2018-2020年中国部分省市猪流行性腹泻病毒S1基因的监测及遗传变异分析

【目的】 调查中国规模化猪场猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的流行情况。【方法】 利用RT-PCR检测方法对2018-2020年采集于全国11个省市318个规模化猪场的2 391份样品进行PEDV核酸检测,对30份阳性样品进行S1全基因扩增与测序,并利用MegAlign、Mega 7.0等软件进行分析。【结果】 2018-2020年,猪场PEDV核酸阳性率分别为48.57%、10.96%和4.72%,样品PEDV核酸阳性率分别为28.97%、8.27%和7.50%,猪场和样品PEDV核酸阳性率呈现逐年下降的趋势。S1基因相似性分析显示,获得的30株毒株全部为GⅡ基因型,其中17株毒株为GⅡa基因亚型、5株毒株为GⅡb亚型、8株毒株为GⅡc亚型,GⅡa基因亚型毒株为2018-2020年流行的主要毒株类型;30株毒株S1基因序列之间核苷酸相似性为93.0%~99.5%, 氨基酸相似性为91.7%~100%,其中22株毒株与2017-2018年流行的GⅡ基因型毒株相比S1氨基酸序列表现出特征性插入和缺失。【结论】 本研究结果为监测和分析中国PEDV的变异和演化提供了临床数据,为猪流行性腹泻防控和疫苗研制提供了参考。     

湖南省部分地区养猪场PEDV的检测及S1基因序列变异分析

为了解2020—2021年湖南省部分地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)遗传变异情况,试验从10个暴发仔猪腹泻的猪场采集40份样品进行PEDV核酸检测,统计阳性率,并对部分阳性样品的S1基因进行扩增、测序,并进行序列同源性分析和遗传进化分析。结果表明：场阳性率为60.0%,40份组织样品中有21份为PEDV阳性,阳性率为52.5%;6个阳性猪场随机挑选的6份样品PEDV毒株S1基因扩增得到大小均为1 700 bp左右的目的条带,其核苷酸和对应推导的氨基酸序列相似性分别为97.2%～99.8%和95.4%～99.5%,与国内外流行的PEDV变异株(G2型)对应核苷酸序列相似性分别为96.8%～99.2%和95.0%～98.7%;与PEDV疫苗株(CV777株,G1型)对应核苷酸序列相似性分别为91.2%～92.3%和88.9%～90.8%。进一步遗传进化分析结果发现,获得的6个PEDV毒株均属于G2亚群,与我国流行的PEDV变异株所属分支相隔很近。说明PEDV是导致湖南省部分地区仔猪腹泻的常见病原,且均为PEDV变异株。     

猪流行性腹泻病毒贵州流行株N基因的克隆、测序与生物信息学分析

为了了解贵州省猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea, PED)的流行情况,试验对猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)贵州流行株(GZ2022)N基因序列进行克隆、测序,并利用DNAStar、ProtParam、ProtScale等生物信息学分析软件对PEDV-GZ2022株N基因的同源性和遗传进化地位,以及N蛋白的分子特征和潜在功能进行分析预测。结果表明：PEDV-GZ2022株N基因大小约为1 364 bp,编码441个氨基酸;PEDV-GZ2022株N基因核苷酸序列与GenBank中的PEDV参考毒株N基因的相似性为95.5%～99.8%,与PEDV经典毒株CV777 N基因核苷酸序列的相似性为95.6%,与SDLY2020毒株N基因核苷酸序列的相似性高达99.8%,PEDV-GZ2022毒株与经典毒株CV777关系相隔较远,与PEDV变异株GⅡ-b位于同一分支;PEDV-GZ2022株N蛋白中含有较多的疏水性氨基酸,为疏水性蛋白;该蛋白质存在4个N糖基化位点和37个O糖基化位点,有31个丝氨酸、...     

2020—2021年我国部分地区猪流行性腹泻病毒S1、M和ORF3基因遗传进化分析

为了解2020—2021年我国部分地区猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)毒株变异及遗传进化情况，试验从多个地区的51家猪场采集340份疑似感染PEDV的猪小肠组织、粪便和肛拭子，提取病毒核酸后采用RT-PCR方法扩增S1、M和ORF3基因并测序，与GenBank中PEDV参考毒株进行比对分析，利用生物信息学软件构建遗传进化树，分析核苷酸序列同源性及氨基酸序列。结果表明：共获得57份PEDV阳性样品，来源于14家猪场，猪场阳性率为27.5%,并对从阳性猪场获得的14株毒株进行命名。与经典毒株CV777相比，14株PEDV毒株的S1、M和ORF3基因均出现不同程度的氨基酸突变。在14株毒株的S1基因中，Heyuan2021-7毒株位于G1-2分支，其余13株位于G2分支，14株毒株与参考毒株GD-A核苷酸序列的相似性较高，为89.3%～99.9%,存在多处氨基酸的缺失和插入。在M基因中，14株毒株位于G2分支且与参考毒株FR-001核苷酸序列的相似性为98.1%～99.7%,只存在氨基酸突变。在ORF3基因中，FC2021-1、GD...     

