番鸭细小病毒安徽分离株结构蛋白基因的克隆及序列分析

为研究番鸭细小病毒(MDPV)安徽分离株的遗传变异特征,通过PCR扩增获得了MDPV结构蛋白(VP)基因全长序列AH-MDPV-VP,并将该序列与GenBank中登录的12条MDPV和鹅细小病毒(GPV)VP基因序列进行比对。结果显示,AH-MDPV-VP基因全长2 199bp,包括完整的VP1、VP2和VP3蛋白编码区。MDPV与GPV的VP基因部分序列一致,但具有明显的差异。进化分析显示,MDPV安徽分离株与基因重组型MDPV上海分离株SAAS-SHNH为同一分支,亲缘关系较近。同源性分析显示二者核苷酸序列同源性最高,为99.9%,且AH-MDPV-VP与GPV毒株SHFX1201的序列同源性也有89.5%。此外安徽分离株与其他MDPV的VP1、VP2和VP3基因同源性有逐步下降的趋势,而与GPV则相反呈上升趋势。进一步显示MDPV安徽分离株与基因重组型MDPV上海分离株SAAS-SHNH相似,可能为MDPV和GPV基因重组型水禽细小病毒。     

与兔出血症病毒VP60蛋白相互作用蛋白的初步鉴定

为获得与兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白(VP60)相互作用的细胞蛋白,本研究以pMD-VP60重组质粒为模板扩增RHDV的VP60基因,克隆于表达载体pGEX-6p-1中,构建了重组表达质粒pGEX-VP60,并转化大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达GST重组蛋白(rVP60),western blot分析表明该蛋白具有与VP60单克隆抗体(MAb)良好的反应原性。以亲和层析纯化的rVP60进行pull-down实验,从兔的肝脏细胞膜蛋白中获得与VP60相互作用的蛋白,多肽质量指纹图谱分析表明,其相互作用的蛋白为ATP合成酶β亚基,提示该蛋白可能与RHDV的感染相关。     

猪脑心肌炎病毒VP1蛋白与宿主RPS20蛋白相互作用研究

为筛选并鉴定与猪脑心肌炎病毒(EMCV) VP1蛋白相互作用的宿主蛋白,本实验采用酵母双杂交系统筛选BHK-21细胞cDNA酵母表达文库。酵母共转化和免疫共沉淀试验表明VP1和RPS20蛋白之间存在特异性相互作用。激光共聚焦试验显示,过表达的VP1和RPS20共定位于细胞质中。本研究初步证实了RPS20与EMCV VP1蛋白之间的相互作用,为进一步研究RPS20蛋白在EMCV感染过程中的生物学功能奠定了基础。     

应用酵母双杂交技术筛选E种肠道病毒HY12-VP1蛋白的互作蛋白

为筛选E种肠道病毒HY12毒株编码VP1蛋白的宿主互作蛋白,本试验应用PCR技术扩增出HY12病毒VP1蛋白基因的完整序列,并将其克隆到酵母载体pGBKT7中,构建重组诱饵质粒pGBKT7-VP1。将重组质粒转化到酵母菌株AH109中,通过对比重组质粒组和空白质粒组不同时间点的D_(600)值,检测其对酵母细胞的毒性,并把含有诱饵重组质粒的酵母菌涂布在缺陷型培养基上验证其自激活活性。将转有诱饵载体的AH109菌株与表达MDBK细胞的cDNA文库的Y187菌株混合培养,通过缺陷型培养基筛选杂交成功的菌落,并应用序列测定与比对分析和酵母回返试验等方法进行验证。提取阳性菌落的酵母质粒,通过缺陷型培养基及菌液PCR等方法,筛选到12个潜在HY12病毒VP1的互作蛋白,该结果为研究牛肠道病毒(BEV)感染机制及病毒结构蛋白VP1的功能等打下基础。     

