猪神经介素B受体基因慢病毒过表达载体的构建与鉴定

【目的】构建猪神经介素B受体(NMBR)基因慢病毒过表达载体,并检测其在猪Leydig细胞中的表达,为研究NMBR基因过表达在猪睾丸间质(Leydig)细胞中的功能提供参考。【方法】根据猪NMBR基因(GenBank登录号：KM058699)CDS序列设计并合成特异性酶切引物,通过RT-PCR扩增获得猪NMBR CDS全长序列,构建pMD19-T-NMBR质粒;通过XbaⅠ和EcoRⅠ对pCD513B-1和pMD19-T-NMBR质粒双酶切,构建pCD513B-1-NMBR重组质粒;将pCD513B-1-NMBR重组质粒与辅助质粒共转染人胚肾细胞(HEK-293T),转染48 h后通过荧光倒置显微镜观察细胞中绿色荧光蛋白(GFP)情况,收集细胞培养液上清获得猪NMBR基因过表达慢病毒,并通过倍比稀释法测病毒效价;然后将猪NMBR基因过表达慢病毒转染猪Leydig细胞,转染48 h后观察细胞中GFP表达,收集细胞并通过实时荧光定量PCR检测NMBR mRNA的表达情况。【结果】通过RT-PCR成功扩增获得猪NMBR CDS全长序列,大小为1 173 bp; pMD19-T-NMBR重组质...     

猪Utx慢病毒过表达/干扰载体的构建和病毒包装

UTX(ubiquitously transcribed TPR gene on the X chromosome)作为H3K27me2/3的去甲基酶,能够调控动物发育过程,并有着重要的生物学作用。根据猪Utx预测序列,扩增Utx的CDS区全长序列。利用Utx的CDS区序列信息,构建pCD513B-CMV-Utx过表达载体,设计并合成干扰shRNA和阴性对照寡核苷酸片段。其中干扰shRNA及阴性对照通过退火形成双链DNA,并插入pCD513B-U6慢病毒干扰载体。采用双酶切的方法和DNA测序鉴定重组载体。通过干扰和过表达载体质粒共转293T细胞,利用qRT-PCR筛选出最有效的干扰序列。重组质粒与其他3种慢病毒辅助包装质粒(pRsv-Rev、pGag-Pol、pVSV-G)共转染293T细胞包装慢病毒。结果表明,本试验成功扩增Utx基因的全长序列,且成功构建了Utx的过表达和干扰载体。qRT-PCR筛选出pCD513B-U6-Utx-shRNA-3干扰效率最显著,干扰效率为70%。本试验成功包装出慢病毒Lenti-Utx-shRNA、Lenti-NC和Lenti-Utx,测定的病毒滴度分别为6.1×107 TU/mL、4.8×107 TU/mL和3.9×105 TU/mL。此试验为进一步在猪源细胞中进行Utx基因的研究奠定基础。     

稳定表达猪CD163受体的MARC-145细胞系的构建

为了构建稳定表达猪CD163(pCD163)受体的MARC-145细胞系,从猪肺泡巨噬细胞(PAMs)中提取总RNA,通过RT-PCR方法扩增pCD163基因,将pCD163基因克隆到慢病毒载体pLVX-IRES-mCherry中,获得重组质粒pLVX-pCD163-IRES-mCherry。将重组质粒pLVX-pCD163-IRES-mCherry与辅助质粒psPAX2、VSVG共转染293T细胞,获得具有感染能力的慢病毒粒子,使用慢病毒感染MARC-145细胞,用嘌呤霉素初步筛选阳性细胞,采用终点稀释法筛选出稳定表达pCD163受体的MARC-145细胞。通过RT-PCR扩增pCD163基因及测序分析表明细胞系基因组中存在pCD163受体编码序列,IFA和Western blot试验验证了pCD163受体蛋白在细胞系中稳定表达。用不同谱系的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GXNN1396(lineage 8)、GXNN202004a(lineage 1)、GXGG202007(lineage 3)分别感染稳定表达pCD163的MARC-145细胞系与MARC-145细胞,PRR...     

