猪捷申病毒的分离鉴定及其VP1基因的序列分析

应用PK细胞,从临床症状上表现为腹泻的仔猪肠内容物中分离到一株病毒,对该病毒进行RT-PCR检测,证明该病毒为猪捷申病毒(PTV),命名为PTVJS2013。对该病毒进行细胞半数感染量(TCID50)测定,动物试验以及VP1蛋白基因序列测定,并与国内外16株不同血清型PTV的VP1基因序列进行了同源性比较及系统进化树分析。结果表明,猪捷申病毒JS2013 VP1基因核苷酸与8型血清型PTV同源性达到99.6%。而与其他血清型的PTV VP1基因核苷酸的同源性仅在58.3%~74.7%之间;与国内分离的PTV-Jilin/2003/2(JN710381/PTV-8)和PTV-Fuyu/2009(HQ020378/PTV-8)亲缘关系最近,同属于PTV-8血清型一个分支。     

猪捷申病毒SD株的分离与鉴定

从山东某疑似感染猪捷申病毒(Porcine teschovirus,PTV)的猪群中分离到1株病毒。经一步法RT-PCR扩增得到PTV部分VP1基因序列。经序列测定,与Gen Bank上的毒株序列进行比对,并做了该病毒的致病性试验。结果显示,该分离株与参照的猪捷申病毒相似性为100%,并对猪具有一定的致病性。本试验成功分离获得1株PTV山东地方流行毒株,命名为SD株。     

一株猪捷申病毒的分离与鉴定

北京地区某猪场猪群疑似感染猪捷申病毒(porcine teschovirus,PTV),为了分离与鉴定该病毒,从采集的脑组织样品中分离出病毒,并从病毒中提取总RNA,根据已报道的引物序列,经RT-PCR扩增得到部分编码主要结构蛋白的VP1基因和高度保守的5'-UTR区基因序列,将这些基因克隆到pEASY-Blunt载体中,经序列测定,与GenBank上的毒株序列进行比对。试验结果表明,分离的毒株与猪捷申病毒同源性为95%~100%。本试验成功分离获得一株猪捷申病毒北京地方流行毒株,命名为 10BJ02株。     

两株猪伪狂犬病病毒变异株的分离鉴定及gB、gC和gE基因的分子特征分析

为探明近年来河南省猪伪狂犬病病毒(PRV)的遗传变异情况,本研究于2017年采集河南漯河和中牟地区疑似伪狂犬病发病养殖场送检的脑组织病料,通过细胞盲传、噬斑纯化、间接免疫荧光试验、Western blotting和透射电镜技术进行病毒分离鉴定。TCID₅₀法测定分离毒株的病毒滴度、生长曲线,通过小鼠感染试验测定分离毒株对小鼠的致死性。对gB、gC和gE基因进行PCR扩增、测序,并与参考毒株序列进行比对分析。结果显示,对PCR鉴定阳性的病料在PK-15细胞盲传后,两份病料在6代内均出现细胞病变,通过间接免疫荧光试验、噬斑纯化和透射电镜技术,成功分离鉴定了两株PRV,分别命名为HeN-LH株及HeN-YM株。分离毒株在PK-15细胞上的生长曲线显示,HeN-LH和HeN-YM株在感染后36 h病毒滴度分别可达10^8.35和10^6.63 TCID₅₀/mL。用不同浓度的病毒接种小鼠,结果显示,HeN-LH和HeN-YM株LD₅₀分别为10^2.13及10^3.25 TCID₅₀。对gB、gC和gE基因全长扩增测序后构建遗传进化树,结果显示,两株PRV毒株与Bartha、Fa和Ea等经典株的亲缘关系相对较远,而与2011年以来国内不同省份分离的PRV变异株亲缘关系较近。氨基酸序列比对分析显示,与其他变异株相似,gB、gC和gE基因均发生了多个氨基酸的变异,且在特定的位点存在特征性的氨基酸插入和缺失。本研究成功分离鉴定了两株PRV变异株,分离株对小鼠均表现出一定的致病性,本试验结果可为河南省伪狂犬病的防控工作和疫苗株的选择提供科学依据。     