猪BPI蛋白重组载体的构建及真核表达

试验旨在构建猪BPI真核表达载体,获得猪源BPI重组蛋白.根据GenScript's CloneEZ^® PCR Cloning Kit试剂盒,将BPI编码序列克隆至pUC57载体上,酶切与测序鉴定无误后,将重组质粒pUC57-BPI转染293-6E细胞,并利用SDS-PAGE和Western blotting方法检测其表达水平.结果显示,本试验成功构建了猪源BPI蛋白真核表达载体pUC57-BPI,并在293-6E细胞培养上清中检测到猪源BPI重组蛋白的表达.该猪源BPI重组蛋白体外表达系统的建立为今后深入研究猪BPI的生物学功能以及猪抗菌蛋白的制备提供了试验基础.     

番鸭细小病毒和鹅细小病毒广东株VP1基因的克隆与序列分析

参考GenBank中的MDPV FM株和GPV B株全基因序列,设计并合成一对引物,分别对MDPV GD株和GPV GD株的结构蛋白基因(VP1)进行PCR扩增,并克隆到pMD18-T载体,筛选到重组质粒并测序.通过对MDPV GD株和GPVGD株的VP1基因的核苷酸序列分析,这两种病毒VP1基因大小均为2 199 bp,核苷酸序列同源性为87%,而位于VP1基因上的VP2至VP3基因起始密码子之间的核苷酸序列的差异较大,同源性仅为64%.另外对MDPV GD株和GPV GD株与各地方毒株的VP1和VP3基因核苷酸序列的同源性比较,显示它们之间差异较小.     

鸭肠炎病毒VP22蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为了制备抗鸭肠炎病毒(DEV)VP22蛋白的单克隆抗体(MAb),本研究以DEV Clone-03基因组DNA为模板,通过PCR方法扩增UL49基因并克隆至pMD-18载体.重组质粒经测序鉴定后,将UL49基因亚克隆于原核表达载体pET-30a,构建重组表达质粒pET-30a-UL49.重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经IPTG诱导,在大肠杆菌中获得表达,并对表达的重组蛋白VP22进行western blot鉴定.结果显示,表达的重组蛋白分子量约为36 ku,与预期的大小一致.重组蛋白能够被鼠抗DEV阳性血清所识别,表明该重组蛋白具有良好的免疫原性.将重组蛋白纯化、复性后免疫BALB/c小鼠,制备MAb,经间接ELISA、western blot和间接免疫荧光试验进行筛选及鉴定.获得4株能够稳定分泌抗DEV VP22蛋白MAb的杂交瘤细胞株,分别命名为2810、2G1、3F10和3G2.其MAb亚类分别属于IgG2b、IgG2b、IgA和IgM.4株MAbs都能够与DEV Clone-03发生特异性反应,表明能够识别天然构象的VP22蛋白.这4株MAb可用于DEV VP22蛋白功能研究及抗原表位的研究.     

GST pull-down验证新城疫病毒基质蛋白与鸡importinβ1蛋白的相互作用

旨在利用GST pull-down技术验证新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)基质(matrix,M)蛋白与鸡importinβ1蛋白在体外的相互作用。根据NDV ZJ1株M基因和鸡importinβ1基因序列设计引物,通过PCR扩增获得NDV M基因和鸡importinβ1基因,将其分别定向插入到原核表达载体pGEX-6p-1和pET-32a(+)构建重组原核表达载体pGEX-6p-M、pET-32a-importinβ1,然后转化至大肠杆菌BL21(DE3)后进行IPTG诱导表达,SDSPAGE检测重组蛋白的表达情况,并对包涵体重组蛋白进行变性和复性处理。然后以GST-M重组蛋白为诱饵蛋白,His-importinβ1重组蛋白为猎物蛋白,利用GST pull-down技术验证M蛋白与importinβ1蛋白的相互作用。结果表明,成功构建了重组原核表达载体pGEX-6p-M和pET-32a-importinβ1,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)获得了正确表达。SDS-PAGE电泳检测显示GST-M重组蛋白主要以包涵体形式存在,而His-importinβ1重组蛋白以可溶性和包涵体两种形式存在。利用蛋白重折叠试剂盒获得了有活性的GST-M重组蛋白,将其作为诱饵蛋白,可以捕获并检测到His-importinβ1重组蛋白,但是GST标签蛋白不能结合His-importinβ1重组蛋白。利用GST pull-down技术证实了NDV M蛋白与鸡importinβ1蛋白在体外具有直接的相互作用,这为深入研究importinβ1蛋白在NDV M蛋白细胞核定位的分子机制以及在NDV复制和致病中的作用奠定了基础。     