小鼠ERO1α基因慢病毒干扰载体的构建与鉴定

针对小鼠ERO1α基因构建短发卡RNA(Short hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体。根据NCBI中小鼠ERO1α基因序列,设计3条针对ERO1α的shRNA序列和1条阴性对照shRNA序列。将shRNA序列连接到慢病毒载体pCD513B-U6上,同时进行PCR鉴定及测序,分别命名为pCD513B-ERO1α-shRNA和pCD513B-NC-shRNA。将构建好的重组质粒和包装辅助质粒共转染HEK 293T细胞,包装产生慢病毒。将所得病毒悬液进行浓缩,同时梯度稀释转导HEK 293T细胞,检测病毒滴度。浓缩后的慢病毒转导RAW 264.7细胞,通过RT-qPCR和Western blot技术进行有效片段的筛选。之后,将筛选的慢病毒转到多种细胞系或者原代细胞,用RT-qPCR和Western blot技术检测ERO1α基因的表达情况。PCR及测序结果表明,重组慢病毒干扰载体pCD513B-ERO1α-shRNA构建成功,所包装的慢病毒其病毒滴度为5×10~7 TU/mL～10×10~7 TU/mL。RT-qPCR和Western blot结果表明,pCD513B-ERO1α-shRNA-3抑制ERO1α表达的效果最好,干扰效率在80%左右。pCD513B-ERO1α-shRNA-3能够转导多种细胞,并显著抑制ERO1α的表达,干扰效率在70%～90%。成功构建针对小鼠ERO1α基因的shRNA重组慢病毒载体,为进一步研究ERO1α功能奠定了技术基础。     

TGEV双基因嵌合表达质粒pVAX—S—N的构建及体外表达

采用RT-PCR扩增猪传染性肠胃炎病毒(TGEV)SC-H株S基因5′端主要抗原位点片段和N基因,插入pMD19-T载体,经酶切与测序鉴定后,构建重组质粒19T-N与19T-S.从T载体上将S、N基因切下,以亚克隆方法插入真核表达载体pVAX1,构建嵌合表达S、N基因的重组质粒pVAX-S-N.对重组质粒PCR与酶切鉴定后,以脂质体转染法转染COS7细胞,间接免疫荧光检测转染后细胞外源基因的表达情况.结果表明,重组质粒构建正确且在COS7细胞中得到表达,转染的细胞呈现特异性荧光.真核表达质粒pVAX-S-N的成功构建为进一步研究TGEV核酸疫苗奠定了物质基础.     

家兔DEPTOR基因过表达和shRNA干扰慢病毒载体的构建与验证

为了构建DEPTOR基因的过表达载体和shRNA干扰慢病毒载体,并验证载体的有效性,试验采用RT-PCR方法扩增兔DEPTOR基因编码区(CDS)序列,得到DEPTOR基因片段,同时合成DEPTOR基因的shRNA干扰序列。将DEPTOR基因片段分别连接到慢病毒真核表达载体pLVX-IRES-ZsGreen1和融合表达载体pEGFP-N1上,获得过表达载体pLVX-DEPTOR-IRES-ZsGreen1和pEGFP-DEPTOR;将shRNA干扰序列连接到慢病毒干扰载体pSicoR-Ef1a-mCh上,获得shRNA干扰慢病毒载体pSicoR-shRNA-508。用过表达载体转染HEK 293T细胞,72 h后观察荧光蛋白的表达情况并收集细胞,RT-PCR检测细胞水平上DEPTOR基因的表达情况。使用多质粒共同转染法,将过表达载体pEGFP-DEPTOR与shRNA干扰慢病毒载体pSicoR-shRNA-508按照1∶1比例转染HEK 293T细胞,72 h后观察荧光蛋白的表达情况并收集细胞,采用实时荧光定量PCR方法检测shRNA干扰序列对DEPTOR基因表达的干扰效率。结果表明：...     

小鼠Zbtb38基因慢病毒过表达质粒的构建与鉴定

本研究旨在构建Zbtb38（zinc finger and BTB domain containing 38）基因慢病毒过表达质粒载体。以小鼠脊髓组织为材料,采用重叠延伸PCR方法扩增小鼠Zbtb38基因的CDS序列,分别设计Zbtb38 CDS序列前段扩增引物1和后段扩增引物2,再以上述两对引物的扩增产物作为模板,设计引物3并进行融合PCR扩增,由此得到Zbtb38 CDS全序列。将获得的Zbtb38基因CDS全序列连接到质粒pGM-T,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,采用直接PCR鉴定阳性克隆并进行测序验证。利用XhoⅠ和BamHⅠ双酶切方法将Zbtb38 CDS序列连接至慢病毒载体Plvx-puro,获得穿梭质粒Plvx-puro-Zbtb38,再与慢病毒包装质粒共转染293T细胞生产慢病毒颗粒。结果显示,引物1扩增产物包含Zbtb38 CDS全序列的第1-1 794 bp,扩增产物实际测序长度为1 772 bp,引物2扩增产物包含Zbtb38 CDS全序列的第1 762-3 594 bp,扩增产物实际测序长度为1 818 bp,说明分段扩增目的片段已成功。引物3扩增的预期融合产物及菌落PCR扩增产物均包含Zbtb38 CDS全序列（3 594 bp）,与NCBI数据库Zbtb38基因的CDS序列比对后的重合率达99.99%,表明Zbtb38 CDS序列扩增成功。实时荧光定量PCR检测结果显示,病毒滴度达3.25×10⁸ Tu/mL,达到普通动物注射标准要求,提示慢病毒载体构建成功。综上所述,本试验成功构建了小鼠Zbtb38基因慢病毒过表达质粒载体。     

