豹源猫杯状病毒ORF2基因的扩增、克隆及原核表达

为制备猫杯状病毒血清学检测抗原,本研究根据实验室保存的1株豹源猫杯状病毒基因序列设计引物,扩增了开放阅读框2（ORF2）中1734 bp的核苷酸序列,将其克隆至表达载体pET-28a上,构建了pET-28a-FCV1734重组质粒。将该质粒转化大肠杆菌,诱导表达产物经SDS-PAGE和Western blot检测,证明所表达的蛋白具有良好的反应原性。     

东北虎源猫免疫缺陷病毒pol基因遗传进化分析

为了解中国东北虎源猫免疫缺陷病毒(FIV)的感染情况,采集海林市横道河子东北虎林园东北虎全血样本50份,通过套式PCR对样本进行FIV pol基因扩增,并对阳性样本进行测序,再运用生物信息学软件进行遗传进化分析.结果检测出1只虎为FIV阳性,其pol基因与参考毒株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为70.0％～99.8％和...     

广西猫杯状病毒全基因组序列测定及其遗传进化分析

为了掌握广西猫杯状病毒(FCV)的流行情况及其变异规律。本研究于2018年3月至2019年9月采集疑似FCV鼻拭子59份,其中阳性检出率49.2%(29/59)。将阳性病料接种CRFK细胞,成功分离获得一株FCV毒株,命名为NN01-19。为深入了解其遗传进化规律和分子特征,本研究通过RT-PCR方法扩增获得该毒株的全基因组序列,并对其ORF2基因进行了遗传进化和序列分析。结果表明,NN01-19毒株基因组全长7709 bp,其中ORF2基因全长2010 bp。遗传进化分析发现该毒株与广西早期分离株GX01-13同属基因I群,但核苷酸和氨基酸同源性仅为77.9%和86.5%。其中,超变区(E区)抗原线性表位新增T448A、T450G、G451Q和T454S四个突变位点。重要的是,该区域还发生了V430T的突变,符合VS-FCV致病性氨基酸突变特点。本研究为深入了解FCV的流行特点及其变异规律提供了参考依据,同时也为今后防控FCV提供了重要的理论基础。     

临床健康宠物猫杯状病毒的分离鉴定及其ORF2序列分析

为了解猫杯状病毒(Feline calicivirus,FCV)在健康猫群中的流行情况,分析病毒衣壳蛋白基因的遗传变异特性,本试验采用荧光定量PCR方法检测了8份采集自吉林省临床健康宠物猫的口腔棉拭子,利用F81细胞对检测呈阳性的样品进行病毒分离培养,通过电镜观察、PCR方法对所分离的病毒进行鉴定。结果分离到1株病毒,鉴定为猫杯状病毒,测定其ORF2基因序列全长为2 007 nt,与国内外参考毒株的核苷酸同源性为68.8%~78.4%。遗传进化分析表明,来自中国的3个分离株处于同一分支,亲缘关系较近。     

1株猫杯状病毒的分离鉴定及其ORF2序列的遗传演化分析

为了解猫杯状病毒形态特征及遗传演化情况,采用F81细胞从患病宠物猫的鼻拭子样品中分离获得1株猫杯状病毒(feline calicivirus,FCV),命名为SH1.经电镜观察,病毒粒子呈球形,无囊膜,符合FCV的形态特征.采用RT-PCR方法扩增了该毒株的全基因组,并进行了序列测定和衣壳蛋白基因(ORF2)序列的分析...     

圈养白化孟加拉虎感染猫杯状病毒的诊断和防治

长沙生态动物园步行区虎馆圈养的3只白化孟加拉虎相继发生以精神沉郁、采食困难、流涎、口腔溃疡等为主要特征的传染疾病。采集病虎分泌物(唾液),使用猫杯状病毒(Feline calicivirus,FCV)快速检测试剂盒检测,结果显示阳性,初步确诊为猫杯状病毒感染。通过抗病毒、抗继发感染、维持电解质和酸碱平衡等治疗后病虎康复痊愈。     

