非洲猪瘟病毒p30基因的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测血清中非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）抗体的间接ELISA方法,本试验将ASFV p30基因进行原核表达,采用SDS-PAGE和Western blotting方法对重组蛋白进行表达鉴定和免疫原性分析,随后以纯化的重组蛋白为包被抗原,经条件优化、特异性试验、敏感性试验和重复性试验,建立一种血清中ASFV抗体的检测方法。结果显示,ASFV p30基因成功克隆到原核表达载体pET-32a （+）中,获得pET-32a-p30重组质粒;转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞进行诱导表达,得到P30重组蛋白,重组蛋白大小约为42 ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果显示,纯化后的蛋白具有良好的免疫原性;以纯化的P30重组蛋白为包被抗原,建立了检测ASFV抗体的间接ELISA方法,通过方阵试验对间接ELISA方法进行优化,最终确定了抗原最佳包被浓度为1.2 μg/mL,待检血清最佳稀释倍数为1：100,最佳封闭液为1% BSA,酶标抗体最佳稀释度为1：4 000,以此建立的ASFV间接ELISA方法临界值为0.322。本方法仅与ASFV阳性血清发生特异性反应,与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型及猪流行性腹泻病毒阳性血清均无交叉反应,具有较强的特异性。该方法检测ASFV阳性血清灵敏度可达到1：1 600;批内重复性和批间重复性变异系数均<10%。本试验建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、灵敏度和重复性,可初步应用于ASFV抗体的检测。     

非洲猪瘟病毒p22蛋白表达、多克隆抗体制备及间接ELISA方法的建立

【目的】试验旨在表达与纯化非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)的结构蛋白p22,将其作为包被抗原建立ASFV抗体的间接ELISA检测方法,用于诊断非洲猪瘟。【方法】将ASFV p22编码基因KP177R的截短体(24―145位氨基酸)克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,将重组质粒pET-32a-p22转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经0.1 mmol/L IPTG诱导表达5 h,利用镍柱亲和纯化p22蛋白,并进行Western blotting鉴定。利用p22蛋白免疫BALB/c小鼠制备抗血清,并以含p22全长基因的真核表达质粒pCAGGS-EGFP-fp22转染HEK293T细胞为抗原基质,利用间接免疫荧光(IFA)鉴定抗血清的反应性。以重组p22蛋白为包被抗原,优化最佳抗原包被浓度、待检血清稀释度、封闭条件、抗原抗体反应时间、酶标二抗工作浓度等参数,建立ASFV抗体间接ELISA检测方法,并对临床猪血清样品进行检测。【结果】ASFV p22截短蛋白在大肠杆菌中高水平表达,蛋白产量为0.85 mg/100 g菌体;p22蛋白具...     

非洲猪瘟病毒p72蛋白单克隆抗体的制备及阻断ELISA方法的建立

为建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)血清抗体的阻断ELISA方法，本研究对ASFV p72蛋白进行原核表达并纯化，将其免疫BALB/c小鼠并通过间接ELISA方法筛选到1株稳定分泌p72蛋白的杂交瘤细胞株3F8。以纯化的p72蛋白作为包被抗原，辣根过氧化物酶(HRP)标记的单克隆抗体(MAb)作为检测抗体，采用方正滴定法对反应条件优化后初步建立了检测ASFV的阻断ELISA方法。利用该方法检测133份ASFV阳性血清和73份ASFV阴性血清，通过ROC曲线分析确定临界值。结果显示，该方法的临界值为25.62%时，ROC的曲线面积最大，为0.9989，诊断敏感性和特异性分别为98.63%和98.5%。利用该方法检测ASFV、O型口蹄疫病毒(FMDV)、A型FMDV、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒阳性血清，结果显示，除ASFV阳性血清外，其他阳性血清均为阴性，表明特异性强；利用该方法和商品化试剂盒对2倍倍比稀释(1∶4～1∶2 048)的两种ASFV灭活阳性血清(P1、P2)检测，结果显示该方法检测结果与商品化试剂盒基本一致，敏感性高。利用该方法对3份灭活的...     

