河北省奶牛乳房炎主要致病菌多重PCR检测方法的建立

为同时检测奶牛源金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和绿脓杆菌,本试验根据GenBank中3种病原菌的nuc、ef-tu和eta基因保守序列分别合成了3对特异性引物,通过对反应条件、反应体系优化,建立了多重PCR检测方法。特异性试验结果表明,该方法与大肠杆菌、克雷伯杆菌、表皮葡萄球菌、巴氏杆菌无交叉反应,敏感性试验结果表明,多重PCR检测方法对金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和绿脓杆菌的检出限为10~(-3) mg/L。应用该方法对150份临床样品进行检测,结果金黄色葡萄球菌与无乳链球菌混合感染检出率为28.7%(43/150),金黄色葡萄球菌与绿脓杆菌混合感染检出率为14%(21/150),无乳链球菌与绿脓杆菌混合感染检出率为11.3%(17/150),3种菌混合感染检出率为6%(9/150)。应用多重PCR检测结果与分离培养诊断方法结果进行比较,均能检测出样品中的病原菌,2种检测方法的总符合率分别为金黄色葡萄球菌92.6%,无乳链球菌91.3%,绿脓杆菌94.6%。该检测方法对奶牛乳房炎的防控、临床监测及疾病诊治具有重要意义。     

奶牛乳房炎常见致病菌多重PCR检测方法的建立

为建立同时快速检测奶牛奶样中无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌和金黄色葡萄球菌的方法,根据无乳链球菌sip基因、停乳链球菌isp基因、乳房链球菌pauA基因和金黄色葡萄球菌nuc基因各设计1对特异性引物,建立多重PCR检测体系。结果显示,该检测方法具有高特异性,无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌和金黄色葡萄球菌敏感性分别为105、104、105、105 CFU/mL。对临床采集的460份奶样检测结果表明,建立的多重PCR体系可以用于临床上无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌和金黄色葡萄球菌感染引起的奶牛乳房炎的检测。     

奶牛乳房炎致病菌多重Taq-Man荧光PCR检测方法的建立

为同时检测大肠杆菌、无乳链球菌和金黄色葡萄球菌,提高对奶牛乳房炎的诊断率,本试验针对3种病原菌的保守序列设计合成了3套特异性引物,通过优化PCR反应体系和反应条件,建立了多重Taq-Man荧光定量PCR检测方法。结果显示,该检测方法具有高特异性,与肠炎沙门菌、肺炎克雷伯菌及鲍曼不动杆菌等无交叉反应;大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和无乳链球菌的最低检测浓度分别为10~(3 )、10~2和10~(4 )拷贝数/μL,敏感度较高。DNA各个拷贝数浓度的变异系数均低于2.02%,表明重复性良好。对24份临床采集奶样的检测结果表明,建立的多重Taq-Man荧光定量PCR检测方法可用于临床大肠杆菌、无乳链球菌和金黄色葡萄球菌感染引起的奶牛乳房炎的检测,具有良好的推广应用价值。     

上海地区奶牛乳房炎主要病原菌的分离鉴定及耐药性分析

为了获得上海地区奶牛乳房炎病原菌及其药物敏感性的系统资料并为指导临床合理用药和提高奶牛乳房炎防治效果提供理论依据,本研究对在上海郊区4个奶牛场采集的临床型和隐性乳房炎患牛的126份奶样进行细菌培养、分离鉴定和药敏试验.共分离到萄葡球菌,无乳链球菌,大肠杆菌3种主要病原菌107株,其中金黄色葡萄球菌74株,占分离菌株的69.16%;无乳链球菌27株,占分离菌株的25.23%;病原菌单独感染率为48.78%,其中金黄色葡萄球菌的单独感染率达39.02%;病原菌混合感染率占51.22%,多为金黄色葡萄球菌和无乳链球菌混合感染.主要病原菌对头孢拉定、环丙沙星、庆大霉素敏感,对大多数抗菌素产生了不同程度的耐药性,对氨苄青霉素产生了完全耐药性.     

