猪神经介素B受体基因慢病毒过表达载体的构建与鉴定

【目的】构建猪神经介素B受体(NMBR)基因慢病毒过表达载体,并检测其在猪Leydig细胞中的表达,为研究NMBR基因过表达在猪睾丸间质(Leydig)细胞中的功能提供参考。【方法】根据猪NMBR基因(GenBank登录号：KM058699)CDS序列设计并合成特异性酶切引物,通过RT-PCR扩增获得猪NMBR CDS全长序列,构建pMD19-T-NMBR质粒;通过XbaⅠ和EcoRⅠ对pCD513B-1和pMD19-T-NMBR质粒双酶切,构建pCD513B-1-NMBR重组质粒;将pCD513B-1-NMBR重组质粒与辅助质粒共转染人胚肾细胞(HEK-293T),转染48 h后通过荧光倒置显微镜观察细胞中绿色荧光蛋白(GFP)情况,收集细胞培养液上清获得猪NMBR基因过表达慢病毒,并通过倍比稀释法测病毒效价;然后将猪NMBR基因过表达慢病毒转染猪Leydig细胞,转染48 h后观察细胞中GFP表达,收集细胞并通过实时荧光定量PCR检测NMBR mRNA的表达情况。【结果】通过RT-PCR成功扩增获得猪NMBR CDS全长序列,大小为1 173 bp; pMD19-T-NMBR重组质...     

藏绵羊PRDX5基因的克隆及其在睾丸中的表达

过氧化物氧化还原酶5 (PRDX5)是一种硫氧还蛋白,参与机体多种生物学过程。为了研究PRDX5基因在藏绵羊(Ovis aries)睾丸发育和精子发生过程中的作用,本研究以不同发育阶段(3月龄、1周岁和3周岁)的藏绵羊为研究对象,克隆了PRDX5基因的CDS区,并对其进行生物信息学分析;通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、Western blot和免疫组织化学染色法,对PRDX5基因在藏绵羊睾丸不同发育阶段的表达和分布进行了检测。结果显示,PRDX5基因CDS区全长659 bp,可编码219个氨基酸;蛋白质结构预测显示PRDX5以α-螺旋为主,无信号肽;系统进化树显示,藏绵羊PRDX5基因与山羊(Capra hircus)亲缘关系最近;1周岁(性成熟期)和3周岁(成年)藏绵羊睾丸中PRDX5 mRNA相对表达量极显著(P <0.01)高于3月龄(性成熟前),但PRDX5蛋白表达量极显著(P <0.01)低于3月龄,且两者在性成熟后趋于稳定;PRDX5蛋白在藏绵羊睾丸不同发育阶段的支持细胞和间质细胞中均有表达。推测PRDX5基因可能通过调节细胞内ROS的水平影响精子发生...     

稳定表达IL-10的PK-15细胞的构建及其在PCV2增殖中的应用

【目的】 研究白细胞介素-10（IL-10）对猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）复制的影响,筛选PCV2高感染性细胞系和提高PCV2病毒滴度,为后续疫苗的研发及IL-10在PCV2感染中的作用研究提供参考。【方法】 利用PCR技术扩增猪IL-10基因,将目的基因与慢病毒表达载体（pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro）进行连接,获得重组质粒pCDH-CMV-IL-10,将其与包装质粒psPAX2和pMD2.G共转染293T细胞进行慢病毒包装。用收集的慢病毒液感染PK-15细胞,经嘌呤霉素筛选后得到细胞株PK-15-IL-10,对照组细胞分别命名为PK-15-pCDH和PK-15。PCV2感染PK-15-IL-10、PK-15-pCDH和PK-15细胞株后,在24、48和72 h分别收集细胞液,利用CCK-8检测细胞活力。利用实时荧光定量PCR和Western blotting检测IL-10基因的表达水平和PCV2的复制情况;利用间接免疫荧光试验（IFA）观察PCV2在细胞中的复制情况及测定PCV2的病毒滴度（TCID₅₀）。【结果】 试验成功构建了重组质粒pCDH-CMV-IL-10,将其与包装质粒psPAX2和pMD2.G共转染293T细胞后,48 h时细胞状态最好,荧光最强。分别收集共转染48和72 h的慢病毒液上清感染PK-15细胞,pCDH-CMV-IL-10组的荧光最强,将其在嘌呤霉素浓度为2.5 μg/mL的完全培养基中继续培养,获得仍有绿色荧光的稳转细胞株。实时荧光定量PCR和Western blotting检测发现,IL-10基因在pCDH-IL-10细胞株中的表达量明显高于对照组PK-15-pCDH和PK-15,PCV2的拷贝数增加了4倍,复制能力增强,且将病毒稀释连续传3代后,PK-15-IL-10细胞中的PCV2极显著高于PK-15细胞（P<0.01）。细胞增殖试验表明,猪IL-10基因在细胞中过表达对细胞活力无明显影响;IFA结果表明,PK-15-IL-10细胞中的荧光比PK-15细胞更强,PCV2在PK-15-IL-10细胞中的TCID₅₀在感染后48 h极显著高于PK-15细胞（P<0.01）。【结论】 本研究成功构建了pCDH-CMV-IL-10的慢病毒表达载体,并利用其感染PK-15细胞,继续培养后筛选出过表达IL-10的PK-15-IL-10细胞株,用PCV2感染该细胞株能促进PCV2在PK-15细胞中的复制。本试验结果为后期疫苗研究提供了参考,为进一步研究IL-10对PCV2在PK-15细胞中复制的影响奠定了基础。     

