蓝狐MITF-M基因序列扩增及生物信息学分析

试验旨在研究蓝狐MITF-M基因核心启动子活性区、转录因子结合位点、基因编码蛋白结构及功能,为探究该基因的表达调控机制提供理论依据。从成年蓝狐背部皮肤组织中采集1 cm×1 cm样品,采用RT-PCR扩增及测序技术首次获得MITF-M基因序列3 880 bp（包括5'侧翼区2 262 bp、CDS区1 260 bp、3'侧翼区358 bp）,编码419个氨基酸残基。生物信息学分析结果显示,蓝狐MITF-M基因5'侧翼区存在潜在的启动子区域（-86~-336 bp）,且发现TATA框、CAAT框、GC框和CRE等调控元件及CREB、LSF和Sp1等多种转录因子。MITF-M基因编码的蛋白是定位于细胞核和细胞质的不稳定、可溶性亲水蛋白质。亚细胞定位结果提示该蛋白在细胞核、细胞质和线粒体的概率较高,分别为65.2%、17.4%和8.7%。DNAMAN软件对MITF-M基因编码蛋白的二级结构预测发现,该蛋白由α螺旋（33.66%）、β折叠（16.66%）和无规卷曲（49.68%）组成,且不存在跨膜区域和信号肽。蓝狐与其他物种MITF-M基因编码的氨基酸序列同源性对比和系统进化树分析均提示蓝狐与犬的遗传亲缘关系最近,与哺乳动物和禽类均具有较高的同源性（>89.1%）,说明MITF-M基因编码区在物种进化过程中较为保守。本研究为深入研究MITF-M基因调控狐狸被毛颜色的分子遗传机制奠定了理论基础。     

蓝狐MITF-M基因序列扩增及生物信息学分析

试验旨在研究蓝狐MITF-M基因核心启动子活性区、转录因子结合位点、基因编码蛋白结构及功能,为探究该基因的表达调控机制提供理论依据。从成年蓝狐背部皮肤组织中采集1cm×1cm样品,采用RT-PCR扩增及测序技术首次获得MITF-M基因序列3 880bp(包括5′侧翼区2 262bp、CDS区1 260bp、3′侧翼区358bp),编码419个氨基酸残基。生物信息学分析结果显示,蓝狐MITF-M基因5′侧翼区存在潜在的启动子区域(-86~-336bp),且发现TATA框、CAAT框、GC框和CRE等调控元件及CREB、LSF和Sp1等多种转录因子。MITFM基因编码的蛋白是定位于细胞核和细胞质的不稳定、可溶性亲水蛋白质。亚细胞定位结果提示该蛋白在细胞核、细胞质和线粒体的概率较高,分别为65.2%、17.4%和8.7%。DNAMAN软件对MITF-M基因编码蛋白的二级结构预测发现,该蛋白由α螺旋(33.66%)、β折叠(16.66%)和无规卷曲(49.68%)组成,且不存在跨膜区域和信号肽。蓝狐与其他物种MITF-M基因编码的氨基酸序列同源性对比和系统进化树分析均提示蓝狐与犬的遗传亲缘关系最近,与哺乳动物和禽类均具有较高的同源性(89.1%),说明MITF-M基因编码区在物种进化过程中较为保守。本研究为深入研究MITF-M基因调控狐狸被毛颜色的分子遗传机制奠定了理论基础。     

鸡堆型艾美耳球虫新基因的克隆与生物信息学分析

试验旨在对堆型艾美耳球虫（Eimeria acervulina）孢子化卵囊新基因EST序列进行克隆与生物信息学分析。通过RACE技术扩增从E. acervulina cDNA表达文库中筛选获得的EST序列,得到EST全长cDNA序列,利用多种生物信息学分析软件对其编码蛋白进行分析和预测。结果表明,该EST序列为E.acervulina孢子化卵囊阶段新基因,GenBank登录号为EU590120;该基因含1个492 bp的开放阅读框,编码163个氨基酸,理论分子质量为17.049 ku,等电点为6.69,酸性氨基酸8个,碱性氨基酸8个,分子式为C₇₆₁H₁₂₂₃N₁₉₉O₂₁₉S₁₂;总平均亲水性（GRAVY）为0.731;该蛋白有信号肽,为分泌性蛋白;具有4个跨膜结构,在105～115、28～32和132～138位之间有很强的疏水性;具有1个蛋白激酶C磷酸化位点、1个N-糖基化位点、2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、4个N端豆蔻酰基化位点。因此根据生物信息学全面预测和分析,发现该基因所编码的蛋白具有较多的生物学功能位点和潜在的抗原表位区域。     