中国2个地方品系猪SLA-3原核表达载体构建及表达

为构建中国地方品系荷包猪及莱芜黑猪SLA-3(命名为SLA-3-HB和SLA-3-LW)原核表达载体及表达目的蛋白,试验通过PCR扩增获得SLA-3胞外区基因,并克隆至pMD19-T Simple载体,转化大肠杆菌Top10感受态细胞,酶切及测序筛选阳性重组质粒;重组质粒经酶切回收,目的片段进一步连接pET-21a(+)表达载体,并转化大肠杆菌BL21感受态细胞,IPTG诱导目的基因的表达;SDS-PAGE检测目的蛋白。结果显示,PCR成功扩增SLA-3-HB及SLA-3-LW胞外区,大小约850 bp,目的基因成功克隆至pMD19-T Simple载体,并筛选序列正确的阳性重组质粒。进一步研究证实,SLA-3-HB及SLA-3-LW成功连接到表达载体pET-21a(+),插入片段长度均为831 bp。经诱导后,SLA-3-HB及SLA-3-LW均成功表达,表达蛋白大小为31 ku,相对表达含量达到40%。本研究成功构建了中国地方品系荷包猪及莱芜黑猪SLA-3原核表达载体,为进一步研究其结构和功能奠定基础。     

猪Ghrelin基因的克隆及原核表达

从猪下丘脑、胃等组织中提取总RNA，根据已发表的猪的Ghrelin mRNA序列设计合成引物，通过RT-PCR进行cDNA扩增，获得了282bp的片段。将该片段克隆于pMD-18T载体后进行序列分析，确认PCR产物为Ghrelin cDNA。从阳性克隆中提取质粒，经NheⅠ和XhoⅠ双酶切，回收282bp的目的片段，定向克隆到pET-28a表达载体中，提取质粒并再次转化到BL21（DE3）中，成功地筛选出阳性克隆。经IPTG诱导阳性菌，通过SDS-PAGE检测出猪Ghrelin基因的表达．     

PEDV和TGEV双基因共表达载体pVAXD-PS1-TS的构建及体外表达

采用RT-PCR扩增猪传染性肠胃炎病毒（TGEV）SC-H株S基因N端主要抗原位点片段（大小约为1 916bp）和猪流行性腹泻病毒（PEDV）SC-L株S1基因（大小约为2 367bp）,插入pMDl9-T simple载体,经酶切与测序鉴定后,构建重组质粒pMD19-T-TS与pMD19-T-PS1。从T载体上将PS1、TS基因切下,以亚克隆方法插入双启动子真核表达载体pVAXD,构建能同时表达TGEV S基因和PEDV S1基因的重组质粒pVAXD-PS1-TS。对重组质粒进行PCR与酶切鉴定后,以脂质体转染法转染COS7细胞,间接免疫荧光检测转染后细胞外源基因的表达情况。结果表明,重组质粒构建正确且能够在COS7细胞中得到表达,转染的细胞呈现特异性荧光。真核表达质粒pVAXD-PS1-TS的成功构建为进一步研究PEDV和TGEV的二联核酸疫苗奠定了基础。     

气肿疽梭菌CctA基因真核表达载体的构建与鉴定

为了构建气肿疽梭菌细胞毒素A(CctA)基因真核表达载体,探讨制备安全有效气肿疽核酸疫苗的可行性,试验根据NCBI上气肿疽CctA基因序列,通过Primer Premier 5.0设计了1对特异性引物用于基因扩增,将PCR扩增的CctA基因克隆至pMD19-T载体构建重组质粒pMD19-T-CctA,对测序正确的基因进行序列分析后亚克隆至pVAX-1真核表达载体,并对构建的pVAX1-CctA真核表达质粒进行PCR和双酶切鉴定。结果表明:成功扩增了CctA基因目的片段,并获得了与预期大小相符的重组质粒pMD19-T-CctA和真核表达质粒pVAX1-CctA。说明试验成功构建了气肿疽CctA基因真核表达载体。     