非洲猪瘟病毒p30基因的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测血清中非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)抗体的间接ELISA方法,本试验将ASFVp30基因进行原核表达,采用SDS-PAGE和Western blotting方法对重组蛋白进行表达鉴定和免疫原性分析,随后以纯化的重组蛋白为包被抗原,经条件优化、特异性试验、敏感性试验和重复性试验,建立一种血清中ASFV抗体的检测方法。结果显示,ASFVp30基因成功克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,获得pET-32a-p30重组质粒;转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,得到P30重组蛋白,重组蛋白大小约为42ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果显示,纯化后的蛋白具有良好的免疫原性;以纯化的P30重组蛋白为包被抗原,建立了检测ASFV抗体的间接ELISA方法,通过方阵试验对间接ELISA方法进行优化,最终确定了抗原最佳包被浓度为1.2μg/mL,待检血清最佳稀释倍数为1∶100,最佳封闭液为1%BSA,酶标抗体最佳稀释度为1∶4 000,以此建立的ASFV间接ELISA方法临界值为0.322。本方法仅与ASFV阳性血清发生特异性反应,与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型及猪流行性腹泻病毒阳性血清均无交叉反应,具有较强的特异性。该方法检测ASFV阳性血清灵敏度可达到1∶1 600;批内重复性和批间重复性变异系数均10%。本试验建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、灵敏度和重复性,可初步应用于ASFV抗体的检测。     

非洲猪瘟病毒p30蛋白的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

为建立非洲猪瘟病毒(ASFV)快速、高效和高通量的血清学诊断方法,本研究针对ASFVPig/HLJ/2018毒株序列CP204L(p30)基因,构建了重组质粒pET-28a-p30,并通过原核表达系统获得ASFV重组p30蛋白,试验发现重组蛋白主要在包涵体中表达.经Western blot鉴定重组p30蛋白的反应原性良...     

基于非洲猪瘟病毒p30与p54蛋白表位串联多肽的间接ELISA抗体检测方法的建立

旨在建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)血清抗体的间接ELISA方法。本研究以两株纯化的ASFV p30与p54蛋白单克隆抗体(mAbs)为靶分子,利用噬菌体展示十二肽库进行四轮生物淘选,筛选多肽表位,以氨基酸GGG为接头设计合成表位串联多肽作为包被抗原,通过棋盘滴定法确定间接ELISA的最佳反应条件,利用不同类型血清样本对建立的方法进行特异性分析、敏感度分析、稳定性分析及符合性评价。噬菌体淘选试验结果表明¹⁴⁶PAEPYTT¹⁵²为本实验室保存的mAb所识别的p54蛋白抗原表位核心序列。ELISA条件优化试验结果显示,以鸡卵白蛋白(OVA)作为N端偶联物的表位串联多肽抗原具有较低的非特异性血清反应背景,当多肽以碳酸盐缓冲液包被(2 μg·mL^-1),血清以封闭液(1%明胶溶液)稀释100倍,辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体以0.05% PBST溶液稀释5 000倍时,反应效果最佳;以上述优化后的条件确定了血清抗体阳性临界值为0.339。方法评价试验结果显示,该方法与经典猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)及猪伪狂犬病病毒(PRV)的抗体阳性血清均无交叉反应,能检测低至1 600倍稀释的ASFV阳性血清,具有较好的重复性。用该方法与商品化的ASFV抗体检测试剂盒同时检测320份猪血清样本,两种方法的相对特异性和相对敏感性分别为97.6%与97.3%,总体符合率达97.5%(312/320)。综上表明,本研究建立的多肽间接ELISA方法具有良好的特异性、敏感性及重复性,具有发展为临床诊断试剂盒的潜在应用价值。     