2020-2021年河南省猪流行性腹泻病毒流行株遗传进化及S蛋白变异分析

2020-2021年在河南省18个地区共收集499份发生腹泻的仔猪临床样品,采用RT-PCR进行猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)筛查。结果显示,共检测出162份阳性样品,阳性率为35.2%。对其中21株PEDV流行毒株S基因进行了测序、同源性比对和遗传进化分析,结果显示21株PEDV流行毒株之间核苷酸同源性为96.9%～100%,氨基酸同源性为95.2%～100%。与52株2011-2019年国内流行毒株之间的核苷酸同源性为95.1%～99.5%,氨基酸同源性为91%～99.8%。遗传进化结果显示,21株PEDV毒株均属于GⅡb群。氨基酸序列比对显示,流行毒株S蛋白存在7处新的且规律的氨基酸突变。本试验对现阶段我国所流行的PEDV S基因进行测序分析,为了解PEDV流行毒株遗传变异趋势和研发新的有效疫苗提供参考。     

大理某规模化猪场仔猪流行性腹泻诊断及防制

2021年10月初,大理某规模化猪场仔猪出现严重腹泻、呕吐等症状,且病死率较高。为确定发病原因,采集腹泻死亡仔猪淋巴结、肺脏、肝脏、肾脏和小肠等组织样品,采用real-time PCR法分别检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪德塔冠状病毒、猪轮状病毒和猪传染性胃肠炎病毒等核酸,结果仅在肠组织病料中检测到PEDV核酸,未检测到其他病原核酸。进一步对1份PEDV阳性样品的S1基因片段进行RT-PCR扩增、测序与分析,发现该毒株S1基因部分序列与国内流行变异株(JN599150.1)同源性为99.8%,与CV777疫苗株同源性仅92.5%,提示该毒株为变异株。研究结果表明,该猪场仔猪腹泻是由PEDV变异株感染所引起,通过采取系列防制措施后该病得到有效控制。     

河北省部分地区猪流行性腹泻病毒流行病学调查与分析

本研究旨在初步了解河北省部分地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)的流行和遗传变异情况,于2016-2017年从保定市及周边地区采集腹泻猪粪便样品327份,采用RT-PCR检测PEDV流行情况,同时对获得的11株PEDV的S基因部分基因(S1)进行扩增、测序和分析。结果显示:327份粪便样品中有84份检测为PEDV阳性,检出率为25.08%;获得的11株PEDV分离株S1基因序列核苷酸同源性为95.8%～100.0%,与疫苗株CV777、LZC株相比,核苷酸同源性为89.5%～90.8%;本次研究获得的11株PEDV分离株均位于G2亚群,与2010年后国内流行的PEDV分离株相距较近,但与PEDV经典毒株亲源性较远。本次研究表明,河北省流行的PEDV毒株多为变异株,生猪养殖企业(户)应注意且加强猪场生物安全。     

河北省邢台市及周边地区猪流行性腹泻病毒流行情况调查及S1基因序列分析

为初步调查河北省邢台市及周边地区猪流行性腹泻(PED)分子流行病学情况，试验于2022年1月—12月从河北省邢台市及周边县(市、区)采集疑似感染PED猪肠道病料或新鲜粪便共206份，采用荧光定量PCR技术检测样品猪流行性腹泻病毒(PEDV)阳性率；同时采用RT-PCR法扩增部分PEDV阳性病料S1基因序列，根据S1基因序列特征分析毒株基因型和变异情况。结果显示：共47份样品为PEDV核酸阳性，平均阳性率为22.82%,其中腹泻仔猪、育肥猪和母猪样品PEDV检出率分别为27.05%、15.15%和20.83%;采用RT-PCR法共扩增6份PEDV阳性样品S1基因部分序列，进一步序列分析发现5个毒株属于PEDV变异株，1个毒株属于PEDV经典株。研究结果表明，河北省邢台市及周边地区PED流行情况较严重，且同时流行PEDV经典株和变异株，但PEDV变异株为优势基因型。     