猪IL-18基因原核表达载体的构建及表达

以含新兴猪IL-18基因的真核质粒pcDNA3.1-pIL18为模板,扩增出新兴猪IL-18基因,将其定向克隆至原核表达载体pET32c和pET41c的SacⅠ和KpnⅠ位点,构建了原核表达载体pET32c-pIL18和pET41c-pIL18。经酶切和PCR鉴定,表明所构建的重组质粒为特异性新兴猪IL-18基因原核表达质粒。将该重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)细胞,筛选的阳性菌落经SDS-PAGE分析及Western-blotting分析,表明成功构建了表达重组猪IL-18的大肠埃希菌基因工程菌株。蛋白的可溶性分析表明,重组蛋白呈不可溶表达,在菌体内以不溶性的包涵体形式存在。     

GnIH过表达载体构建及其对小鼠睾丸间质细胞的作用研究

本试验通过构建GnIH过表达载体,探究其对小鼠睾丸间质细胞（TM3细胞系）的凋亡效应及睾酮合成的调节作用。从6~8周雄性小鼠睾丸组织中提取RNA,反转录获得cDNA样本,利用PCR扩增并纯化GnIH基因,应用T4连接酶将其连入PLVX-IRES-ZsGreen1载体,进一步转化到感受态菌中,通过PCR、双酶切及测序鉴定后提取质粒。随后将构建好的重组质粒转染TM3细胞系72 h,分为空质粒组和GnIH过表达组,通过显微镜观察细胞荧光、实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法、ELISA法和流式细胞术检测GnIH表达水平、细胞凋亡率及相关凋亡基因表达变化、睾酮分泌水平和睾酮合成酶基因表达水平。结果显示,GnIH扩增片段序列与参考序列一致,将GnIH过表达质粒转染至TM3细胞系72 h后,可见高强度绿色荧光,过表达组中GnIH基因水平极显著升高（P<0.01）,表明GnIH过表达载体构建成功且在TM3细胞系中高表达。转染72 h后,与空质粒组相比,过表达组中细胞凋亡率极显著升高（P<0.01）,凋亡基因P53和Bax/Bcl-2表达量比值也极显著升高（P<0.01）。与空质粒组相比,过表达组中睾酮浓度极显著降低（P<0.01）。与此同时,睾酮合成相关酶基因P450 scc mRNA表达量极显著降低（P<0.01）,StAR、3β-HSD和P450c17 mRNA表达量显著降低（P<0.05）,17β-HSD mRNA表达量在两组间无显著性差异（P>0.05）。综上所述,在体外培养的TM3细胞中过表达GnIH能诱导TM3细胞凋亡、抑制睾酮分泌且降低睾酮合成相关酶的基因表达水平,推断GnIH在小鼠睾丸间质细胞生长和睾酮合成过程中发挥负调控作用。本研究可为揭示GnIH在雄性哺乳动物生殖调控过程中的作用提供科学理论依据。     