非洲猪瘟病毒p54间接ELISA抗体检测方法的建立及试剂盒研制

非洲猪瘟是对全球养猪业危害最严重的病毒性传染病,目前尚无有效疫苗。p54蛋白是非洲猪瘟病毒(ASFV)的重要结构蛋白之一,参与病毒的吸附和侵入,是非洲猪瘟血清学诊断的重要靶标之一。本研究采用无标签的重组p54蛋白作为包被抗原,建立了ASFV p54间接ELISA抗体检测方法,优化了检测条件,组装成了试剂盒。根据对374份阴性猪血清的检测,确定了本试剂盒检测的临界值,并利用不同猪病原阳性质控血清进行了敏感性、特异性和稳定性研究。结果显示,本方法检测阴/阳性血清的临界值为0.250;敏感性血清质控品的最小检出限为1∶1 600倍,与ASFV阳性血清、猪伪狂犬病病毒阳性血清、猪繁殖与呼吸病毒综合征病毒阳性血清、猪圆环病毒2型阳性血清、猪细小病毒阳性血清和猪抗大肠杆菌阳性血清等6种特异性质控血清均无交叉反应;试制的3批试剂盒批间和批内变异系数均小于10%。试剂盒在2～8℃贮存9个月,特异性、敏感性保持不变。以上试验结果表明,本试剂盒具有良好的敏感性、特异性和稳定性,与OIE推荐的p72阻断ELISA抗体检测试剂盒具有较高符合率,为非洲猪瘟临床血清学诊断和抗体监测提供了良好的技术支持。     

非洲猪瘟病毒p72蛋白阻断ELISA检测方法的建立

本研究旨在建立一种非洲猪瘟病毒(ASFV)p72蛋白阻断ELISA抗体检测方法。以纯化的重组p72蛋白作为包被抗原,HRP标记的6E5抗体作为阻断抗体,通过对反应条件进行优化,建立了基于ASFV p72蛋白的阻断ELISA方法。用建立的阻断ELISA方法检测119份临床阴性血清,计算血清阻断率确定临界值,确定了该方法的判定标准：当阻断率PI≥50%时判定为ASFV抗体阳性;PI≤40%时判定为ASFV抗体阴性;当阻断率介于两者之间时,判定为可疑。该方法与猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、A型塞内卡病毒、猪口蹄疫病毒、猪大肠杆菌、猪多杀性巴氏杆菌、副猪格拉瑟菌和猪胸膜肺炎放线杆菌的抗体阳性血清无交叉反应,批间、批内试验的变异系数均小于15%。用该方法与商品化ASFV抗体检测试剂盒同时检测447份猪临床血清样品,两种方法的相对敏感性和相对特异性分别为95.3%和94.5%,符合率为94.9%。本研究建立的阻断ELISA方法具有较高的敏感性和良好的特异性,可用于ASFV感染诊断和流行病学调查。     

非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体的制备及阻断ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的阻断ELISA方法,本研究利用原核表达的ASFV p30重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体。以重组p30蛋白作为包被抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的p30单克隆抗体作为检测抗体,经条件优化,建立了一种检测ASFV抗体的阻断ELISA方法。ROC曲线分析显示,该方法最佳阻断率临界值为16.63%。该方法与CSFV、FMDV-O/A、PRRSV、PEDV、SVA的阳性血清均无交叉反应;最低能检出1∶128稀释的阳性血清;批内和批间变异系数(CV)均＜10%。用本方法与商品化试剂盒平行检测208份血清样品,Kappa值为0.96,表明具有高度一致性。上述结果表明,本研究建立的阻断ELISA方法具有较高的特异性和敏感性,可用于血清ASFV抗体的检测,为ASFV流行病学调查及猪群疫情监控提供技术支持。     

非洲猪瘟病毒p30蛋白在本氏烟草中的表达及其抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立一种非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)抗体间接ELISA检测方法,利用马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)介导的植物生物反应器在本氏烟草中表达ASFV p30蛋白,并以表达的蛋白作为包被抗原,对间接ELISA各反应条件进行优化。依据ASFV SY-18株的CP204L(p30)基因序列,按照本氏烟草密码子的偏好性,对p30基因(231～536 bp)的核苷酸序列进行优化、人工合成及克隆,通过In-Fusion连接技术将扩增的p30基因插入到PVY基因组的P1和HC-Pro基因之间,构建PVY-p30重组病毒质粒,以摩擦的方式将质粒接种本氏烟草叶片,14 d后,通过RT-PCR和Western blot分析目的基因的转录和重组蛋白的表达情况,并利用Ni-NTA-琼脂糖亲和层析柱纯化本氏烟草中表达的p30重组蛋白,Western blot分析p30重组蛋白的纯化效果和反应原性,将纯化后的p30重组蛋白作为包被抗原,建立ASFV抗体间接ELISA检测方法。结果显示,构建的PVY-p30重组病毒能够系统性侵染本氏烟草;p30重组...     