新疆阿克苏地区部分猪场流行性腹泻病毒的检测与分析

为了解新疆阿克苏地区某猪场猪流行性腹泻感染情况,采集疑似患有猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea, PED)的7日龄以内仔猪肠道内容物,使用猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M基因的特异性引物进行扩增,克隆鉴定后送测序,分析该基因序列。结果表明:该基因片段长度为663 bp。通过构建系统进化树及同源性分析发现,该毒株与GenBank中公布的2011年以后国内外分离的主要M基因毒株同源性在96.7%以上,其中与湖北分离株C3-HB2017亲缘关系最近,同源性高达99.5%,与该猪场疫苗株亲缘关系相对较远,同源性为98%,存在13个碱基位点的突变。说明该猪场存在猪流行性腹泻病毒感染,且推测可能为变异毒株的感染。该试验为新疆阿克苏规模化猪场PED的防控提供基础数据。     

猪流行性腹泻病毒邹平分离株S1基因的遗传进化分析

山东邹平某规模化猪场哺乳仔猪出现水样腹泻、呕吐等症状,剖检可见肠壁变薄,肠内充满黄色液体,疑似猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染所致,采集肠道内容物送实验室检测与分析,结果显示,样品PEDV阳性,S1序列同源性分析结果显示,PEDV邹平分离株与参考毒株核苷酸同源性为89.5%～98.7%,属于G2b变异毒株分支。     

贵州省部分PEDV流行株ORF3基因克隆与遗传进化分析

为探究贵州省猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行毒株的遗传进化情况,对2017—2022年贵州省不同地区13份PEDV阳性腹泻样本进行ORF3全基因扩增、克隆、测序,使用DNAstar、MEGA 7.0软件,对所得序列核苷酸和氨基酸同源性以及突变和遗传进化情况进行分析。结果显示：13份PEDV阳性样品的ORF3基因序列全长均为675 bp,编码224个氨基酸;13条克隆序列的核苷酸和氨基酸同源性分别为95.1%～100%和96.4%～100%;13条克隆序列与经典毒株CV777株ORF3基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为95.9%～97.3%和94.7%～96.4%,同源性较低;与经典毒株CV777株相比,13条克隆序列在G160A、C243T、C274T、G301A、C450T、A497G存在相同的核苷酸突变,存在4个相同的氨基酸位点突变(V21A、V54I、A101T、N166S);13条克隆序列所在毒株在遗传进化上全部属于GⅡ型,其中GZ220514、GZ342、GZ224、GZ219、GZ423隶属于GⅡb亚型,GZ210112、GZ210129、GZ210220、GZ210714、...     

猪流行性腹泻病毒流行株S全基因的遗传进化与重组分析

为了解猪流行性腹泻病毒(PEDV)的遗传变异情况,本研究对2016—2018年间从河南和山西等地多个规模化猪场随机采集的25份患有腹泻仔猪小肠及内容物提取RNA进行PEDV RT-PCR检测,阳性样品进行S全基因克隆、遗传进化与重组分析。结果显示,25份腹泻仔猪样品中检测出18个PEDV阳性样品,成功克隆18株PEDV毒株S全基因序列,与GenBank中发表的30条PEDV S基因序列进行比较分析,核苷酸同源性均在92.8%以上,存在多处碱基点突变、插入与缺失,且SX-TY1-2017毒株在3 291～4 132 nt位置处发生重组,可能是由亲本株CH/HNZZ47/2016和HN-KF-2017重组产生的。基于S全基因遗传进化树结果,克隆的18株PEDV属于G2群且位于不同分支,表明PEDV流行株在2016—2018年间出现一定的变异。     

6株猪流行性腹泻病毒N基因的克隆与分析

为了解安徽省猪流行性腹泻病毒（PEDV）的遗传变异情况,采用胶体金试纸条检测安徽省境内发生疑似猪流行性腹泻病的病猪粪便（2013—2017年）;对PEDV抗原阳性猪样品,利用RT-PCR方法扩增其PEDV N基因,并进行测序和序列分析。结果发现,经胶体金试纸条检测确认了6个猪流行性腹泻发病猪场;对来自该6个猪场的病料样品或病毒传代培养物进行RT-PCR扩增和测序,共获得6株PEDV流行毒株的N基因序列,其序列全长均为1 326 bp,将其分别命名为N12、N22、N32、N42、N52和N62。核苷酸同源性分析显示,6株PEDV分离株N基因之间序列同源性为94.8%~99.8%。其中,5株PEDV分离株（N12、N22、N32、N52和N62）与PEDV疫苗株、经典毒株、2011年之前的我国分离株（LZC、CHS）的同源性较低（94.1%~96.3%）,亲缘关系较远;与2011年后国内外PEDV分离株存在较高同源性（96.9%~99.2%）,亲缘关系较近;而N42正好相反。该研究表明,近年来安徽各地猪场以PEDV新变异毒株的流行为主。     

