证实制备的多克隆抗体可与细胞中的BVDV抗原发生反应,具有良好的反应性。本研究成功制备了BVDV重组C蛋白的兔源多克隆抗体,为BVDV衣壳蛋白功能的研究奠定了基础。     

羊传染性脓疱病毒122蛋白的原核表达纯化及多克隆抗体的制备

以提取的羊传染性脓疱病毒(ORFV)基因组为模版,PCR扩增ORFV122基因,并将该基因连接至原核表达载体pET-28a上,构建出pET-28a-122重组表达质粒。然后将该重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态,经IPTG诱导后成功表达出ORFV122蛋白。利用His标签可与镍离子结合的特性对ORFV122蛋白进行分离纯化。将纯化后的ORFV122蛋白免疫BALB/c小鼠,制备相应的多克隆抗体,并利用Western blot技术检测该抗体的特异性。免疫小鼠获得的抗ORFV122蛋白多克隆抗体经ELISA检测,其效价约为1∶80 000。此外,使用该抗体对ORFV122蛋白的表达规律进行了研究,发现ORFV122蛋白为早期表达蛋白。本试验获得的ORFV122蛋白多克隆抗体为以后ORFV122基因功能的后续研究奠定基础。     

家兔Ⅰ型肽载体(PepTⅠ)基因的克隆与原核表达

用real-time PCR方法扩增家兔PepTⅠmRNA序列,通过原核表达体外获得家兔PepTⅠ蛋白,旨在制备多克隆抗体。试验通过RT-PCR方法成功扩增出2 001bp的家兔PepTI基因片段,设计特异性引物成功扩增出抗原表位相对集中的1 071bp大小的片段,构建重组表达质粒,获得融合蛋白。结果显示:家兔PepTⅠ基因片段成功的连接到pMD18-T载体上,重组克隆载体双酶切后回收目的片段分别连接到原核表达载体pET-32a、pET-28a,经转化提取质粒测序验证后表明,成功构建原核表达载体pET-32a-P、pET-28a-P,将重组质粒转化至感受态细胞BL21(DE3)后IPTG诱导,成功表达出PepTⅠ融合蛋白,目的蛋白相对分子质量大小约为44 000,与预期试验结果相符。结果表明:本试验成功扩增出家兔PepTⅠmRNA序列,并且通过原核表达获得家兔PepTI融合蛋白。     

非洲猪瘟病毒B438L蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

本研究旨在通过构建非洲猪瘟病毒（ASFV）B438L基因原核表达系统表达p49重组蛋白,并制备抗p49蛋白的多克隆抗体。根据ASFV Georgia 2007/1（GenBank登录号：FR682468.1）公布的基因序列合成B438L基因,并将其插入pET-28a （+）载体,构建pET-28a-B438L重组质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,在16 ℃经1 mmol/L IPTG诱导12 h,通过SDS-PAGE对重组蛋白表达形式进行分析;利用串联质谱技术鉴定重组蛋白是否正确表达;将纯化的p49重组蛋白免疫小鼠制备鼠源抗p49多克隆抗体,利用间接ELISA方法测定该多克隆抗体的效价,并以间接免疫荧光试验及Western blotting检测该多克隆抗体的特异性。结果显示,试验成功构建了pET-28a-B438L重组质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞后经诱导表达获得了p49重组蛋白,重组蛋白主要以包涵体形式表达,大小约为60 ku;串联质谱技术进一步证实该蛋白为p49。间接ELISA检测制备的鼠源抗p49多克隆抗体效价达1：64 000,间接免疫荧光试验及Western blotting结果表明制备的鼠源抗p49多克隆抗体能特异性识别p49蛋白。以上结果表明,该原核表达的ASFV p49重组蛋白具有良好的免疫原性,利用表达的p49重组蛋白制备的多克隆抗体具有较高的抗体效价和特异性,为进一步研究ASFV p49蛋白的结构与功能、研制相关的ASFV诊断试剂及疫苗提供了生物材料。     