猪水泡病病毒VP1重组蛋白的表达及抗原性检测

本研究利用猪水泡病病毒外壳蛋白VP1基因和pGEX-4T－1质粒成功构建重组质粒pGEX-4T－1－VP1，并转入BL21（DE3）表达菌中，经IPTG诱导后通过SDS-PAGE凝胶电泳实验和考马斯亮蓝染色，结果显示在57KDu处出现特异性表达条带。经免疫印迹试验证实本研究所表达的重组蛋白VP1具有抗原性，可为利用重组蛋白VP1建立间接ELISA方法检测猪水泡病奠定基础。     

番鸭细小病毒VP3基因和鸭IL-2基因真核融合表达载体的构建

将番鸭细小病毒(MDPV)主要结构蛋白VP3基因和免疫刺激基序(CpG)依次克隆至质粒pIRES-dIL2上,构建了重组质粒pIRES-dIL2-VP3-CpG。核酸疫苗重组质粒转染BHK-21细胞进行间接免疫荧光试验,可在细胞浆中检测到绿色荧光,表明重组质粒可以成功地在真核细胞内表达。     

鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白可溶性原核表达及免疫原性分析

为在大肠杆菌中表达出高可溶性的VP2-LS3蛋白笼纳米颗粒并检测其免疫原性,将扩增的7种融合标签(GST、NusA、MBP、PpiB、γ-crystallin、ArsC和Grifin)片段连在VP2-LS3基因的N端,构建7个带有不同标签的重组原核表达载体。再将其分别转化至大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳分析,筛选出显著促进VP2-LS3蛋白可溶性表达的融合标签,并进行大量诱导表达、纯化。纯化得到的VP2-LS3重组蛋白分别进行TEV酶酶切、电镜观察分析及免疫家兔,并对获得的兔抗VP2血清进行Western blot和间接ELISA分析。结果显示,与其他6个标签相比,MBP标签促进VP2-LS3蛋白的可溶性表达具有显著性,可溶性表达水平达到69.5%;TEV酶可以把His6-MBP标签蛋白与VP2-LS3蛋白分开,获得高纯度的VP2-LS3蛋白;镜检显示形成了LS3蛋白笼纳米颗粒;Western blot结果表明,表达的VP2-LS3重组蛋白可与兔抗血清发生特异性反应,而不与阴性对照血清发生反应;间接ELISA检测制备的兔抗VP2血清效价达到1∶12 800。本研究获得了高可溶性的VP2-LS3蛋白笼纳米颗粒,为传染性法氏囊病病毒(IBDV)基因工程疫苗的研发奠定基础。     

表达Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒VP1蛋白重组腺病毒的构建

为构建表达Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒(DHV-I)VP1蛋白的重组腺病毒,本实验采用RT-PCR方法扩增DHV-Ⅰ HP-1株VP1基因,克隆于腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV中,并将其电转化于含腺病毒pAdeasy骨架质粒的大肠杆菌BJ5183中,通过同源重组制备含有重组腺病毒的质粒.重组质粒经PacⅠ酶切线性化后转染AD293细胞,获得重组腺病毒(rAd-VP1).间接免疫荧光和western blot鉴定结果显示,DHV-Ⅰ的VP1蛋白在重组腺病毒感染的AD293中获得表达.rAd-VP1的制备为鸭免疫实验效果评价奠定了基础.     