2017年江西部分地区PEDV分子流行病学调查

为了解江西地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)的流行和变异情况,本研究利用RT-PCR方法对2017年采自江西省部分地区规模化猪场182份腹泻仔猪小肠组织和粪便样品进行检测,并设计了2对引物对37份阳性病料的S基因进行扩增、克隆及序列测定,以及与GenBank中登录的22株PEDV S基因参考序列进行遗传进化分析。结果显示,37株PEDV江西流行株的S基因序列长为4 158或4 161 bp,编码1 385或1 386个氨基酸,全部为Group 1型,与美国流行毒株较为接近,而与欧洲毒株(Br1/87)及疫苗株(CV777)亲缘关系较远;37株PEDV中有36株为G1-1亚群,1株为G1-2亚群;37株PEDV江西毒株间的S基因核苷酸序列同源性为96.9%～100.0%,氨基酸序列同源性为96.1%～100.0%,与22株参考毒株的核苷酸、氨基酸序列同源性分别为92.7%～100.0%和91.5%～100.0%;相较于CV777疫苗株,PEDV江西流行毒株的S基因存在碱基缺失、插入和位点突变现象。本研究从分子流行病学角度证实了2017年江西部分地区PEDV的流行与变异情况,为指导江西省PEDV的科学防控提供了参考依据。     

浙江省猪流行性腹泻病毒S1基因克隆与序列分析

本研究旨在分析浙江省猪流行性腹泻病毒（PEDV）的遗传变异情况,利用实时荧光定量RT-PCR方法对2015-2016年浙江省内收集的58份猪腹泻样品进行检测,设计2对特异性引物对16份来自浙江不同地区PEDV阳性样品的S1基因进行RT-PCR扩增、克隆及序列测定,并应用生物信息学软件对16株PEDV浙江毒株的S1基因进行分析。结果显示,48份样品为PEDV阳性。16个毒株之间S1基因片段核苷酸和氨基酸同源性分别为93.1%~99.8%和92.4%~99.7%,与疫苗株CV777的核苷酸同源性为92.3%~95.7%,氨基酸同源性为90.7%~95.7%。与疫苗株CV777相比,15个毒株在S1基因区域存在着15个核苷酸插入和6个核苷酸缺失。系统进化分析表明,大部分毒株与国内外流行的基因Ⅱ型PEDV毒株亲缘关系较近,15个毒株与2011-2016年中国流行的基因Ⅱ型PEDV毒株核苷酸和氨基酸同源性均在96.6%以上;与早期分离的CV777株、LZC株亲缘关系较远,核苷酸和氨基酸同源性均在93.4%以下;1个毒株（ZJ16NB6）与国内外流行的S-INDEL样毒株较近,核苷酸和氨基酸的同源性较高,均在98.4%~99.5%之间。本研究结果表明,2015-2016年浙江省仔猪腹泻主要是由PEDV感染引起的,浙江省流行的PEDV同时存在着基因Ⅱ型和S-INDEL样毒株,但以基因Ⅱ型毒株为主。     

我国部分省份猪流行性腹泻病毒M基因的克隆测序及遗传进化分析

为了解我国部分省份猪流行性腹泻病毒(PEDV)的遗传进化情况,试验采用RT-PCR方法对2014—2017年采集的源自河南、河北、山西、山东、甘肃、湖北、江西等地区不同猪场的98份腹泻样品进行了PEDV检测,并对25份PEDV阳性样品进行M基因的克隆与测序和遗传进化分析。结果表明:25株M基因序列长度均为618 bp;25株M基因序列间核苷酸同源性为98.2%~100%,其编码的氨基酸序列同源性为97.8%~99.6%,与经典毒株CV777及国内外流行毒株核苷酸同源性为97.7%~98.6%,氨基酸序列的同源性分别为97.8%~98.7%;25株M基因序列与国内外早期分离株(如CV777、CH/S等代表毒株)不在一个进化分支上,与近年来分离株处在一个进化分支上。说明PEDV M基因一直处于变异进化过程中。     