香猪睾丸间质细胞TAS1R3基因干扰后对自噬相关因子的影响

旨在探究TAS1R3基因通过mTOR对从江香猪自噬相关基因表达的影响。本试验选择30日龄健康雄性从江香猪3头,采集睾丸组织并培养出睾丸间质细胞。将构建成功的干扰载体和空载体转染至细胞中,利用qRT-PCR检测其对TAS1R3基因表达影响,运用qRT-PCR和Western blot检测TAS1R3基因干扰后对味觉受体第一家族一号受体(TAS1R1)、细胞外信号调节激酶1(ERK1)、细胞外信号调节激酶2(ERK2)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、BECN1和微管相关蛋白1轻链3β(MAP1LC3B)表达的影响。结果表明,当TAS1R3基因被干扰后,相较于shRNA-NC对照组,TAS1R1、ERK1、ERK2、mTOR基因mRNA表达量均极显著降低(P<0.01),自噬因子BECN1和MAP1LC3B表达量极显著升高(P<0.01)。Western blot结果表明当TAS1R3基因被干扰后,与shRNA-NC对照组相比,蛋白T1R3、T1R1、p-mTOR、p-S6K1、p-ERK12均极显著降低(P<0.01),而自噬蛋白Beclin 1表达量极显著升高(P<...     

猪Mx1基因真核表达载体的构建及表达

根据GenBank中猪Mx1基因序列设计并合成引物,对Mx1基因ORF区全长1 992个碱基进行扩增。将扩增片段与pVax1载体连接,构建pVa-Mx1-ORF真核表达载体。将构建的表达载体导入BHK-21和HEK-293细胞进行表达,用RT-PCR和间接免疫荧光对表达产物进行鉴定。结果表明,所构建的pVa-Mx1-ORF表达载体在BHK-21和HEK-293细胞中成功表达。     

猪A-FABP基因真核表达载体的构建及其组织表达

本实验以长白猪背最长肌为实验材料,进行组织RNA的提取及A-FABP基因的克隆,构建p EGFPN1-A-FABP真核表达载体,并通过脂质体转染成纤维细胞,48 h观察荧光表达。同时应用荧光定量PCR法检测猪7种不同组织(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、腿肌)中A-FABP基因的差异表达。结果表明:成功构建p EGFP-N1-A-FABP融合表达载体,并在细胞中表达绿色荧光蛋白;A-FABP基因在7种组织中均有表达,其中背最长肌和腿肌中A-FABP基因的表达量最高,与其他组织相比差异极显著(P0.01),而脾脏和肾脏中的表达量相对于心脏、肝脏和肺脏差异显著(P0.05),而A-FABP基因表达量在心脏、肝脏和肺脏中差异不显著(P0.05)。表明该基因能够在真核载体和细胞中表达,并且在猪不同组织的表达具有差异性。     

绒山羊Hoxc13基因过表达载体的构建

Hoxc13基因在毛囊形成、毛发生长、毛囊正常形态维持过程中扮演着一个重要角色.为了研究绒山羊Hoxc13的功能,根据GenBank中Hoxc13基因序列设计引物,采用重叠延伸PCR技术,分离并克隆了内蒙古绒山羊Hoxc13基因的cDNA序列,成功构建了该基因的过表达载体pECFP-Hoxc13.     

民猪AMPD1基因的克隆与真核表达载体的构建

为了研究腺苷-磷酸脱氨酶1(AMPD1)基因多态性,试验采用比较基因组学与克隆测序相结合的方法对比分析民猪AMPD1基因的DNA及cDNA全序列,并构建pcDNA3.1(+)-AMPD1真核表达载体。结果表明:AMPD1基因的13个外显子上有20个点突变,第1外显子第39位碱基突变造成MsⅡ酶切位点的缺失,第1 367位碱基突变造成BspAⅠ、MgoⅠ、NphⅠ等31个酶切位点的缺失并且成功构建了pcDNA3.1(+)-AMPD1真核表达载体。     

OLR1基因在3T3-L1细胞分化过程中的表达谱及过表达载体构建

本实验旨在研究氧化型低密度脂蛋白受体1(Oxidized Low-Density Lipoprotein Receptor 1,OLR1)基因在小鼠前脂肪细胞3T3-L1分化过程中的表达规律,阐明OLR1基因过表达载体的构建方法.收集3T3-L1细胞不同分化阶段的RNA,利用荧光定量PCR检测基因的表达量.根据GenB...     