非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

p54蛋白是非洲猪瘟病毒(ASFV)进入宿主细胞的重要结构蛋白，参与病毒的早期感染，具有较强的免疫原性，常作为研制非洲猪瘟(ASF)疫苗和检测方法的重要靶点。为制备ASFV p54蛋白的单克隆抗体(MAb)，本研究通过构建重组质粒p ET28a-p54并经原核表达重组p54蛋白(rp54)，采用镍柱亲和层析方法对rp54纯化后经SDS-PAGE鉴定。结果显示，rp54主要在沉淀中出现17 ku的目的条带，经纯化效果较好。采用纯化的rp54免疫BALB/c小鼠，三免后采用间接ELISA方法测定小鼠血清的抗体效价。选择抗体效价最高的小鼠冲击免疫，3 d后取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，通过间接ELISA筛选稳定分泌p54蛋白MAb的杂交瘤细胞。结果显示，三免后小鼠血清抗体效价最高达1∶256 000，表明该蛋白的免疫原性很好。间接ELISA筛选结果显示，获得了3株稳定分泌p54蛋白MAb的杂交瘤细胞株。分别采用western blot、间接免疫荧光试验(IFA)检测该3株MAb的反应原性，采用间接ELISA检测3株MAb的特异性。Western blot结果显示，3株MAb均在...     

基于非洲猪瘟病毒p30蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立

p30是非洲猪瘟病毒(Africa swine fever virus, ASFV)感染早期表达的结构蛋白,为非洲猪瘟(ASF)早期诊断和抗体监测的重要靶标。为了建立ASFV ELISA抗体检测方法,本试验以重组p30作为检测抗原,通过方阵滴定法优化抗原包被质量浓度、封闭液以及待检血清和酶标抗体的稀释倍数;确立阴、阳性临界值,检测方法的特异性、敏感性和重复性;比较ELISA方法与商品试剂盒检测结果的符合率,并用Western blot对ELISA结果进行了验证。结果显示,ELISA方法的最佳抗原包被质量浓度为1 mg/L,封闭液为5%的脱脂奶粉,待检血清与酶标抗体的稀释倍数分别为1∶100和1∶5 000倍,阴、阳性临界值为0.294。该方法与伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒等抗血清无交叉反应,敏感性高于商品试剂盒,批内和批间重复性试验的平均变异系数分别为4.723%和4.923%。初步应用显示,建立的ELISA方法的血清抗体阳性检出率高于商品试剂盒,两者的总符合率为62.1%。进一步验证表明,建立的ELISA方法与Western blot的结果一致。上述结果表明,建立的...     

非洲猪瘟病毒结构蛋白p54的优化表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为了实现非洲猪瘟病毒(Africanswinefevervirus,ASFV)p54基因在大肠杆菌中的高效表达，同时建立以ASFV-p54重组蛋白为抗原的间接ELISA抗体检测方法，本试验根据Gen Bank(序列号：NC＿044943.1)公布的ASFV p54的基因序列，设计一对特异性引物，扩增构建p GEX-6P-1-p54原核表达质粒，在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行复制，经IPTG诱导表达，对重组蛋白利用SDS-PAGE分析和免疫印迹鉴定正确后，进行表达条件优化，并纯化重组蛋白。随后用ASFV-p54重组蛋白为包被抗原，通过条件优化、特异性试验、敏感性试验和重复性试验，建立一种稳定的血清ASFV抗体检测方法。结果显示，ASFV p54基因成功克隆到p GEX-6P-1原核表达载体中，得到p GEX-6P-1-p54原核表达质粒；转化E. coli菌株BL21(DE3)中，经诱导表达得到重组蛋白，大小为46k Da；成功建立测定ASFV抗体的间接ELISA方法，优化后确定最佳包被浓度为1.2μg/mL，待检血清最佳稀释倍数1∶100，最佳封闭液为1%BSA，酶标抗体最佳稀...     