猪SIgA分泌片的表达及其多克隆抗体的制备

SIgA是评价黏膜免疫的重要指标,分泌片(SC)是SIgA的特有成分,为了更方便的获得大量的SIgA的分泌片,本研究应用RT-PCR方法扩增出SC基因片段,将SC基因片段克隆到pGEX-4T-1原核表达载体上,经酶切和测序验证获得pGEX-4T-1-SC重组质粒;将获得的pGEX-4T-1-SC转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达重组蛋白rSC.重组蛋白rSC经鉴定和纯化后,按常规免疫程序制备多克隆抗体;利用Western blot对抗重组蛋白rSC的多克隆抗体进行鉴定.结果显示,该抗体能特异性识别猪初乳中的SIgA免疫球蛋白,而与猪初乳中的IgG不发生反应.因此,抗SC重组蛋白的多克隆抗体可以作为抗SIgA免疫球蛋白的特异性抗体,为进一步建立SIgA的检测方法及黏膜免疫的研究奠定基础.     

塞尼卡病毒VP1与VP3蛋白原核表达及蛋白纯化

利用原核表达系统表达塞尼卡病毒(Seneca Valley virus,SVV)VP1与VP3蛋白,优化其诱导表达条件,并进行蛋白纯化研究。扩增SVV VP1与VP3目的基因,并分别将VP1、VP3克隆至pET32a(+)载体,构建pET32a-VP1与pET32a-VP3重组质粒,将两者分别转化至BL21(DE3)大肠杆菌,经IPTG诱导表达。优化蛋白表达条件,利用His标签镍离子蛋白纯化柱纯化蛋白。RT-PCR结果显示可扩增出792 bp SVV VP1与717 bp VP3目的片段,将VP1与VP3目的基因成功克隆至pET32a(+)载体,分别转化至BL21(DE3),成功地表达50 000 pET32a-VP1重组蛋白以及48 000 pET32a-VP3重组蛋白;pET32a-VP1及pET32a-VP3重组蛋白均在条件为37℃、0.6 mmol/L诱导剂诱导5 h表达量最高,重组蛋白均以包涵体的形式进行表达并且可纯化出目的蛋白。结果表明,本试验成功地利用原核表达系统表达并纯化SVV VP1与VP3重组蛋白,为制备单克隆与多克隆抗体、检测试剂盒研发以及新型疫苗的研发奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒N蛋白的原核表达与鉴定

为了制备猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）N蛋白,通过PCR扩增获得PEDV的N基因片段与载体pET-32a（+）相连构建原核表达载体pET-32a（+）-PEDV-N。将构建成功的质粒转化到BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG（1 mmol/mL）37℃诱导表达后,采用SDS-PAGE检测重组蛋白的表达情况,对影响重组蛋白表达的诱导时间进行分析。利用Western blot方法分别检测重组蛋白的免疫原性。结果表明：PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳检测发现条带位置正确,重组质粒pET-32a（+）-PEDV-N测序正确,含有重组质粒pET-32a（+）-PEDV-N的表达菌株BL21（DE3）在诱导表达后,经SDS-PAGE检测证明有重组蛋白表达,利用Western blot结果表明该重组蛋白与PEDV多克隆抗体发生特异性反应,说明成功制备了PEDV-N重组蛋白。     

结核分枝杆菌rv3036c基因的原核表达及其多克隆抗体的制备

为制备结核分枝杆菌(Mtb) rv3036c基因的多克隆抗体,本研究以Mtb强毒株H37Rv基因组DNA为模板,扩增rv3036c基因,克隆至表达载体pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-rv3036c,并转化大肠杆菌BL21(DE3),经1 mmol/L IPTG诱导表达组氨酸标签融合蛋白Rv3036c,采用Ni-NTA His-Bind Resin纯化目的蛋白,经western blot验证纯化蛋白.将Rv3036c蛋白纯化产物免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体.SDS-PAGE和western blot分析结果表明,Rv3036c以可溶形式表达,蛋白分子量大小为28 ku,并且具有良好的免疫原性.以上结果为进一步研究rv3036c基因在Mtb的致病性作用奠定了基础.     