猫杯状病毒、猫细小病毒、猫流感病毒和猫疱疹病毒多重PCR检测方法的建立和应用

为建立快速检测猫科动物重要传染病的多重PCR检测方法,根据GenBank中登录的猫杯状病毒(feline calicivirus, FCV)、猫细小病毒(feline parvovirus, FPV)、猫流感病毒(feline influenza virus, FIV)和猫疱疹病毒1型(feline herpesvirus type 1,FHV-1)的相对高保守性基因ORF2、NSP1、M和UL27,分别设计4对特异性引物。通过对反应体系的摸索及优化,建立了可同时扩增FCV(257 bp)、FPV(380 bp)、FIV(519 bp)和FHV-1(761 bp)的四重PCR反应条件及体系。结果显示：能够在同一体系中用同一反应扩增出以上4种病毒基因,其重复性及特异性均良好,敏感性可达到10 copies/μL。用该方法检测69份口鼻拭子,结果发现FCV和FPV混合感染的阳性率为10.14%,FCV和FHV-1混合感染的阳性率为1.45%,FCV、FPV和FIV混合感染的阳性率为10.14%。结果表明：研究建立的四重PCR检测方法可对常见猫科动物病毒性传染病进行快速准确的鉴别诊断,而且为...     

华东地区猫杯状病毒的分离鉴定及遗传进化分析

为了解猫杯状病毒(FCV)在中国华东地区的流行状况及其遗传变异和演化特征,本研究采集30份疑似感染FCV的猫眼鼻拭子,通过常规方法分离鉴定出9株FCV,经RT-PCR和测序获得了 FCV VP1的基因序列,与文献报道的流行株、高致病力FCV(VS-FCV)株和疫苗株VP1基因同源性进行比对及遗传进化分析.结果显示,9株...     

猫杯状病毒的分子鉴定及系统进化分析

猫杯状病毒可引起猫传染性鼻结膜炎,该病是较为常见的传染病之一。猫杯状病毒具有较高的变异性,因此开展该病毒的流行性调查和遗传进化分析对于该病毒的防控具有重要的意义。本研究主要针对分离的一株猫杯状病毒通过RNA提取,cDNA的合成,RT-PCR和目的基因的克隆等方法对毒株进行了分子鉴定,并利用MEGA6.0软件构建遗传进化树,分析该毒株的系统进化关系。结果表明该毒株与目前国内流行的其他毒株相似性较低,初步分析可能为新的变异毒株。本研究为猫杯状病毒的流行病学调查提供了一定的理论基础。     

5株猫杯状病毒中国分离株的细胞适应性及遗传进化分析

将CH-JL1、CH-JL2、CH-JL3、CH-JL4、CH-SH 5株猫杯状病毒中国分离株分别在F81细胞上连续传至15代。细胞传代前,测定病毒的细胞半数感染量(TCID_(50)),再以0.1 MOI的感染复数接种细胞。采用RTPCR方法扩增FCV各代次的ORF2基因片段并测序,用DNASTAR和MEGA软件分析其氨基酸变异和遗传进化特点。试验结果显示,细胞适应传代后,FCV各代次毒株滴度逐渐稳定,均位于10~(-9)TCID_(50)/mL~10~(-10)。TCID_(50)/mL之间。ORF2基因测序表明,FCV传代后氨基酸变异位点包括CH—JL1的P57S和G494R、CH-JL3的S440L和N519D、CH—JL4的V614I、CH—SH的K448R。遗传进化分析表明CH—JL2和CH-JL3处于同一进化分支上,同源性为95.9%;CH-JL1和国内FB-NJ-13株、CH-SH和国内GD株分别在一个进化分支,CH-JL4和国外F65株遗传关系较近。5株猫杯状病毒在F81细胞传代后滴度较高,稳定性良好,为将来FCV疫苗株的研发奠定了基础。     

猫杯状病毒分离鉴定及其VP兽医临床1基因序列分析

为了解我国猫杯状病毒(FCV)流行情况,于2019年1月～3月从京津地区4家宠物医院收集并检测眼鼻肛拭子297份,FCV、猫疱疹病毒1型和猫泛白细胞减少症病毒阳性率分别为15.49％、30.98％、30.64％.病原学调查结果显示,未免疫的小于1岁幼猫对FCV更易感.将FCV单纯阳性病料接种于F81细胞进行病毒分离,通...     