非洲猪瘟病毒结构蛋白p54的原核表达与反应原性鉴定

p54蛋白为非洲猪瘟病毒(ASFV)的主要结构蛋白之一,参与病毒对靶细胞的吸附与进入。为深入研究p54结构蛋白的抗原性,根据GenBank序列号(MK128995)对应的E183L基因序列,设计1对特异性引物扩增其整个CDS区,并克隆至pET-30a(+)载体,构建了表达p54蛋白的重组质粒pET-30a(+)-p54。用BL21(DE3)转化该质粒,经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE电泳,可见重组质粒表达出1条分子量约为20 kDa的特异性条带,且重组表达蛋白以融合表达蛋白形式存在于上清。进一步通过His亲和层析法纯化目的蛋白,用ASFV阳性血清进行蛋白质免疫印迹反应,发现表达的重组p54蛋白能与ASFV阳性血清产生特异性反应,表明p54蛋白表达成功。本研究为ASFV抗体ELISA检测方法的建立奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒p72蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立非洲猪瘟病毒(ASFV)的血清学检测方法,本研究根据ASFV Georgia2007/1株基因组合成其p72全长基因,并将其克隆至p GEX6p-1载体,构建重组质粒pGEX6p-1-p72并经酶切、PCR和测序鉴定正确后转化BL21感受态细胞,经IPTG诱导表达后经SDS-PAGE和western blot鉴定,结果显示获得了可溶性表达且纯度较高的重组p72蛋白(rp72)。利用GST亲和纯化层析柱纯化,得到浓度为0.2 mg/mL的rp72。以rp72作为包被抗原,通过优化各反应条件建立检测猪血清中非洲猪瘟抗体的间接ELISA方法,结果显示,rp72最佳包被浓度为1.25μg/mL,封闭时间为37℃1 h;待检血清稀释度为1.100,孵育时间为37℃30 min;羊抗猪IgG-HRP孵育时间为37℃1 h。利用该方法检测280份阴性血清,确定其临界值为0.412。采用建立的间接ELISA抗体方法对PEDV、PRRSV、CSFV、PRV、TGEV、PPV、PCV、E. coli阳性猪血清进行检测,结果显示,除ASFV阳性对照为阳性外,其他病原阳性血清检测结果均为阴性,该方法特异性强;将非洲猪瘟抗体阳性猪血清2倍倍比稀释(1.100～1.6 400)后,利用该方法进行检测,结果显示其检测阳性血清的稀释度为1.3 200倍时OD_(450nm)值仍大于临界值,敏感性高于市售西班牙ASFV阻断ELISA试剂盒检测结果,本研究建立的方法敏感性较高;对该方法进行批内和批间重复性试验,结果显示批内和批间的变异系数均10%,重复性良好。利用本研究建立的ASFV ELISA抗体检测方法(p72)对184份临床血清进行检测,结果显示该方法敏感性为100%,特异性为98.70%;与ASFV阻断ELISA抗体检测试剂盒方法总符合率为98.91%,kappa值为0.961。本研究首次基于rp72建立的非洲猪瘟抗体间接ELISA检测方法具有良好的重复性、敏感性和特异性,为ASFV抗体检测提供了一种快速、精准、经济、高效的方法。     

非洲猪瘟病毒结构蛋白p54的优化表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为了实现非洲猪瘟病毒(Africanswinefevervirus,ASFV)p54基因在大肠杆菌中的高效表达,同时建立以ASFV-p54重组蛋白为抗原的间接ELISA抗体检测方法,本试验根据Gen Bank(序列号：NC＿044943.1)公布的ASFV p54的基因序列,设计一对特异性引物,扩增构建p GEX-6P-1-p54原核表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行复制,经IPTG诱导表达,对重组蛋白利用SDS-PAGE分析和免疫印迹鉴定正确后,进行表达条件优化,并纯化重组蛋白。随后用ASFV-p54重组蛋白为包被抗原,通过条件优化、特异性试验、敏感性试验和重复性试验,建立一种稳定的血清ASFV抗体检测方法。结果显示,ASFV p54基因成功克隆到p GEX-6P-1原核表达载体中,得到p GEX-6P-1-p54原核表达质粒;转化E. coli菌株BL21(DE3)中,经诱导表达得到重组蛋白,大小为46k Da;成功建立测定ASFV抗体的间接ELISA方法,优化后确定最佳包被浓度为1.2μg/mL,待检血清最佳稀释倍数1∶100,最佳封闭液为1%BSA,酶标抗体最佳稀...     