IFITM1基因克隆及其在不同生长阶段牦牛各组织中的表达分析

为鉴定牦牛IFITM1基因并分析其在不同生长阶段牦牛5种组织中的转录水平和蛋白表达量.本研究采用根据普通牛IFITM1基因设计的引物,PCR扩增牦牛IFITM1基因并利用生物信息学软件分析其序列,结果显示,获得牦牛546 bp的IFITM1基因cDNA序列,其中编码(CDS)区为375 bp,编码124个氨基酸残基.牦...     

牦牛CAPS基因克隆及生物信息学分析

钙磷蛋白(calcyphosine, CAPS)是一种钙结合蛋白,对维护生物体内钙磷平衡起着重要作用。本研究克隆了牦牛CAPS基因的CDS区序列,分析了其核苷酸序列,并进行了生物信息学分析。结果表明,牦牛CAPS基因CDS区全长570 bp,编码189个氨基酸;编码蛋白的分子式为C₉₀₅H₁₄₃₄N₂₆₆O₂₉₇S₈,分子量为21 049.43 Da,理论等电点为4.69,脂溶指数为75.29,不稳定指数为37.52,是疏水性稳定蛋白;系统进化分析表明,牦牛CAPS基因CDS区与普通牛和瘤牛的基本一致,与水牛、绵羊和猪的序列一致性较高。本研究为深入研究牦牛CAPS的生理功能提供了参考资料。     

山羊CREM基因的克隆与生物信息学分析

研究旨在克隆山羊睾丸CREM基因cDNA全序列并进行生物信息学分析。通过提取山羊睾丸总RNA,利用qPCR和RACE技术,扩增山羊PHGPx基因cDNA序列。结果表明,山羊睾丸CREM基因cDNA全长序列为1 183bp(登录号:HM 802260),包含有960bp的开放阅读框,编码319个氨基酸;山羊CREM蛋白二级结构功能区域属于bZIP转录因子家族,在319个氨基酸的序列中,73到115之间有一个"pKID"区域,259~316之间含有一个典型的"BRLZ"结构。构建蛋白质氨基酸分子进化树,结果显示山羊与牛亲缘关系最近。该研究结果将为CREM基因表达分子调控研究提供一定的理论依据。     

绵羊TPT1基因CDS区遗传结构及组织表达研究

本研究旨在克隆绵羊TPT1基因序列,通过生物信息学分析探究其序列特征及编码蛋白的结构与功能,通过实时荧光定量PCR检测TPT1基因在绵羊不同组织中的空间表达规律。以小尾寒羊为研究对象,PCR扩增获得TPT1的完整编码区(CDS)区并进行测序,对所得序列进行生物信息学分析。结果显示:绵羊TPT1基因CDS为660 bp,编码219个氨基酸,核酸序列与山羊的同源性最高。TPT1蛋白为亲水性蛋白,主要分布在线粒体,存在16个磷酸化位点;二级结构主要包含α-螺旋和无规则卷曲,与预测的三级结构相似。定量PCR结果显示TPT1基因在肾中表达量最高,其次是肌肉、肝、脂肪和肺,在心和脾中表达量最低。结果表明,TPT1基因在生物进化中是保守的,但其表达的蛋白质结构不稳定,在绵羊不同组织中均有表达。     

美仁牦牛ILK基因克隆及生物信息学分析

为探究美仁牦牛ILK基因的结构与功能,利用PCR技术克隆了美仁牦牛背最长肌ILK基因CDS区序列,并利用在线软件预测和分析其编码氨基酸序列的生物信息学特征。结果表明,美仁牦牛ILK基因编码区长度1 359 bp,共编码452个氨基酸,是一种主要在细胞质中发挥生物学功能的亲水性蛋白;美仁牦牛ILK基因编码蛋白分子式C₂₂₇₆H₃₅₈₀N₆₅₆O₆₄₇S₃₀,分子量51 447.27 Da,原子总数7 189,理论等电点8.30,不稳定性指数41.47,共有27个磷酸化位点;同时,亚细胞定位结果表明,美仁牦牛ILK基因主要分布在细胞质中;系统进化树表明,美仁牦牛与野牦牛和普通牛亲缘关系最近,与非洲爪蟾亲缘关系最远。     