猪IL-2基因真核表达载体的构建及在酵母中的表达

用真核表达引物从pGEM-IL-2重组质粒中扩增出猪IL-2基因，将目的基因和真核表达载体pPIC9K连接转入E．coli的JM109中，得到了猪pPIC9K-IL-2重组表达质粒。通过电激法将经SalⅠ酶切线性化的pPIC9K-IL-2质粒转化到巴斯德毕赤酵母GS115感受态细胞中，利用甲醇诱导表达，经SDS-PAGE电泳分析，表明在摇床水平及发酵罐中均表达出约17ku大小的分泌性目的蛋白，采用Sephadex G-100分子筛层析对其表达产物进行纯化，纯化结果理想。     

猪圆环病毒2型H株cap基因原核表达载体的构建与表达

利用PCR技术从临床病料中提取病毒DNA,扩增出猪圆环病毒PCV-2核衣壳蛋白(Cap)基因。将其克隆到原核表达载体pET-32a中,构建了表达载体pET-H2,转化至大肠杆菌BL21中,用ITPG诱导表达。SDS-PAGE分析显示,重组蛋白主要以不溶性包涵体形式表达,与预期大小30 ku相符;Western-blotting分析表明,表达产物能与抗猪PCV2阳性血清发生反应。     

猪圆环病毒2型ORF2基因的克隆及其真核表达载体的构建

为了给猪圆环病毒2型的诊断和基因工程疫苗的研究奠定基础,试验根据GenBank中猪圆环病毒2型的核酸序列设计了1对引物,采用PCR方法从疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的死亡仔猪病料组织中扩增出了ORF2基因,将其克隆到pMD18-T载体上,筛选获得了重组质粒pT-ORF2.结果表明:以重组质粒pT-ORF2为模板设计出1对引物,扩增出含ORF2主要抗原位点的区段566 bp,经Bam H Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切,将回收的ORF2基因转移入真核表达载体pcDNA3.0,成功构建了重组表达质粒pcDNA3.0-ORF2.     

Kiss-1基因在不同发育阶段五指山猪睾丸中的表达及定位研究

试验采用荧光定量技术研究亲吻素-1(Kiss-1)基因mRNA在30、60、80(初情期)和120日龄五指山公猪睾丸中的表达情况,并采用免疫组化技术定位其表达。结果显示,Kiss-1mRNA在五指山猪睾丸中的表达随着年龄的增长表达量逐渐升高,到初情期(80日龄)时达到最高(P0.05),随后到120日龄时显著降低(P0.05);免疫组化结果显示,睾丸间质细胞、精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、圆形精子细胞及间质细胞中均发现Kiss-1阳性反应产物,而在精子中未发现Kiss-1阳性表达产物。结果证实,Kiss-1基因在五指山猪精子发生过程中发挥着重要作用。     

猪带绦虫TS018基因真核表达载体的构建及其表达

采用PCR从重组克隆载体pGEM—TSO18中扩增出猪带绦虫六钩蚴TSO18基因，与毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9k相连接，构建重组表达载体pPIC9k—TSO18，转化大肠埃希氏菌JM109，经测序证实，基因序列完全正确。制备重组质粒pPIC9k—TSO18，用SalⅠ线性化，并电转化毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115，使重组表达载体与酵母染色体发生同源整合。采用G418抗性梯度法筛选得到高拷贝重组菌株，以甲醇进行诱导表达，SDS—PAGE和Western-blotting分析结果表明，诱导表达的培养上清中表达出具有反应活性的16ku重组蛋白，目的蛋白约占培养上清液中蛋白总量的80％以上，诱导72h目的蛋白表达量为0．5mg／mL。     

猪传染性胃肠炎病毒样颗粒在杆状病毒表达系统中的体外组装

利用RT-PCR方法扩增TGEV M、sM和N结构蛋白基因,分别将M、sM和N基因克隆入杆状病毒供体质粒pFastBacTMDual,获得转移质粒pFastBacTM Dual-M、pFastBacTM Dual-sM和pFastBacTM Dual-N,将重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞,经抗性与蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组质粒Bacmid-M、Bacmid-sM和Bacmid-N,在Cellfection作用下,将杆状病毒重组质粒转染昆虫细胞sf9,获得重组杆状病毒rBac-M、rBac-sM和rBac-N。通过间接免疫荧光试验检测显示,重组蛋白在杆状病毒感染的sf9细胞中获得正确表达。将重组杆状病毒按照以下感染组合进行TGEV VLPs组装的研究:rBac-M、rBac-sM、rBac-N单独感染sf9细胞,rBac-M+rBac-N、rBac-M+rBac-sM联合感染sf9细胞。结果表明,rBac-M、rBac-M+rBac-sM、rBac-M+rBac-N感染的昆虫细胞可见类病毒样粒子,rBac-sM、rBac-N单独感染sf9细胞未见形成明显的病毒样颗粒。试验结果为进一步研究TGEV结构蛋白在病毒装配过程中的作用提供了理论依据。     