非洲猪瘟病毒p72蛋白杆状病毒表达系统的构建及其抗原性分析

为研究真核表达非洲猪瘟病毒(ASFV)主要结构蛋白p72,本研究从含ASFV p72基因全序列的重组质粒pGEX-6p-p72中扩增出1 941 bp的p72全长基因,将其插入于pFastBac HTa杆状病毒载体中,构建了重组质粒pFastBac HTa-p72,转化至感受态细胞DH10Bac中,获得重组杆粒rBacmid-p72。再将其转染至sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。Western blot和夹心法ELISA分析表明ASFV p72基因在昆虫细胞sf9中获得了正确表达,重组p72蛋白可以被特异性抗ASFV血清、p72单克隆抗体识别,表明该蛋白特异性强、活性稳定,具有良好的抗原性。为进一步研究p72蛋白的结构、功能和免疫学特性奠定基础。     

非洲猪瘟病毒p11.5蛋白的表达及其单克隆抗体的制备

为了制备非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)p11.5蛋白的特异性单克隆抗体,利用大肠杆菌表达系统,将密码子优化后的ASFV p11.5基因序列连接表达载体pET28a-SUMO,构建pET28a-SUMO-p11.5原核表达质粒,获得了可溶性的ASFV p11.5蛋白。经Western blot鉴定,重组ASFV p11.5蛋白可被ASFV标准阳性血清特异性识别,表明其具有良好的反应原性。将纯化后的p11.5蛋白免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤细胞法,制备了4株可稳定分泌抗ASFV p11.5蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。3株单克隆抗体重链亚类为IgG1,1株重链亚类为IgG2a,轻链亚类均为κ。采用p11.5蛋白为包被抗原的间接ELISA方法检测单克隆抗体的效价均不低于1∶102.4×10~4。经间接免疫荧光试验(IFA)鉴定,4株单克隆抗体,均不与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、猪流行性腹泻病毒发生交叉反应,但均能与ASFV反应,表明单克隆抗体具有良好的特异性和反应性。本试验为p11.5蛋白结构功能、免疫学特性及ASFV诊断试剂产品的研究提供了重要的生物材料。     

以原核表达的非洲猪瘟病毒pK205R蛋白为包被抗原的间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立快速检测非洲猪瘟病毒(ASFV)的血清学方法,本研究原核表达ASFV pK205R重组蛋白,并以其为包被抗原,通过反应条件优化,建立了一种快速的ASFV间接ELISA检测方法。结果显示,原核表达的ASFV pK205R蛋白约为44 ku,western blot证实表达蛋白具有良好的反应原性;以其作为包被抗原建立的ASFV抗体间接ELISA方法仅对ASFV血清检测为阳性,与猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、副猪嗜血杆菌及猪大肠杆菌阳性血清均无交叉反应,具有良好的特异性;该方法检测灵敏度为1∶2 560;批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%;利用该方法对临床样品检测的结果与国外商品化试剂盒检测结果符合率为100%。本研究建立的ASFV抗体间接ELISA方法为防止该病传入我国以及ASFV的实时监测提供技术储备。     

非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为制备非洲猪瘟病毒(ASFV)p30蛋白的单克隆抗体,以原核表达的重组p30蛋白为免疫原免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠,3次免疫后分离小鼠脾细胞并将其与SP2/0细胞进行融合,通过间接ELISA方法筛选,获得2株能稳定分泌抗ASFV p30蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。2株杂交瘤细胞从第10代开始均能稳定分泌抗体,细胞上清抗体效价均为1∶6 400。亚型鉴定结果显示,2株单克隆抗体的重链均属于IgG1,轻链均为κ型。Western blot和间接免疫荧光试验(IFA)结果显示,2株单克隆抗体均能与ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞发生特异性反应。试验结果为p30蛋白生物学和诊断方法研究提供了技术支持。