猪ERK6基因cDNA序列及功能分析

克隆猪ERK6基因cDNA序列,分析其生物学特性,为进一步研究该酶的功能提供信息资料。据已报道的人及小鼠ERK6基因cDNA序列设计引物,采用RT-PCR技术和3′RACE扩增猪ERK6基因序列,并进行序列测定。结果表明:分离cDNA共1 603 bp,其中包含ORF全长1 101 bp,编码367个氨基酸,与人、鼠氨基酸序列92%同源;利用生物信息学软件分析出此蛋白的理化特性并预测了其一级和二级结构。     

兰坪乌骨绵羊PDGFRL基因编码区序列扩增及其生物信息学分析

本研究根据Genbank载入的普通绵羊血小板衍生生长因子受体样蛋白(PDGFRL)基因序列设计特异性引物。利用PCR技术扩增乌骨绵羊PDGFRL基因编码区片段,经测序后对序列进行比对分析,并采用生物信息学软件对编码区序列和蛋白质结构进行预测。结果表明:兰坪乌骨绵羊PDGFRL基因编码区序列全长1128bp,编码375个氨基酸;同普通绵羊进行核苷酸序列同源性比对发现同源性为99.73%,发现3个碱基同义突变;生物信息学分析表明不同物种PDGFRL基因编码区核苷酸序列与氨基酸序列具有较高的保守性;蛋白结构预测显示,PDGFRL蛋白空间结构主要由α螺旋、β折叠和无规则卷曲构成。     

一株肠炎沙门氏菌鞭毛基因FliC的克隆及生物信息学分析

本研究旨在对肠炎沙门氏菌（Salmonella Enteritidis）鞭毛蛋白FliC基因进行克隆，并对所获序列进行生物信息学分析。提取该菌基因组DNA作为模板，参考GenBank中肠炎沙门氏菌FliC基因序列设计1对引物，利用PCR克隆获得FliC基因，将其插入到克隆载体中进行测序，应用生物信息学软件分析该基因的核苷酸和氨基酸序列，利用BLAST进行同源性比对，并构建系统进化树，同时对该基因编码蛋白的理化性质、亲水性、信号肽、跨膜结构域、糖基化位点和B细胞抗原表位、二级结构、三级结构等进行分析。结果显示，试验成功克隆了1 518 bp的目的基因，编码505个氨基酸。同源性比对发现，FliC基因相对保守，与大肠杆菌属有较高的同源性。该蛋白的化学分子式为C₂₂₅₄H₃₇₀₁N₆₅₇O₈₀₃S₄，理论分子质量为52.981 ku，理论等电点为4.91；不稳定指数为16.86，是稳定存在的亲水蛋白质。结构分析结果显示，该蛋白没有信号肽或跨膜结构域，但具有8个N-糖基化位点、13个O-糖基化位点和60个磷酸化位点，同时还含有26个B细胞线性结合位点和5个T细胞结合位点。二级结构分析显示，α-螺旋、β-转角、延伸链和无规卷曲分别占43.76%、3.76%、20.99%和31.49%。本试验成功克隆了肠炎沙门氏菌鞭毛基因FliC，并对其序列结构进行了分析，为进一步研究鞭毛在肠炎沙门致病过程中的作用及基因工程疫苗的研制提供理论依据。     

绵羊Txl-2基因CDS区克隆及其生物信息学分析

本研究以绵羊睾丸组织为材料,利用RT-PCR技术获得绵羊硫氧还蛋白类蛋白2(Thioredoxin like protein 2,Txl-2)基因的CDS区序列,并对其进行生物信息学分析。结果表明,克隆得到的绵羊Txl-2基因CDS区为795 bp,编码264个氨基酸。生物信息学分析结果表明,Txl-2编码的蛋白无跨膜区、信号肽和N-糖基化位点,存在多个磷酸化位点;预测出了Txl-2蛋白的二级结构和三级结构;Clustel W方法对比绵羊Txl-2与绵羊、山羊预测序列同源性最高。     