多重PCR快速检测奶牛乳房炎3种主要病原体

奶牛乳房炎是引起奶牛业经济损失的一种重要疫病,目前还没有快速、特异检测奶牛乳房炎主要致病原的方法。本试验根据金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌各自保守的16S或23S rRNA基因序列,合成了3对特异性引物,建立了三重PCR检测方法。特异性试验表明,该方法对所有参与测试的金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和大肠杆菌都能扩增出各自的阳性条带,而对所有参与测试的对照菌株则不能扩增出任何条带。敏感性试验表明该方法能检测到4个菌的金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和2个菌的大肠杆菌。对送检的乳房炎奶样36份直接进行PCR检测,金黄色葡萄球菌阳性7份,无乳链球菌阳性2份,大肠杆菌阳性6份。     

牛乳中金黄色葡萄球菌和无乳链球菌的PCR检测应用研究

采集92份患隐性乳房炎牛的乳汁,分别用PCR法和常规法进行致病菌检测,常规细菌鉴定法检测出金黄色葡萄球菌感染样18份,无乳链球菌感染样30份;双重PCR检测出金黄色葡萄球菌感染样22份、无乳链球菌感染样27份。本试验从基因水平对致病性乳汁进行检测,具有操作简便、快速、敏感性高、特异性强等特点。     

多重PCR检测奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和酵母菌方法的建立与应用

参照GenBank发表的序列，在金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和停乳链球菌16SrRNA与23SrRNA之间的区域设计了3对引物，参照念珠菌和隐球菌的18SrRNA的序列设计1对引物，建立了检测金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和酵母真菌4种乳腺炎主要致病菌的多重PCR方法。参照Skladny的方法制备模拟了细菌感染l临床标本。结果表明：本试验建立的多重PCR方法具有较好的特异性，多重PCR方法检测乳样中的金黄色葡萄球菌的细菌最小浓度为10^4CFU／mL，检测无乳链球菌、停乳链球菌和酵母真菌的细菌最小浓度分别为10^4CFU／mL、10^3CFU／mL和10^3CFU／mL。通过对采自临床型乳腺炎（46个）和隐性乳腺炎（167个）动物共计213个乳样分别用传统细菌学培养法和多重PCR方法进行检测，多重PCR对金黄色葡萄球菌和酵母真菌的检测具有更高的检出率（P〈0．01），但该方法对无乳链球菌和停乳链球菌的检出率与培养法差异不显著（P〉0．05）。     

奶牛乳腺炎5种病原菌多重PCR快速检测方法的建立与评价

为建立一种能同时快速检测多种奶牛乳腺炎致病菌的多重PCR检测方法,本研究以化脓隐秘杆菌ISR基因、无乳链球菌cfb基因、大肠杆菌phoA基因、副乳房链球菌23S rRNA基因和金黄色葡萄球菌nuc基因为靶基因,设计并合成了5对特异性引物,通过方阵法对多重PCR反应体系及反应条件优化,建立了一种能快速检测5种病原菌的多重PCR方法。对各菌种随机组合后利用该多重PCR方法检测,结果显示,该方法能同时快速检测奶牛乳腺炎乳样中5种主要病原菌,而其他病原菌则呈阴性结果,具有较强特异性。分别将化脓隐秘杆菌、无乳链球菌、大肠杆菌、副乳房链球菌、金黄色葡萄球菌菌液10倍倍比稀释后,利用建立的多重PCR方法进行检测,确定该方法敏感性,结果显示,该方法对5种病原菌最低检测浓度分别为:金黄色葡萄球菌6.25×10~4cfu/mL,大肠杆菌2.95×10~6cfu/mL,化脓隐秘杆菌2.95×10~5cfu/mL,副乳房链球菌4.3×10~5cfu/mL,无乳链球菌3.15×10~5cfu/mL。对临床送检及人工模拟的乳样检测结果显示该方法具有较好符合率及灵敏度。本研究首次建立了对包括副乳房链球菌在内的奶牛乳腺炎致病菌多重PCR检测方法,为快速检测奶牛乳腺炎病原菌提供了可行的技术手段。     

链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌和大肠杆菌多重PCR检测方法的建立及应用

根据NCBI上已收录的链球菌ef-tu基因、金黄色葡萄球菌nuc基因、沙门菌hut基因和大肠杆菌23SrRNA基因的序列,设计并合成4对特异性引物,通过优化多重PCR的反应条件,建立了能够同时检测4种细菌混合感染的多重PCR诊断方法。特异性分析结果表明,应用该方法可以从链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌和大肠杆菌以及4种细菌的混合物中扩增出4条大小分别为197、278、495和652bp的特异性条带,其他对照组的检测结果均为阴性;敏感性分析表明,该方法对4种病原菌基因组DNA的检出量分别为链球菌25.6pg、金黄色葡萄球菌33.2pg、沙门菌35.7pg、大肠杆菌52.1pg;人工模拟感染样本检测表明,该方法能从混合感染的病料中特异地检测出4种病原菌。本试验建立的多重PCR方法具有特异性强,敏感度高,稳定性好的特点,可以有效的检测链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌和大肠杆菌的混合感染。     