猪细小病毒6型ORF2基因的截短表达及多克隆抗体制备

【目的】原核截短表达猪细小病毒6型(Porcine parvovirus type 6,PPV6)ORF2基因,并制备PPV6 VP1₍(348 aa-675 aa))蛋白多克隆抗体,为后续研究该蛋白的生物学功能提供材料。【方法】以PPV6分离毒株基因组为模板,PCR扩增获得ORF2截短基因片段,将其克隆至原核表达载体pET30a(+)中构建重组质粒pET30a-PPV6-ORF2。经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,Ni-NTA树脂亲和层析纯化,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定纯化后重组蛋白。将纯化后的重组蛋白与弗氏佐剂混匀乳化,免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体,采用Western blotting、间接免疫荧光试验(IFA)和间接ELISA鉴定免疫兔血清特异性。【结果】成功构建了pET30a-PPV6-ORF2重组表达载体,原核截短表达了PPV6 VP1₍(348 aa-675 aa))蛋白;SDS-PAGE结果显示,重组PPV6 VP1₍     

鸡plgR多克隆抗体的制备及初步鉴定

根据GenBank中鸡pIgR基因序列和蛋白序列,设计引物,利用PCR技术扩增胞外配体结合区片段,构建原核重组表达质粒pET-32a(+)/pIgR,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG的诱导表达融合蛋白,通过镍离子螯合柱纯化后免疫新西兰大白兔,获得兔抗鸡pIgR多克隆抗体,通过酶联免疫吸附试验(ELISA法)和Western Blot法检测抗体的效价和特异性。结果显示,成功制备特异性的鸡pIgR抗体,为研究鸡pIgR的功能提供有力依据。     

H9N2亚型禽流感病毒NP蛋白原核表达及多克隆抗体制备

【目的】对华南地区分离到的1株H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)流行株NP蛋白进行原核表达,制备H9N2亚型AIV NP蛋白多克隆抗体。【方法】将1株H9N2亚型AIV的NP基因克隆至pET-32a(+)原核表达载体,构建NP蛋白原核表达质粒。将重组质粒同时转化大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达重组蛋白。通过考马斯亮蓝染色和Western blotting分析并比较NP蛋白在两种表达菌中的表达量,进一步优化诱导剂浓度、诱导时间及诱导温度等条件,提高蛋白的表达效率。采用镍柱亲和层析法对NP蛋白进行纯化,用BCA法测定蛋白浓度。以纯化的NP蛋白免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,通过Western blotting和间接免疫荧光对所制备的多克隆抗体进行鉴定,通过间接ELISA测定抗体效价。【结果】试验成功构建pET-32a-H9N2-NP原核表达质粒并表达重组NP蛋白。考马斯亮蓝染色和Western blotting结果均表明,重组NP蛋白在大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中表达水平远高于大肠...     

猪流行性腹泻病毒流行毒株S1片段的克隆表达及其抗体制备

通过对猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行毒株S基因进行序列分析,选取S1蛋白502~641氨基酸位置,根据大肠杆菌密码子偏嗜性进行密码子优化,PCR融合扩增片段,并将其克隆到原核表达载体上,获得重组质粒p ET32a-S417、p XXGST-S417。将获得的重组质粒转化到BL21感受态细胞,成功诱导表达、纯化,以GST-S417重组蛋白作为抗原免疫家兔制备多克隆抗体。结果表明:本试验所选区域具有好的抗原免疫原性,制备的多克隆抗体能特异性识别目的蛋白,为PEDV诊断试剂盒和疫苗研制提供了理论依据。