水牛转录抑制因子CTCF基因克隆分析及不同组织中的表达研究

本研究克隆了水牛转录抑制因子CTCF基因序列,并运用生物信息学方法对其核苷酸序列的保守性和氨基酸的理化性质、蛋白质结构进行了系统分析,此外还对CTCF基因在水牛不同组织中的表达差异进行了检测。结果表明,应用RT-PCR技术克隆获得了长2239bp水牛CTCF基因序列,其中编码区全长2184bp,编码727个氨基酸,理论蛋白质分子质量82.7ku,等电点为6.57。多重序列比较分析显示,水牛CTCF核苷酸序列与牛、猪、马、人和小鼠相应序列的相似性分别为99%、96%、96%、94%和92%,结合系统进化树分析结果推测,CTCF基因在不同物种及进化的过程中具有高度的保守性。对水牛CTCF蛋白的二级和三级结构分析结果发现,其存在连续11个锌指C2H2结构,预测其为重要的DNA结合蛋白。定量表达分析结果显示,CTCF在水牛肝脏组织中相对表达量最高,大脑、肌肉和肾脏次之,卵巢和皮肤表达量较低。     

水牛TRAIL基因克隆及生物信息学分析

【目的】对水牛肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)相关凋亡诱导配体(TNF-related apotosis-inducing ligand,TRAIL)基因CDS序列进行克隆及序列分析,并对其编码的蛋白进行生物信息学分析,为后期TRAIL蛋白调控水牛卵巢卵泡发育、颗粒细胞增殖及凋亡的研究奠定基础。【方法】利用RT-PCR方法克隆水牛TRAIL基因CDS序列,对所获序列进行核苷酸序列、氨基酸序列相似性比对,构建系统进化树,并通过生物信息学软件分析TRAIL基因编码蛋白的结构和功能。【结果】试验成功克隆水牛TRAIL基因CDS序列,长864 bp,编码287个氨基酸;水牛TRAIL基因与牦牛、普通牛、山羊、绵羊、野猪、马、人、黑猩猩和家鼠的核苷酸序列相似性分别为99.2%、99.3%、95.9%、96.3%、84.7%、84.8%、81.3%、81.3%和70.0%。系统进化树结果表明,水牛与牦牛、普通牛的亲缘关系最近,与家鼠亲缘关系最远。氨基酸序列比对结果表明,在不同物种间,其跨膜结构域和TNF结构域序列保守性较高。TRAIL蛋白属于亲水性蛋白,存在1个跨膜结构域,140―285位氨基酸处为TNF区,具有29个磷酸化位点,无信号肽和糖基化位点,主要定位于细胞质中。TRAIL蛋白二级结构主要以无规则卷曲为主,约占51.57%,其次为延伸链(24.39%)和α-螺旋(24.04%)。TRAIL蛋白三级结构与二级结构一致,且与模型蛋白人TRAIL蛋白的相似性为75.53%。【结论】本试验克隆得到水牛TRAIL基因CDS区序列,大小为864 bp,编码287个氨基酸,水牛与牦牛、普通牛亲缘关系最近,TRAIL蛋白跨膜结构域和TNF结构域在不同物种间序列保守性较高,这可能与其功能有关。     

大鲵致病性嗜水气单胞菌主要毒力基因的生物信息学分析

根据嗜水气单胞菌的溶血素(Hly A)、外膜蛋白(Omps)及丝氨酸蛋白酶(Ahp A)基因,分别设计3对特异性引物。通过3重PCR法对三对基因进行克隆与生物信息学分析。溶血素、外膜蛋白及丝氨酸蛋白酶基因的开放阅读框分别为1 863 bp、1 071 bp及894 bp,分别编码621、357及298个氨基酸。同时,对其氨基酸序列进行系统进化树构建、蛋白理化性质分析、蛋白信号区域和结构区域分析、蛋白二级结构预测、蛋白三级结构预测及蛋白免疫原性分析。本研究对大鲵源致病性嗜水气单胞菌主要毒力基因进行生物信息学分析,为进一步研究嗜水气单胞菌保护性抗原多样性而提供理论基础。     