检测猫杯状病毒RT-qPCR方法的优化与应用

为建立一种通用性良好的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法,根据GenBank上猫杯状病毒(feline calicivirus, FCV) ORF1保守区域序列,设计合成1对特异性引物,用于FCV的快速检测。灵敏性试验结果显示,该方法的检测下限为4.93×10¹拷贝/μL,比普通RT-PCR检测下限高100倍;特异性试验结果显示,该检测方法与猫疱疹病毒、猫细小病毒、猫传染性腹膜炎病毒等无交叉反应;通用性试验结果显示,针对引物靶位点区间,该方法对所有已知变异位点的人工合成质粒和本实验室保存的不同变异位点的FCV毒株,均能够良好检出;重复性试验结果显示,组内的变异系数为0.09%～0.71%,组间变异系数为0.05%～0.82%,均小于1%。对23份临床样品进行检测,该方法的阳性检出率为60.9%,检出的14份阳性病料分别接种到CRFK细胞中,对细胞病变产物进行扩增并测序,BLAST对比后结果证实为FCV毒株。结果表明,本试验建立的荧光定量RT-PCR检测方法可用于FCV的快速诊断及流行病学的调查。     

哈尔滨圈养东北虎FHV-1的巢式PCR检测及gD基因序列分析

东北虎（Panthera tigris altaica）是世界上体型较大的猫科（Felidae）动物,是我国一级保护动物。疾病防控对东北虎保护与繁育工作至关重要,目前关于东北虎重要病毒病的流行病学资料寥寥无几。传染性鼻气管炎是由猫疱疹病毒Ⅰ型（Feline herpesvirus type 1,FHV-1）感染引起的一种上呼吸道疾病,且现有疫苗免疫后多出现再感染现象,对猫科动物健康造成一定危害。本研究采集50只东北虎全血样本,利用巢式PCR进行FHV-1检测,结果有10份样本扩增出明显目的条带,阳性率为20%;随机选取其中2株扩增FHV-1gD基因全序列,获取的1 125 bp序列与FHV-1参考株同源性为99.16%～99.56%,相比FHV-1参考株,获取序列有5个碱基位点发生了突变。研究结果丰富了圈养东北虎FHV-1流行病学数据,为圈养大型猫科动物的FHV-1监测提供了参考,有利于提高东北虎种群的保护成效。     

4例禽戊型肝炎病例的实验室诊断及ORF2基因遗传进化分析

本研究通过分子流行病学诊断技术,分别从山东、辽宁、吉林、陕西4个地区表现肝炎症状的病鸡中,采集肝脏和脾脏样品,利用RT-PCR方法,检测禽戊型肝炎病毒(aHEV),并对aHEV-ORF2基因片段进行测序,利用MegAlign进行同源性比较。结果显示:4个鸡场的病鸡样品均为aHEV阳性,aHEV-ORF2基因序列间同源性为84.5%~94.5%,与已报道的4种基因型同源性均小于84.0%,其中与基因1型的澳大利亚株和韩国株同源性为81.6%~82.8%,与基因2型的美国原型株和美国无毒株同源性为80.9%~82.8%,与基因3型的欧洲株和中国株同源性为80.8%~82.5%,与基因4型的匈牙利株和中国台湾株同源性为81.4%~82.6%。ORF2基因进化树分析显示:4株aHEV均属于戊型肝炎B种,形成独立的基因分支,但不属于已报道的4个基因型,而在一个新型独立分支上,表明国内存在一种新基因型的aHEV流行。本研究为我国aHEV的进一步研究提供了基础和依据。     

2017-2021年成都市猫细小病毒的检测及其VP2基因的变异分析

本研究旨在通过对成都地区家养猫细小病毒(feline parvovirus,FPV)的分子检测,了解FPV在成都地区的流行及遗传变异情况.2017-2021年分别从四川成都地区采集168份家养猫的腹泻粪便样本,用PCR方法对168份样本进行FPV检测,并选取13份阳性样本进行VP2基因全长的克隆和测序,用Meg Ali...     