江苏地区猪流行性腹泻流行病学调查及病原S基因序列分析

为探究江苏省内猪场猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)的流行和遗传变异情况,采集江苏省13个地级市规模猪场和屠宰场健康猪群的鼻拭子和肛拭子样品,通过RT-PCR方法检测PEDV,并对部分阳性样品进行S基因序列扩增、测序及遗传进化分析。结果显示：259份猪鼻拭子样品中,PEDV阳性检出率为10.42%(27/259);178份猪肛拭子样品中,PEDV阳性检出率为9.55%(17/178)。选取的8株PEDV代表株的核苷酸序列同源性在99.2%～100%之间,氨基酸序列同源性在95.2%～97.1%之间,与国内流行毒株SD-M、JS2008的同源性最高,核苷酸序列同源性达到97%以上;遗传进化分析显示,8株PEDV代表株属于同一群,与经典毒株CV777、DR13亲缘关系较近。本研究初步明确了江苏地区健康猪群中猪流行性腹泻流行状况和PEDV遗传演化特点,为有效防控猪流行性腹泻提供参考。     

2020-2021年新疆地区猪流行性腹泻病毒S基因遗传变异分析

为了解新疆地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)的遗传变异情况，于2020-2021年从新疆地区规模化猪场采集到326份临床仔猪腹泻病料和肠组织，利用RT-PCR方法对PEDV进行检测，选取部分PEDV阳性样品进行S基因全序列的克隆和测序，并对其序列、遗传进化和抗原表位进行分析。结果显示，326份样品中共有152份样品为PEDV阳性，阳性率为46.6%。选取的11份阳性样品中的PEDV S基因核苷酸(氨基酸)同源性为99.0%～100%(98.2%～99.9%),与GenBank中登录的PEDV参考毒株核苷酸(氨基酸)同源性为92.6%～98.0%(91.2%～97.7%),与经典株CV777核苷酸(氨基酸)同源性为93.1%～93.4%(92.3%～92.7%)。遗传进化分析显示，11份阳性样品均位于GIIa亚群，与中国疫苗株CV777处于不同的分群，说明新疆部分地区PEDV流行株与疫苗毒株CV777亲缘关系较远。序列比对结果显示，11份阳性样品中的PEDV S蛋白均存在氨基酸的插入和缺失，中和表位的COE区域变异较大，这可能会降低常规疫苗的免疫保护作用。结果表明，从分子水平明确了2020...     

浙江省猪流行性腹泻病毒S1基因克隆与序列分析

本研究旨在分析浙江省猪流行性腹泻病毒(PEDV)的遗传变异情况,利用实时荧光定量RT-PCR方法对2015-2016年浙江省内收集的58份猪腹泻样品进行检测,设计2对特异性引物对16份来自浙江不同地区PEDV阳性样品的S1基因进行RT-PCR扩增、克隆及序列测定,并应用生物信息学软件对16株PEDV浙江毒株的S1基因进行分析。结果显示,48份样品为PEDV阳性。16个毒株之间S1基因片段核苷酸和氨基酸同源性分别为93.1%~99.8%和92.4%~99.7%,与疫苗株CV777的核苷酸同源性为92.3%~95.7%,氨基酸同源性为90.7%~95.7%。与疫苗株CV777相比,15个毒株在S1基因区域存在着15个核苷酸插入和6个核苷酸缺失。系统进化分析表明,大部分毒株与国内外流行的基因Ⅱ型PEDV毒株亲缘关系较近,15个毒株与2011-2016年中国流行的基因Ⅱ型PEDV毒株核苷酸和氨基酸同源性均在96.6%以上;与早期分离的CV777株、LZC株亲缘关系较远,核苷酸和氨基酸同源性均在93.4%以下;1个毒株(ZJ16NB6)与国内外流行的S-INDEL样毒株较近,核苷酸和氨基酸的同源性较高,均在98.4%~99.5%之间。本研究结果表明,2015-2016年浙江省仔猪腹泻主要是由PEDV感染引起的,浙江省流行的PEDV同时存在着基因Ⅱ型和S-INDEL样毒株,但以基因Ⅱ型毒株为主。     

1例PED的实验室诊断与思考

猪流行性腹泻是导致仔猪腹泻的重要传染病,及时准确地诊断对该病的防控具有重要意义。2021年初,湖南娄底某规模化猪场仔猪发病,临床以呕吐、腹泻和消瘦等症状为主,剖检后取肠组织样品送至实验室进行诊断,提取核酸后以PCR/RT-PCR法检测PEDV、TGEV、PORV和PDCOV等病原核酸,仅检出PEDV核酸,未检测到其他病原核酸。通过进一步序列分析,结果表明,该毒株的S1基因与国内流行的变异株同源性最高,提示该猪场流行的毒株为变异株。