马链球菌马亚种8组分融合蛋白的表达及小鼠免疫效果的评价

马腺疫是由马链球菌马亚种(S. equi)引起的急性接触性马属动物传染病，严重影响幼驹的生长发育。我国尚无预防该病的有效疫苗，也缺乏S. equi动物感染和免疫保护模型。为在原核系统中表达马链球菌马亚种(S. equi)的多组分融合蛋白，并评价其对小鼠的免疫保护效果，本研究以S. equi HLJ2018株DNA为模板，分别经PCR扩增其cne、eag、SclC、SclI、SclF、eq5、eq8和ideE基因，并分别克隆至pGEX-6p-1载体中，构建表达这8个蛋白的重组质粒并分别经PCR和测序鉴定。通过在各基因之间引入蛋白接头Gly-Gly-Gly编码基因序列并利用同源重组技术依次串联该8个基因，得到融合基因se8，利用其构建重组质粒pET-28a-SE8 (His标签)及pGEX-6p-1-SE8(GST标签)，均经PCR和测序鉴定后，将这两个表达SE8及分别表达该8个蛋白的重组质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达后采用亲和柱层析法纯化，采用SDS-PAGE检测各蛋白的表达及纯化效果；采用western blot检测各蛋白的反应原性。SDS-PAGE结果显示...     

鹅细小病毒VP2和VP3蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及验证

为筛选与鹅细小病毒VP2和VP3蛋白相互作用的鹅胚成纤维细胞蛋白,构建VP2和VP3蛋白的诱饵载体pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3。从pGEX-4T-VP1质粒中PCR扩增VP2和VP3基因,克隆至pMD-18T载体中,经测序验证鉴定后定向克隆到酵母双杂交载体pGBKT7中。将2个重组诱饵载体经PCR、酶切和测序验证后分别转化酵母菌H2YGold中,检测其在酵母细胞中有无自激活和毒性作用。结果表明:成功构建了pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3诱饵载体,且其对报告基因无自激活作用,对酵母细胞无毒性。由此说明,诱饵载体pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3可用于酵母双杂交系统筛选与VP2和VP3蛋白相互作用的细胞结合蛋白。     

猪瘟病毒衣壳蛋白与宿主丝/苏氨酸蛋白激酶N1相互作用的鉴定

为筛选并鉴定与猪瘟病毒(CSFV)衣壳(C)蛋白相互作用的宿主蛋白,本研究采用酵母双杂交技术以CSFV C蛋白为诱饵从猪外周血单个核细胞(PBMC)c DNA表达文库中筛选与之相互作用的宿主蛋白,共筛选到6种蛋白,分别为ATP5B、SON3、PKN1、PCBP1、RPS20和IQGAP1,根据Gene Ontology分析结果,这些蛋白分别参与细胞的增殖和代谢等过程。本研究选取丝/苏氨酸蛋白激酶N1(PKN1)进行进一步验证,经酵母共转化试验、免疫共沉淀试验和GST pull-down试验证实,宿主PKN1蛋白与CSFV C蛋白之间存在特异性结合。本研究首次证明PKN1与CSFV蛋白之间的相互作用关系,为进一步研究PKN1蛋白在CSFV感染过程中发挥的作用奠定了基础。     

中国株兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因在大肠杆菌中的表达及其免疫原性鉴定

应用RT—PCR技术扩增编码兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)WX84株衣壳蛋白VP60基因，将PCR产物按相应的阅读框架克隆到表达性载体pGEX-6P-1中谷胱甘肽转移酶(GST)基因的下游。将重组质粒转化入大肠杆菌BL21株，在1．0mmol／L 1PTG和37C的条件下诱导，VP60—GST基因融合蛋白获了高效表达。经聚丙烯酰胺凝胶电泳和western-blotting试验证实所表达的融合蛋白产物相对分子质量与预期的87000相符。将表达产物经电泳切胶回收目的条带后免疫小鼠，所得抗血清应用间接ELISA检测，与RHDV病毒粒子呈阳性反应。试验结果表明，大肠杆菌中表达的RHDVVP60融合蛋白在抗原性上与天然衣壳蛋白具有一定的相似性。     