猪博卡病毒VP2基因的克隆及生物信息学分析

为研究猪博卡病毒VP2蛋白的结构与功能,应用套式PCR技术对猪博卡病毒VP2基因进行分子克隆,并对其进行生物信息学分析。结果显示,获得了1 656bp的猪博卡病毒VP2基因(GenBank登录号为KF806730),此序列与其他PBoV分离株核苷酸序列同源性为82%⁸9%,进化树分析结果显示,KF806730与PBoV5在一个分支,说明两者之间具有较近的亲缘关系。经生物信息学分析,此序列编码551个氨基酸,相对分子质量为61 261.7,理论等电点(PI)为5.98,体外半衰期为30h(体外哺乳动物类网状细胞),不稳定系数为34.36,脂肪系数为54.88,平均亲水性为-0.766,最大疏水指数为1.733,最小疏水指数为-3.378;在同一氨基酸的不同密码子的选择上存在一定程度的偏向性;无信号肽和跨膜区;综合多种方法分析预测其主要抗原表位可能位于第78-80aa、311-314aa、507-509aa区域;二级结构、三维结构预测显示VP2蛋白主要以无规则卷曲为主,存在多个螺旋和折叠区域。本试验成功获得猪博卡病毒VP2基因,为以后研究此基因的生物学功能和建立该病毒的诊断方法奠定了基础。     

牛MARK2、CREB5基因的克隆和生物信息学分析

试验旨在对牛MARK2、CREB5基因进行克隆和生物信息学分析.首先在GenBank数据库中利用人MARK2和CREB5基因序列比对获得牛的表达序列标签(ESTs)的序列,进行引物设计并利用RT-PCR方法从牛肩胛骨肌肉中克隆出MARK2和CREB5基因的cDNA序列,补足空缺部分,最终获得牛MARK2和CREB5基因.通过对牛MARK2和CREB5基因的生物学特性进行分析可知:牛MARK2基因的编码区长为2 076 bp,编码691个氨基酸,CREB5基因的编码区长1 527 bp,编码508个氨基酸;经蛋白质理化性质预测MARK2和CREB5蛋白均为亲水性蛋白;MARK2和CREB5蛋白的磷酸化位点均分布于苏氨酸(Thr)、丝氨酸(Ser)和酪氨酸(Tyr)残基上;MARK2蛋白与CREB5蛋白的二级结构预测以无规则卷曲为主;亚细胞定位预测MARK2蛋白主要分布在细胞质中,CREB5蛋白主要分布在细胞核中,两者均不属于分泌型蛋白;MARK2蛋白保守结构域预测含1个S_TKc和1个UBA功能结构域,CREB5蛋白保守结构域预测含有1个ZnF_C2H2、1个BRLZ功能结构域和5个低复杂度区域且二者均不具有跨膜结构.     

版纳微型猪近交系DLDH基因编码区序列扩增及生物信息学分析

本试验旨在扩增版纳微型猪近交系DLDH基因编码区序列,为进一步研究DLDH基因的表达信号通路及与精子获能和顶体反应发生相关基因的表达调控提供必要的基础。通过提取版纳微型猪近交系睾丸组织RNA,经反转录后获得cDNA,设计特异性引物以扩增DLDH基因的编码区序列,经测序后采用生物信息学软件对编码区序列及氨基酸序列进行生物信息学分析和结构预测。结果表明,版纳微型猪近交系DLDH基因编码区序列全长1 530bp,编码509个氨基酸。生物信息学分析表明,不同物种DLDH基因编码区核苷酸序列和氨基酸序列具有较强的保守性,DLDH蛋白中存在丰富的磷酸化位点,空间结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。     

杂交牛(大额牛×云南黄牛)朊蛋白基因 的分子克隆及其序列分析

朊蛋白(prion protein,PRNP)基因编码朊蛋白,是引起疯牛病的主效基因。本研究利用PCR方法首次从杂交牛(大额牛×云南黄牛)基因组中扩增了PRNP基因,GenBank登录号为HQ875337。PCR产物直接双向测序表明,该序列包含杂交牛PRNP基因795 bp的开放阅读框(ORF),编码264个氨基酸前体蛋白。生物信息学分析结果发现,该蛋白包含1个信号肽、3个α螺旋、2个β折叠、6个八肽重复序列、1个疏水区域、1个二硫键和1个糖基磷脂酰肌醇锚定位点。与已报道的其他牛PRNP基因进行序列比对分析,核苷酸和氨基酸的同源性均在97%以上。