猪流行性腹泻病毒X-6/2021株的分离鉴定及其S1基因序列分析

为了了解四川地区流行的猪流行性腹泻病毒（PEDV）的生物学特征及基因的遗传进化关系,从四川某地采集了发病仔猪小肠,病料处理后在Vero细胞上进行盲传,通过RTPCR、间接免疫荧光鉴定（IFA）验证,成功分离出1株猪流行性腹泻病毒,命名为X-6/2021株。对X-6/2021株S1基因进行RT-PCR扩增,获得的分离株S1序列与国内外PEDV毒株进行序列比对和遗传进化分析。结果显示,PEDV-X-6/2021毒株与Ⅰ型参考毒株的同源性为90.6%～93.2%,与Ⅱ型参考毒株的同源性为97.6%～99.0%。试验成功地从四川省分离鉴定得到1株猪流行性腹泻病毒,为该地区PEDV防控及候选疫苗毒株的筛选提供了物质基础。     

猪细小病毒的分离与鉴定

本试验从福建省某猪场疑似猪细小病毒病死胎的淋巴结、肝脏中分离到1 株病毒。病料接种PK-15细胞36 h后出现了圆缩、集聚、脱落等细胞病变,猪细小病毒阳性血清能特异性地中和该分离病毒。根据已发表的细小病毒(PPV) VP2基因的序列设计并合成了一对引物,采用PCR方法可扩增531 bp DNA片段。测序结果表明,分离株VP2基因与NCBI公布的NADL-2株的同源性高达99.2％,证实分离的病毒株为猪细小病毒。为进一步开展该病毒致病机理、流行病学、诊断研究与疫苗免疫等奠定了基础。     

一株兔出血症病毒变异毒株的分离与鉴定

2021年3月份河南省某养兔场肉兔疑似感染兔病毒性出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus, RHDV),为了分离鉴定肉兔感染毒株,并对所分离毒株特性进行研究,试验对兔场送检的病死兔进行解剖、细菌与病毒分离、RT-PCR检测、纯净性检测、血凝性测定,并进一步进行半数致死量(LD₅₀)、传统疫苗免疫兔攻毒保护试验和免疫原性测定。结果表明：病死兔剖检可见肝脏、心脏、肺脏等实质内脏器官广泛出血。病料未分离到细菌,RT-PCR检测鉴定感染病毒为RHDV;用分离株注射非免疫健康家兔后,兔48 h内死亡,症状表现和剖检病变与兔出血症相似;将所分离RHDV命名为HN株,其对人“O”型红细胞无血凝性,对兔的LD₅₀为1×10^-6.77/mL;灭活后免疫兔,能抵抗RHDV HN株攻击。说明养兔场肉兔感染了RHDV,且成功分离鉴定得到一株变异型RHDV,其具有良好的免疫原性。     

犬细小病毒2c亚型毒株的分离与鉴定

采集一疑似犬细小病毒(CPV)患犬的粪便,用纳米PCR方法对病料进行CPV检测,并应用猫肾细胞F81进行病毒分离培养,采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)检测病毒在F81细胞中的增殖动态。利用PCR扩增分离病毒的VP2基因,测序结果用DNAMAN软件对获得的VP2基因序列进行拼接,并与NCBI上已经公布的犬细小病毒的全基因组序列以及相关蛋白的核酸序列进行比较,确定其所分离的病毒株型并推导氨基酸序列。结果表明,纳米PCR检测结果为CPV核酸阳性,病料接种到F81细胞培养后出现明显细胞病变(CPE),血清学鉴定为CPV抗原阳性,序列测定分析表明,该毒株VP2基因开放阅读框(ORF)为1755 bp。进化分析显示,该毒株属于CPV-2c型,并命名为CPV-2c-Guangxi23。     

4株基因C型鸭甲肝病毒的分离鉴定与VP1基因序列分析

为了获得鸭甲肝病毒(DHAV)流行毒株并掌握流行毒株的分子特征,试验采用临床病料RT-PCR检测、病毒分离、病毒含量测定、致病性试验、VP1基因序列分析等方法对8份临床疑似DHAV感染病料进行了研究.结果显示:8份临床病料样品经RT-PCR检测有4份为DHAV-C阳性;4份阳性病料均可引起10日龄鸭胚规律性死亡;4株分...     