猪肌生成抑制素成熟蛋白编码序列真核表达载体的构建

从猪肌生成抑制素(MSTN)cDNA序列中设计引物。以pMD18-T-MSTN质粒为模板，PCR扩增猪MSTN成熟蛋白编码序列，该片段全长1095bp。将所得片段与pMD18-T载体连接，构建重组质粒pMT—mpMSTN，将其转化到大肠杆菌DH5a中，成功地筛选到阳性克隆。双酶切重组质粒pMT—mpMSTN和真核表达载体pcDNA3．1，连接目的片段与载体pcDNA3．1，转化大肠杆菌DH5a，经酶切、PCR及测序分析，表明成功地构建了真核表达质粒pcDNA3．1-mpMSTN。     

鸡α干扰素基因真核表达载体pCAGGS-IFN-α的构建及其在293T细胞中的表达

为了构建鸡α干扰素基因真核表达载体,试验采用RT-PCR方法从鸡胚成纤维细胞中扩增α干扰素基因序列,将扩增产物定向插入到pMD18-T克隆载体中,进行序列测定;测序正确的质粒经EcoRⅠ和SacⅠ双酶切,将目的基因片段定向克隆到真核表达载体pCAGGS中,构建重组质粒pCAGGS-IFN-α;将重组质粒转染293T细胞,使用间接免疫荧光、Western-blot等方法检测目的蛋白。结果表明:已成功扩增出582 bp大小的鸡α干扰素基因片段,测序结果与GenBank报道的序列基本一致。说明阳性重组质粒pCAGGS-IFN-α真核表达载体构建成功,能正确表达鸡α干扰素。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因B和C抗原位点片段在杆状病毒中的表达

应用RT-PCR方法扩增了猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)TH-98株S基因5′端含有B、C抗原位点的片段。将该片段亚克隆至杆状病毒转移载体pMelBac B中。重组质粒经纯化,与线性化的杆状病毒共转染Sf9昆虫细胞,经4轮蚀斑筛选,获得了纯化的重组病毒,最终实现了在昆虫细胞内的蛋白表达。经Dot-ELISA进行抗原性分析,结果表明重组蛋白具有抗原性。本研究猪传染性胃肠炎血清学诊断方法的建立提供了必要的物质基础。     

稳定高效表达猪CD163的Marc-145细胞系的构建与鉴定

试验旨在构建一株高效表达猪CD163(pCD163)的Marc-145细胞系,为猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的临床分离和疫苗生产奠定基础。根据GenBank中序列设计引物从猪肺泡巨噬细胞(PAM)中扩增pCD163基因,将其插入真核表达载体pCI-neo构建真核表达质粒pCI-pCD163,将该重组质粒转染Marc-145细胞,通过G418筛选、单克隆化并扩大培养筛选获得表达pCD163的Marc-145细胞系,IFA、Western blotting鉴定其表达情况。IFA结果显示,构建的pCD163-Marc细胞系中荧光明显亮于普通Marc-145细胞;Western blotting结果显示,pCD163-Marc细胞系中CD163蛋白表达量约为对照Marc-145细胞中CD163蛋白表达量的8.7倍。且该细胞系可稳定传至20代,各代次之间表达量无差异。证明高效表达猪CD163的Marc-145细胞系构建成功。     

家兔Ⅰ型肽载体(PepTⅠ)基因的克隆与原核表达

用real-time PCR方法扩增家兔PepTⅠmRNA序列,通过原核表达体外获得家兔PepTⅠ蛋白,旨在制备多克隆抗体。试验通过RT-PCR方法成功扩增出2 001bp的家兔PepTI基因片段,设计特异性引物成功扩增出抗原表位相对集中的1 071bp大小的片段,构建重组表达质粒,获得融合蛋白。结果显示:家兔PepTⅠ基因片段成功的连接到pMD18-T载体上,重组克隆载体双酶切后回收目的片段分别连接到原核表达载体pET-32a、pET-28a,经转化提取质粒测序验证后表明,成功构建原核表达载体pET-32a-P、pET-28a-P,将重组质粒转化至感受态细胞BL21(DE3)后IPTG诱导,成功表达出PepTⅠ融合蛋白,目的蛋白相对分子质量大小约为44 000,与预期试验结果相符。结果表明:本试验成功扩增出家兔PepTⅠmRNA序列,并且通过原核表达获得家兔PepTI融合蛋白。     