传染性喉气管炎病毒gB基因的主要免疫原片段在大肠杆菌中的表达

利用DNASIS等软件分析传染性喉气管炎病毒（ILTV）WG株的gB蛋白抗原性，筛选出一段抗原性较强的片段，该片段位于gB蛋白的403位至686位氨基酸残基之间。设计引物，引入双酶切位点EcoR Ⅰ，Sal Ⅰ，将目的片段t—gB插入原核表达载体pET30a（＋），得到重组表达质粒pET-tgB并转化到大肠杆菌BL21中，经IPTG诱导后，表达分子量为37Ku的融合蛋白His—tgB，表达量占菌体蛋白的40．6％。Western blot分析表明，His—tgB具有免疫反应性。重组蛋白免疫兔之后可以产生针对ILTV gB的特异性抗体。     

干扰和过表达BAMBI基因对猪卵泡颗粒细胞表型和功能的影响

为研究转化生长因子-β（TGF-β）信号通路中的骨形态发生蛋白和激活素膜结合抑制剂（bone morphogenetic protein and activin membrane-bound inhibitor,BAMBI）基因对猪卵泡颗粒细胞的调控作用,本研究设计构建BAMBI干扰和过表达载体,并将构建好的干扰（pSIREN-BAMBI-sh1、pSIREN-BAMBI-sh2、pSIREN-BAMBI-sh3）和过表达（pcDNA3.1-BAMBI）重组质粒转染猪卵泡颗粒细胞,通过实时荧光定量PCR技术进行有效片段的筛选,并对TGF-β信号通路下游基因（TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD5）和细胞凋亡基因（Bax、Bcl-2）mRNA的表达水平进行检测。最后,用MTT法和流式细胞术检测BAMBI干扰和过表达对卵泡颗粒细胞增殖及凋亡的影响。结果表明,BAMBI干扰和过表达载体成功构建,pSIREN-BAMBI-sh2抑制BAMBI表达的效果最好,干扰效率最高。干扰BAMBI时,TGF-βRⅡ表达量显著上升（P<0.05）,使得SMAD2、SMAD3的表达量显著上升（P<0.05）;过表达BAMBI时,TGF-βRⅡ表达显著下降（P<0.05）,使得SMAD2、SMAD3的表达量显著下降（P<0.05）;上调BAMBI可显著抑制猪卵泡颗粒细胞增殖,极显著促进猪卵泡颗粒细胞凋亡（P<0.01）。研究结果表明,BAMBI基因显著影响猪卵泡颗粒细胞的生长发育,可能通过调节TGF-β信号通路间接影响猪的繁殖性能。     

PEDV分离株S1基因的重组杆状病毒真核表达

为了研究猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)分离株(PEDV/LA/2014/02)纤突蛋白(S1)的真核表达及其反应原性,本研究利用杆状病毒真核表达系统表达出重组His-PEDV-S1蛋白。利用在线软件分析PEDV S1基因在sf9细胞内的稀有密码子,经优化密码子后的基因进行人工合成,合成后的PEDV S1基因被克隆至杆状病毒的穿梭载体(pFastBac HT A)中,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞进行重组,PCR方法验证后将重组成功的杆状病毒基因组转染sf9细胞,获得包装成功的杆状病毒,该病毒进一步接种sf9细胞,显微镜观察重组病毒引起的细胞病变,RT-PCR方法验证PEDV S1基因的mRNA表达水平,SDS-PAGE、Western blotting方法验证重组PEDV S1蛋白的表达及其反应原性。结果显示,试验成功构建了重组穿梭质粒pFastBac HT A-PEDV-S1(pSL598),成功包装表达了PEDV S1的重组杆状病毒,重组杆状病毒能使sf9细胞出现细胞变大、胞内有空泡等典型病变,PEDV S1基因的mRNA获得表达,重组蛋白His-PEDV-S1在sf9细胞中得到表达,蛋白质大小为83 ku左右,主要存在于细胞沉淀中,表达的重组蛋白能与小鼠抗His抗体和猪抗PEDV阳性血清反应,说明该蛋白具有较好的反应原性。本研究为研制PEDV新流行毒株新型亚单位疫苗和防控该毒株的流行提供了材料。