番鸭细小病毒MDPV YZ株VP2和VP3蛋白基因的克隆和序列测定

根据国外已发表的番鸭细小病毒（MDPV）FM株基因组核苷酸序列设计了1对引物，应用PCR技术扩增了MDPV YZ株的VP2和VP3蛋白基因片段。将扩增后的VP2和VP3蛋白基因克隆到pCR3.1T载体上，MDPV YZ株基因大小为1764bp，编码528个氨基酸，并对播入片段进行序列测定。测定结果表明，我国分离的MDPV YZ株蛋白基因序列与国外发表的序列的同源性为98.5%。     

非洲猪瘟病毒VP73结构蛋白表达及鉴定

 
为获得可作为血清学诊断抗原的体外诱导表达ASFV VP73 结构蛋白,根据GenBank登录的ASFV 基因序列,人工合成VP73主要抗原表位区基因克隆至pUC57载体中,设计1对引物,PCR扩增获得429 nt的VP73基因片段;将VP73基因片段使用EcoRI和SalI酶切后亚克隆至表达载体pGEX KG,经PCR、酶切、测序鉴定挑选阳性克隆,转化进表达菌株BL21(DM3)中进行体外诱导表达,SDS PAGE和Western blot分析蛋白表达及其活性。结果显示,成功构建表达重组载体pGEX KG VP73,且诱导有效表达了41Ku重组蛋白,表达量约占菌体总蛋白的35％;Western blot分析表达该蛋白具有良好的表达活性。试验为建立无感染性、快速、敏感的血清学诊断方法奠定了一定基础。     

猪瘟病毒蛋白E2、Npro基因的克隆表达及纯化

克隆了猪瘟病毒(CSFV)石门株E2和Npro基因,并分别插入pGEX-6p-1表达载体中,构建了原核重组表达质粒。经IPTG诱导后,应用SDS-PAGE电泳检测结果表明,重组质粒均得以成功表达。使用超声法破碎菌体获得蛋白,将带有GST标签的融合蛋白进行亲和层析,其中E2和Npro的表达形式分别为包涵体表达和可溶性蛋白表达。将E2变性后重折叠,应用亲和层析法纯化蛋白,Western blot检测发现CSFV蛋白E2能够被CSFV阳性血清识别,具有良好的反应原性,而Npro不能与CSFV阳性血清反应。     

A型塞内卡病毒VP1蛋白的原核表达及纯化

【目的】实现A型塞内卡病毒(Seneca virus A,SVA)VP1蛋白在大肠杆菌中的高效可溶性表达,以建立SVA抗体液相芯片技术检测方法。【方法】根据GenBank收录的SVA VP1基因序列(登录号：KY747514.1),基于大肠杆菌的密码子偏好性优化合成VP1基因,克隆到pCold TF载体,构建重组质粒pCold TF-VP1。将重组质粒pCold TF-VP1转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,进行IPTG诱导表达。通过优化诱导时间及IPTG浓度得出最佳诱导表达条件。采用His标签镍柱纯化VP1重组蛋白,将纯化后的SVA VP1蛋白与荧光微球进行偶联,偶联好的微球与阴阳性血清反应,利用Luminex 200系统上机检测背景及阴阳性血清的中值荧光强度(MFI),从而判断阴阳性,以用于猪血清中SVA抗体的检测。【结果】重组质粒pCold TF-VP1成功转入大肠杆菌BL21感受态细胞,并以可溶性蛋白形式表达。经诱导表达在约82 ku处出现阳性条带。当重组菌株诱导条件为16℃、IPTG终浓度为1.2 mmol/L、诱导时间为3 h时,VP1蛋白表达量最高;经Wester...