猫疱疹病毒Ⅰ型、猫杯状病毒、支气管败血波氏杆菌多重荧光定量PCR检测方法的建立与应用

旨在建立检测猫疱疹病毒Ⅰ型(Feline herpesvirus 1,FHV-1)、猫杯状病毒(Feline calicivirus, FCV)、支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)多重TaqMan荧光定量PCR方法。基于FHV-1的胸苷激酶(TK)基因、FCV的衣壳蛋白VP1基因、Bb的皮肤坏死毒素基因(DNT1)序列保守区域设计并合成TaqMan荧光定量PCR引物和探针,以FHV-1、FCV、Bb、猫细小病毒、沙门菌、金黄色葡萄球菌为模板验证引物和探针的特异性。制备重组质粒pMD18T-FHV-TK、pMD18T-FCV-VP1、pMD18T-Bb-DNT1作为标准品,经矩阵法确定最佳反应体系。以10倍梯度稀释的标准品为模板检测方法的灵敏性。应用建立的方法对32份临床具有上呼吸道感染症状的猫眼、口、鼻拭子检测,以评估该方法的可行性。结果显示：该方法可特异性检出FHV-1、FCV、Bb,且与猫细小病毒、沙门菌、金黄色葡萄球菌无交叉反应;灵敏度试验表明该方法对FHV-1、FCV、Bb的最低检出限分别为10、10和100拷贝/μL;应用该方法从3...     

牛星状病毒ORF2基因遗传进化分析及原核表达

为了解牛星状病毒(bovine astrovirus, BoAstV)ORF2基因的遗传进化并获得原核表达的衣壳蛋白,从牛腹泻粪便中提取总RNA,扩增BoAstV ORF2基因,将ORF2基因克隆至pMD19-T载体中并测序,利用生物信息学软件分析基因的遗传进化。将位于BoAstV衣壳蛋白高度保守区的ORF2-1200基因克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组原核表达载体pET28a-ORF2-1200。将重组载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中诱导表达并优化诱导条件,经过超声破碎离心并鉴定蛋白可溶性,最后利用亲和层析镍柱对重组蛋白进行纯化和Western blot鉴定。结果表明：ORF2基因全长2 304 bp,编码768 aa, ORF2基因属MAstV-28基因型,与日本毒株Ishikawa24-6亲缘关系最近,与20个参考毒株的ORF2基因氨基酸同源性为53.2%～86.0%。试验成功构建了重组载体,经条件优化,在37℃,1.0 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导6 h情况下蛋白表达量最高,目的蛋白大小55 kDa左右,目的蛋白以包...     

2022年鄂西地区PRRSV ORF5基因遗传进化分析

为掌握鄂西地区PRRSV的流行及遗传变异情况,对2022年采自该地区8个县（市、区）的疑似感染发病猪血液、肺脏组织等样品共672份,进行PRRSV实时荧光RT-PCR检测,并对部分阳性样品的ORF5基因序列进行遗传进化分析。结果显示：检出PRRSV阳性样品33份,阳性检出率为5%;通过进一步分型鉴定,23份为HP-PRRSV阳性,占69.7%,10份为类NADC30（NADC30-like PRRSV）阳性,占30.3%;采用DNAstar软件分析4份阳性样品的GP5蛋白氨基酸序列,显示存在多个氨基酸突变,在诱骗表位（27~30 aa）出现29G→29C,在中和表位,HP-PRRSV毒株出现39A→39T,类NADC30毒株出现38A→38T。结果表明,鄂西地区存在高致病性和类NADC30两种PRRSV毒株流行,其GP5蛋白氨基酸序列已发生了多个变异。结果提示,应持续加强PRRSV分子流行病学监测,选择与流行毒株匹配的疫苗进行免疫。     

圈养虎源大肠杆菌耐药性和整合子特性分析

对东北虎林园分离的具有耐药性的大肠杆菌进行了整合子-基因盒的研究,结果表明:61株分离菌中整合酶Ⅰ检出率为52.46%,整合酶Ⅱ和整合酶Ⅲ均没检出。分离株对阿莫西林/克拉维酸、氨曲南和安普霉素较敏感;对氨苄青霉素、四环素和复方新诺明高度耐药。序列分析表明,含有3种基因盒,分别是dfr A15、dfr A12和aad A2。     

用PCR法检测东北虎感染猫细小病毒的研究

根据GenBank中已发表的猫细小病毒基因组中的保守序列 ,利用Goldkey软件设计了一对能扩增 750bp片段大小的引物 ,对某动物园 1只病死东北虎的脾脏样品进行了PCR检测。结果得到了与设计大小完全相符且与标准猫细小病毒扩增产物大小一致的特异核酸带 ,同时对犬瘟热、犬腺病毒、轮状病毒的核酸扩增结果均为阴性。敏感性试验表明 ,此法可检出血凝价为 1 2 8×脾脏匀浆液上清 1 0 - 5倍稀释的模板 ,远高于血凝试验的敏感性 ,为虎、狮、熊猫等野生动物细小病毒病的快速诊断提供了一个有效的方法