奶牛隐性乳房炎的检测及病原菌的分离鉴定与药敏试验

试验对内蒙古包头市某奶牛场饲养的451头生产奶牛的1 728个乳区进行检测、病原菌分离鉴定及药敏试验.结果显示,患隐性乳房炎的奶牛252头,阳性率为55.9%:有效乳区1728个,阳性乳区480个,乳区阳性率为27.8%.从检测为隐性乳房炎阳性的乳区乳汁中分别分离到金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、棒状杆菌、沙门氏菌和表皮葡萄球菌.检出菌中传染性致病菌金黄色葡萄球菌和链球菌的检出率高.从药物敏感性试验结果看,头孢唑啉和沙星类药物除了沙门氏菌以外对其他菌均高度敏感,常用药物呈现出不同程度的耐受性;狼毒中草药对链球菌有一定的敏感性,对葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果不好,对棒状杆菌和沙门氏菌没有抑菌作用:乳炎金针为中西药合剂,对6种致病菌抑菌效果都比较好.     

奶牛隐性乳房炎的检测及病原菌的分离鉴定与药敏试验

试验对内蒙古包头市某奶牛场饲养的451头生产奶牛的1 728个乳区进行检测、病原菌分离鉴定及药敏试验.结果显示,患隐性乳房炎的奶牛252头,阳性率为55.9 %;有效乳区1 728个,阳性乳区480个,乳区阳性率为27.8 %.从检测为隐性乳房炎阳性的乳区乳汁中分别分离到金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、棒状杆菌、沙门氏菌和表皮葡萄球菌,检出菌中传染性致病菌金黄色葡萄球菌和链球菌的检出率高.从药物敏感性试验结果看,头孢唑啉和沙星类药物除了沙门氏菌以外对其他菌均高度敏感,常用药物呈现出不同程度的耐受性;狼毒中草药对链球菌有一定的敏感性,对葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果不好,对棒状杆菌和沙门氏菌没有抑菌作用;乳炎金针为中西药合剂,对6种致病菌抑菌效果都比较好.     

甘肃省山丹地区马子宫内膜炎主要病原菌的分离鉴定及多重PCR检测方法的建立

旨在对甘肃省山丹地区马子宫内膜炎主要致病菌进行分离鉴定并建立一种病原菌多重PCR(multiplex polymerase chain reaction, MPCR)检测方法。根据病原菌分离鉴定结果,选取主要致病菌金黄色葡萄球菌(Saphylococcus aureus,S.aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)和马链球菌(Streptococcus equi,S.equi)进行多重PCR检测方法的建立。提取3种标准菌株基因组并基于nuc、phoA、fneB的保守区域设计3对特异性引物,扩增预期核酸片段分别为1 319,385,109 bp,进行引物特异性MPCR验证同时对扩增条件中的退火温度、引物浓度优化,建立检测3种病原菌的多重PCR,完成样品检测评估。结果表明,山丹地区马子宫内膜炎主要致病菌为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和马链球菌,设计的引物与无乳链球菌(Streptococcus agalactiae,S.agalactiae)、肺炎链球菌(Pneumococcus)无交叉反应,建立的多重PCR检测方法退火温度在59.4℃时最佳;在引物为0.3～...     

新疆铁门关地区奶牛乳房炎病原菌分离鉴定及主要病原菌药敏试验

本试验从新疆铁门关地区采集166份乳房炎患牛的奶样,进行了细菌分离鉴定并对主要病原菌进行药敏试验。结果表明,从奶样中共分离出12种267株细菌,其中主要病原菌为:金黄色葡萄球菌86株,检出率33.6%;大肠杆菌68株,检出率25.5%;停乳链球菌33株,检出率12.4%;无乳链球菌25株,检出率9.4%。临床型乳房炎大部分为混合感染(混合感染的感染率为61.4%),隐性乳房炎大部分为单独感染(单独感染的感染率为88.5%)。选择16种抗生素采用K-B纸片法对分离出的病原菌进行药敏试验,4种主要病原菌对头孢曲松钠、头孢哌酮、克林霉素、氟苯尼考敏感。该试验为本地区奶牛乳房炎的防治提供了理论依据。     