猪ASC及Ub基因的克隆及真核表达重组质粒的构建

炎症小体不仅参与机体的天然免疫反应,同时还参与机体抗病毒等多种宿主防御反应。在多种疾病相关信号通路反应中都伴随着蛋白质的泛素化修饰。NOD样受体(NLRs)介导的炎症小体信号通路中,凋亡相关点状样蛋白(ASC)是关键的接头蛋白。为了解猪瘟病毒(CSFV)感染对ASC泛素化水平的影响,通过RT-PCR从猪血管内皮细胞(ECs)中扩增获得ASC和泛素(Ub)的全长cDNA双链片段,连接至克隆载体pMD-18T,获得重组克隆质粒pMD-ASC和pMD-Ub。双酶切pMD-ASC获得ASC目的序列,连接至pcDNA3.1-Flag,双酶切pMD-Ub获得Ub目的序列,连接至pcDNA3.0-HA,获得重组表达质粒pcDNA3.1-Flag-ASC和pcDNA3.0-HA-Ub。将pcDNA3.1-Flag-ASC和pcDNA3.0-HA-Ub转染ECs,Western blot在蛋白水平检测ASC和Ub的表达。结果表明,成功构建了带有Flag标签的ASC真核表达质粒和带有HA标签的Ub真核表达质粒,且在ECs中获得高效表达,为进一步体外研究CSFV调控猪血管内皮细胞ASC泛素化的机制提供了实验基础。     

鹅细小病毒延边株VP1基因真核表达质粒构建及其在Vero细胞中的表达

根据GenBank已发表的鹅细小病毒(GPV)B株基因序列,设计并合成1对含有Xho I和BamH I酶切位点的特异性引物,以提取的GPV基因组DNA为模板,经PCR扩增得到了1 163 bp的目的片段,并将该片段克隆至pMD-18T simple载体中,再将其亚克隆至真核表达载体pVAX1中,构建重组表达质粒pVAX1-VP1。经PCR鉴定、酶切分析和序列测定比较,证实了重组质粒的正确性。通过脂质体法将pVAX1-VP1转染Vero细胞,经间接荧光抗体检测,在Vero细胞表面可见特异性荧光。经RT-PCR扩增得1 163 bp的目的片段。该研究为GPV核酸疫苗的研制奠定了基础。     

猪圆环病毒2型武威株ORF2基因序列分析及真核表达载体的构建

根据GenBank中猪2型圆环病毒（PCV2）的核酸序列，设计了1对引物，采用PCR方法从疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的死亡仔猪组织病料中扩增出了ORF2基因，将其克隆到pMD18-T载体上，筛选获得了重组质粒pMD18-T-ORF2。对此重组质粒进行序列测定分析，结果表明，克隆的ORF2基因与其他PCV-2的ORF2核苷酸序列同源性为92．0％～93．3％，推导氨基酸序列的同源性为82．9％～84．6％。重组质粒pMD18-T-ORF2经Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切，将回收的ORF2基因转移入真核表达载体pIRES。成功构建了重组质粒pIRES-ORF2。     

陆川猪GPR1基因真核表达载体构建及组织表达谱分析

试验旨在构建陆川猪G蛋白偶联受体1(G protein-coupled receptor 1,GPR1)基因真核表达载体,并对其组织表达谱进行分析。采用RT-PCR技术从10周龄陆川猪皮下脂肪组织中扩增出GPR1基因CDS区后,使用常规分子克隆手段构建含GPR1基因片段的真核表达载体pEGFP-N1-GPR1,利用双酶切和测序对重组质粒pEGFPN1-GPR1进行鉴定,并以脂质体法将重组质粒转染3T3-L1细胞24h后观察细胞荧光表达情况。收集所转染3T3-L1细胞并提取其总RNA,实时荧光定量PCR进一步检测GPR1真核表达载体表达情况;提取6头10周龄陆川猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、皮下脂肪总RNA,实时荧光定量PCR检测GPR1基因mRNA在陆川猪各组织中的表达量。结果表明,陆川猪GPR1基因CDS全长1 068bp,成功将其连接至pEGFP-N1真核表达载体,重组表达载体pEGFP-N1-GPR1质粒和空载pEGFP-N1质粒所转染3T3-L1细胞均能表现出绿色荧光,且空白对照组并未表现出绿色荧光。实时荧光定量PCR结果证实,GPR1基因在重组质粒试验组的表达量极显著高于空载质粒组(P0.01)。GPR1基因在10周龄陆川猪肝脏中表达量最高,在心脏、脾脏、肺脏、肾脏、皮下脂肪中均有表达,在背最长肌中几乎不表达。本试验成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-GPR1,并获得了GPR1基因组织表达谱,为进一步研究GPR1基因对陆川猪脂肪沉积的影响提供参考。