猪伪狂犬病病毒变异毒株HeNZK-2014的分离鉴定及gE基因序列分析

为了解猪伪狂犬病病毒（PRV）变异毒株的特点,本研究采集临床疑似PRV感染发病猪的淋巴结等组织样品进行PCR鉴定,选取仅PRV阳性的组织样品经研磨除菌后取上清接种于PK-15细胞进行病毒分离培养、蚀斑纯化、PCR和间接免疫荧光法（IFA）鉴定,采用Reed-Muench法测定PRV的TCID₅₀,接种小鼠并观察临床症状,对纯化的PRV和死亡小鼠脑组织样品进行gE基因PCR扩增及测序分析。结果显示,PRV阳性病料接种于PK-15细胞24 h后出现典型细胞病变（CPE）,经3轮蚀斑纯化后PCR和IFA鉴定结果均为阳性,分离株命名为HeNZK-2014,其TCID₅₀为10^-9.77/0.1 mL;以1×10⁸个TCID₅₀病毒悬液接种小鼠22 h后可引起小鼠出现奇痒、撕咬、死亡等典型猪伪狂犬病症状,死亡小鼠脑组织样品PRV PCR检测结果为阳性;纯化病毒和死亡小鼠脑组织样品gE基因核苷酸序列同源性为100.0%,与GenBank中2011年以前登录的经典毒株位于不同分支,与2011年之后中国流行毒株位于同一分支,在第48和496位各有1个天冬氨酸（D）的插入,具有变异毒株的典型特征。本研究成功分离了1株PRV变异毒株,为进一步开展针对PRV变异毒株的疫苗及其防控研究奠定了基础。     

猪瘟病毒一步法RT PCR检测方法的建立

本研究根据NCBI公布的猪瘟病毒石门毒株的E2基因序列，设计、合成了1对检测猪瘟病毒E2基因的RT-PCR引物。自疑似猪瘟病料及接猪瘟F114毒的PK-15细胞中提取总RNA，经一步法RT-PCR扩增E2基因。建立了猪瘟病毒E2基因RT-PCR检测方法，RT-PCR从26份疑似猪瘟病料中检出阳性病料24份，阳性检出率为92.3%；结果表明，建立的 RT-PCR方法具有良好的特异性和敏感性，可用于CSFV的分离鉴定、临床病料的检测和分子流行病学调查。     

22株鸭甲型肝炎病毒的分离鉴定及其VP1基因的序列分析

为了解鸭甲型病毒性肝炎的病原特征,对2017-2019年从山东省采集的27份疑似鸭肝炎病毒感染的病料采用鸡胚进行病毒分离,并进行RT-PCR鉴定,随后对分离株的VP1基因进行序列测定以及遗传变异分析.结果显示:从27份疑似病料中共分离出了22株病毒,8株为鸭甲肝病毒1型(DHAV-1),14株为鸭甲肝病毒3型(DHAV...     

鸭源新型鹅细小病毒的分离鉴定与VP1基因序列分析

为确定发病鸭场的致病原,掌握该致病原的遗传进化特征,研究从山东省某鸭场采集到1份短喙与矮小综合征(SBDS)疑似病例病料,采用永生化鹅胚上皮细胞系(GEEC)对病料进行病毒分离培养,观察细胞病变,测定分离毒株的血凝性、病毒滴度(TCID50)、对鸭胚的致病性,并进行VP1基因序列比对及相似性分析。结果显示：临床病料分离培养的病毒可引起GEEC出现细胞明显皱缩、聚集、折光性增强等典型细胞病变,表明分离到一株鸭源NGPV毒株,命名为SDHZ株,该病毒对1%鸡红细胞无凝集性,TCID50高达10^-6.25/mL,鸭胚半数致死量(ELD₅₀)为10^-4.5/mL,接种鸭胚死亡出现全身及肝脏出血、短喙、发育迟缓等典型症状,VP1基因序列与樱桃谷鸭中分离的新型鹅细小病毒(NGPV)相似性为95.3%～98.0%,与GPV经典毒株的相似性为89.3%～94.6%。表明该鸭场本次疫病病原为NGPV,为进一步研究NGPV致病机制及制定综合防控措施提供参考。     

一株牦牛源G6P[11]型牛轮状病毒的分离鉴定及部分基因的序列分析

本研究的目的是分离、鉴定牦牛源牛轮状病毒(bovine rotavirus, BRV)。将经RT-PCR检测BRV阳性的牦牛腹泻粪便样本接种MA-104细胞,进行病毒分离和鉴定,并对其VP4、VP6和VP7完整基因进行测序,分析其分子特征。结果显示:病毒盲传3代后出现细胞病变,至第7代后出现细胞病变的时间稳定,经蚀斑纯化后测得病毒滴度为10^8.39TCID₅₀·mL^-1。分离株经RT-PCR、间接免疫荧光和电镜观察证实为BRV,命名为HY-1株;扩增HY-1株VP4、VP6和VP7完整基因序列,分析表明HY-1株为G6P[11]I2型;系统发育树显示,HY-1株VP4、VP6和VP7节段分别与中国牛源DQ-75株和印度牛源M-1和RUBV319株遗传演化关系最近,可能为重配毒株。与国内的G6型和P[11]型BRV毒株相比,HY-1株的VP4和VP7蛋白重要氨基酸位点变化较大。成功分离得到一株牦牛源BRV,基因型为G6P[11]型,为我国首次报道。     