Chelex-100法直接提取乳样中奶牛乳房炎主要致病菌DNA方法的建立

为建立一种直接从乳样中快速提取细菌DNA的方法,试验通过人工制备8个倍比稀释细菌的乳样,检测了Chelex-100法提取3种奶牛乳房炎主要致病菌(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和无乳链球菌)DNA进行PCR扩增的敏感性,并与苯酚—氯仿法进行了比较分析。结果显示,以Chelex-100法提取乳样中细菌DNA进行PCR扩增具有较高的敏感性,所检测金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和无乳链球菌的最小浓度分别为10³、10²、10² CFU/mL;而使用苯酚—氯仿法提取乳样中各细菌DNA的PCR敏感性均为10⁴ CFU/mL。综上所述,Chelex-100法提取乳样细菌DNA的PCR敏感性可以满足临床检测奶牛乳房炎的需要,显现了简单快速、经济、无污染的优点,为从乳样中直接提取细菌DNA提供了新的思路,对PCR快速检测乳房炎致病菌具有重要意义。     

多重PCR与细菌培养法检测牛乳中病原菌的对比研究

为了验证所建立的多重PCR法检测奶牛乳腺炎的灵敏性,应用所建立的多重PCR法与传统细菌培养法对临床型乳腺炎(54份)和隐性乳腺炎(145份)共计199份乳样进行了无乳链球菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的检测,检测结果用SPSS 18.0软件进行统计分析。结果表明:对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的检测,多重PCR法的灵敏性显著高于细菌培养法(P0.05),而对无乳链球菌的检测,两种方法的敏感性无显著差异(P0.05)。说明所建立的多重PCR法灵敏性高于细菌培养法。     

应用PCR方法检测奶牛乳房炎主要病原菌

为建立一种在分子水平快速检测乳房炎主要病原菌的方法,根据GenBank已发表的序列设计了3对特异性引物,结果可同时检测奶牛乳房炎的3种主要病原菌:金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和无乳链球菌.其特异性为100%,敏感性检测的最低浓度为:1.25×103 cfu/mL.     

应用PCR方法检测奶牛乳房炎主要病原菌

为建立一种在分子水平快速检测乳房炎主要病原菌的方法,根据GenBank已发表的序列设计了3对特异性引物,结果可同时检测奶牛乳房炎的3种主要病原菌:金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和无乳链球菌。其特异性为100%,敏感性检测的最低浓度为:1.25×103cfu/mL。     

双重PCR检测奶牛隐性乳房炎大肠杆菌与无乳链球菌方法的建立及应用

为快速检测奶牛隐性乳房炎主要致病菌大肠杆菌和无乳链球菌,分别针对2种致病菌16S-23S rRNA和16S rRNA基因设计2对特异性引物,优化并确立双重PCR反应体系。特异性检测表明,对其他对照菌株未扩增出目的条带;敏感性试验表明,该双重PCR对大肠杆菌、无乳链球菌的最小检测浓度分别为10~2、10~3cfu/mL。同时采用双重PCR与细菌学检查法对送检的96份奶样进行检测,结果双重PCR检出63份大肠杆菌阳性、54份链球菌阳性;细菌学方法检出29份大肠杆菌阳性、37份链球菌阳性。说明本研究建立的双重PCR方法敏感、快速,可用于检测大肠杆菌和无乳链球菌引起的奶牛隐性乳房炎。     

直接提取病原菌DNA检测奶牛隐性乳房炎试验

为研究奶牛隐性乳房炎主要致病菌的快速检测方法,本试验选取山西省太原市小店区某规模化奶牛场39头隐性乳房炎患牛,利用Chelex-100方法直接提取奶样金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及停乳链球菌DNA进行检测。结果表明,利用Chelex-100方法直接提取奶样中病原菌DNA检测奶牛隐性乳房炎,具有简单、快速、经济、无污染、PCR敏感性高等优点,对PCR快速检测奶牛隐性乳房炎具有重要意义。     

某规模化奶牛场奶牛乳房炎患病率及主要致病菌调查

研究旨在了解北疆某规模化奶牛场奶牛乳房炎患病率和发病牛乳汁中主要致病菌的种类。通过采用美国加州乳房炎检测（CMT）和体细胞数检测（SCC）对隐性型乳房炎进行诊断,临床外观法诊断临床型乳房炎并进行主要致病菌分离鉴定。结果显示：该奶牛场的临床型乳房炎头阳性率及乳区阳性率分别为1.65%(12/728)和0.41%(12/2 896);隐性乳房炎头阳性率及乳区阳性率分别为5.45%(39/716)和1.46%(42/2 884);瞎乳头率为0.55%(16/2 912)。该牛场不同胎次间的奶牛患隐性乳房炎的头阳性率差异显著。从12份临床型乳房炎乳汁样本中初步分离鉴定出2株金黄色葡萄球菌、5株大肠杆菌和5株链球菌属。研究表明,该奶牛场奶牛乳房炎患病率较低,金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和链球菌属可能是该牛场乳房炎主要致病菌。