犬细小病毒HZ0761株的分离与鉴定

采集疑似细小病毒(CPV)感染犬的粪便,采用同步培养法接种胎猫肾细胞(F81)进行病毒分离鉴定。通过PCR检测、HA试验、IFA鉴定、电镜观察和空斑纯化,获得1株犬细小病毒,并命名为HZ0761。感染的F81细胞48h后出现明显的细胞病变;在病料和感染的F81细胞中均扩增出CPV VP2基因的特异性片段(221 bp);病毒液可凝集猪红细胞,血凝价为1∶28,其血凝性能被特异性抗体抑制;IFA可见特异性亮绿色荧光;电镜观察感染的F81细胞核内可见20 nm左右的病毒颗粒;病毒液的TCID50为10-4.8/mL,VP2基因序列分析显示该毒株为CPV-2 a型。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ZB株的分离与鉴定

为了确定从高度疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的猪内脏中分离得到的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)毒株的类型,试验进行了形态学观察、血清学分析、免疫学分析、RT-PCR扩增等一系列鉴定分析。结果表明:从疑似病料中分离获得的病毒可以使Marc-145细胞产生明显病变,而在Vero和PK-15细胞上不出现细胞病变,从而确定试验获得的病毒为PRRSV,命名为ZB株。     

猪瘟病毒一步法RTPCR检测方法的建立

 本研究根据NCBI公布的猪瘟病毒石门毒株的E2基因序列,设计、合成了1对检测猪瘟病毒E2基因的RT-PCR引物。自疑似猪瘟病料及接猪瘟F114毒的PK-15细胞中提取总RNA,经一步法RT-PCR扩增E2基因。建立了猪瘟病毒E2基因RT-PCR检测方法,RT-PCR从26份疑似猪瘟病料中检出阳性病料24份,阳性检出率为92.3%;结果表明,建立的 RT-PCR方法具有良好的特异性和敏感性,可用于CSFV的分离鉴定、临床病料的检测和分子流行病学调查。     

一株猪捷申病毒全基因组序列测定及分析

根据Gen Bank已发表的猪捷申病毒(porcine teschovirus,PTV)13种血清型全基因组序列,分析其保守区域并设计10对特异性引物。从临床腹泻病料中提取核酸,经RT-PCR扩增目的片段,分别对这些片段进行克隆、序列测定、拼接,最终获得一株猪捷申病毒全基因组序列,命名为PT-GD。主要结构蛋白VP1进化分析表明,该毒株与PTV12型CC25、YZ119的VP1核苷酸序列同源性分别为80.1%和79.7%,与其他血清型毒株进化距离相对较远,表明该毒株为猪捷申病毒血清型12型。该病毒全基因序列的测定及血清型鉴定为进一步深入研究猪捷申病毒在我国的遗传变异及其生物学特性提供了依据。     

湖北省羊口疮病毒的分离鉴定

利用MDBK传代细胞系对湖北通山县某羊场疑似羊口疮(Orf)的黑山羊病料进行分离,通过病毒理化特性试验、动物回归试验和PCR等方法对分离的毒株进行鉴定。结果表明,病料悬液接种MDBK细胞后出现细胞病变,接种病料的羊只出现典型的Orf症状,扩增出羊口疮病毒(Orf virus)B2L基因,该毒株与台湾山羊株(EU935106.1、DQ904351.1)相似性最高(均为99%),亲缘关系最近。本研究成功分离鉴定到一株ORFV,命名为ORFV/HB/09。     

云南猪群中猪捷申病毒感染分子生物学诊断

猪捷申病是由猪捷申病毒(Porcine teschovirus,PTV)感染引起的猪的一种病毒性传染病。文章根据Gen Bank收录的PTV基因序列设计套式引物,建立检测PTV的套式RT-PCR诊断方法;从云南省某猪场疑似猪捷申病的病料中检测出PTV核酸阳性,产物经克隆测序,与Gen Bank收录的PTV毒株序列比对,结果表明该扩增序列与PTV同源性为99%~95%,首次在云南确诊了PTV感染存在。