东北虎源猫免疫缺陷病毒pol基因遗传进化分析

为了解中国东北虎源猫免疫缺陷病毒(FIV)的感染情况,采集海林市横道河子东北虎林园东北虎全血样本50份,通过套式PCR对样本进行FIV pol基因扩增,并对阳性样本进行测序,再运用生物信息学软件进行遗传进化分析.结果检测出1只虎为FIV阳性,其pol基因与参考毒株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为70.0％～99.8％和...     

猫杯状病毒分离鉴定及其VP1基因序列分析

为了解我国猫杯状病毒(FCV)流行情况,于2019年1月～3月从京津地区4家宠物医院收集并检测眼鼻肛拭子297份,FCV、猫疱疹病毒1型和猫泛白细胞减少症病毒阳性率分别为15.49%、30.98%、30.64%。病原学调查结果显示,未免疫的小于1岁幼猫对FCV更易感。将FCV单纯阳性病料接种于F81细胞进行病毒分离,通过间接免疫荧光和测序分析等进行鉴定,分离的5株FCV分别命名为F2019TJ1株、F2019TJ2株、F2019TJ3株、F2019BJ1株和F2019BJ2株。研究显示,FCV对温度敏感,37℃存放4 d病毒含量下降1个滴度。对5株FCV的VP1基因进行测序分析,结果显示5株FCV核苷酸和氨基酸同源性分别为74.3%～87.3%和82.2%～92.2%,归属于2个不同毒株群,F2019BJ1株、F2019BJ2株和F2019TJ1株属于GI株群,与美国的UTCVM-H2株遗传距离较近;F2019TJ2株和F2019TJ3株属于GII株群,与国内的FCV-GD株遗传距离最近。研究结果为了解国内FCV流行及变异特点提供参考依据。     

猫白血病病毒的检测及pol基因遗传进化分析

为调查猫白血病病毒(FeLV)在青岛地区的流行情况,对2018年—2019年在青岛地区动物医院采集的25份临床疑似患有猫白血病的病料进行FeLV的RT-PCR检测,并对阳性样品的PCR产物进行了测序和遗传进化分析。结果表明,25份样品中14份检测为FeLV阳性,检出率为56%,检出率较高。同源性分析表明,除4株毒株同源性为100%外,其余各毒株间同源性差异较大,在85.5%～99.6%之间,各毒株间发生了一定变异。遗传进化分析表明,13株毒株独自形成一个分支,与来自中国台湾的FeLV-TWK30毒株遗传进化关系较远。可见猫白血病病毒在青岛地区的感染已较为严重,加强监测及防疫已经刻不容缓。     

虎源猫杯状病毒的分离及其基因组遗传变异分析

从贵州省某动物园因发热、呼吸道等症状死亡的东北虎脾脏组织中分离得到1株猫杯状病毒(FCV),命名为FCV-YH/16。采用RT-PCR的方法扩增了该病毒的全基因组,序列测定显示,FCV全基因组长7 687 nt(GenBank序列登录号为KX815169),该基因组包含3个开放阅读框。基因组核苷酸序列分析显示,该毒株与12Q087-1、 GD、SH和FB-NJ-13在一个大的分支上,而与疫苗株F4、F9和F65等不在一个分支上;其中与12Q087-1基因组同源性最高为80.5%,与疫苗株F9同源性最低为76.3%;衣壳蛋白氨基酸进化分析显示,与21株国内外代表株相比,该毒株的VP1氨基酸序列发生了9处新的单个氨基酸变异,5个区域的3个连续的氨基酸发生了变异,这些变异是否影响病毒毒力还需进一步研究。     

临床健康宠物猫杯状病毒的分离鉴定及其ORF2序列分析

为了解猫杯状病毒(Feline calicivirus,FCV)在健康猫群中的流行情况,分析病毒衣壳蛋白基因的遗传变异特性,本试验采用荧光定量PCR方法检测了8份采集自吉林省临床健康宠物猫的口腔棉拭子,利用F81细胞对检测呈阳性的样品进行病毒分离培养,通过电镜观察、PCR方法对所分离的病毒进行鉴定。结果分离到1株病毒,鉴定为猫杯状病毒,测定其ORF2基因序列全长为2 007 nt,与国内外参考毒株的核苷酸同源性为68.8%~78.4%。遗传进化分析表明,来自中国的3个分离株处于同一分支,亲缘关系较近。     

猫杯状病毒的分离鉴定及其全基因组的序列分析

本研究采用MDCK细胞从养殖场患病猪的鼻拭子样品中分离获得1株猫的杯状病毒(Feline calicivirus,FCV),命名为GX01-2013。采用RT-PCR方法扩增了该毒株的全基因组,并进行了序列测定和分析。结果表明,该毒株基因组全长7704 bp,与哈尔滨分离株HRB-SS较为相近,其核苷酸同源性为82.3%。根据FCV衣壳蛋白构建的遗传进化树分析,发现该病毒与F9、F4、225和2024疫苗株均不在同一分支,氨基酸同源性为84.2%~87.7%,各毒株间无明显地域差异。此外,VP1蛋白的E区(426~521aa)发现有4个中和性抗原位点发生改变。     

杭州地区猫杯状病毒的分离鉴定及VP1基因序列分析

猫杯状病毒(feline calicivims, FCV)是引起猫呼吸道疾病的一种常见病原,呈世界性分布,常在猫群中爆发流行。为了解我国FCV的流行情况及分子生态学特征,本研究对杭州地区收集的48份疑似FCV感染病料,进行了PCR鉴定、病毒分离培养,以及基于VP1基因序列的系统发育树分析。RT-PCR鉴定的结果显示,有32份病料可判为阳性;这32份病料接种的F81细胞,均出现明显的细胞病变。VP1基因序列分析显示,32株分离毒间的核苷酸同源性为69.2%～99%,氨基酸同源性为82.1%～99.9%。与国外分离株相比,32株分离株同国内分离株的同源性更高。系统发育树分析显示,32株分离株有12株与国内分离株遗传关系较近,15株与英国株遗传关系较近,别外4株与多国分离株形成独立分支。对VP1 D-E区的B细胞线性表位分析发现,D区和conE区的2个表位比较保守,而5′HRV区的表位存在较大变异。尽管32个毒株分离于同一地区和相近的时间段,主要抗原VP1基因差异仍然较大,多数达20%～30%不等。以上结果表明,FCV在杭州地区广泛流行,且呈现明显的遗传多样性,给病毒的分子流行病学监测和疫苗防控带来巨大挑战。     

5株猫杯状病毒中国分离株的细胞适应性及遗传进化分析

将CH-JL1、CH-JL2、CH-JL3、CH-JL4、CH-SH 5株猫杯状病毒中国分离株分别在F81细胞上连续传至15代。细胞传代前,测定病毒的细胞半数感染量(TCID_(50)),再以0.1 MOI的感染复数接种细胞。采用RTPCR方法扩增FCV各代次的ORF2基因片段并测序,用DNASTAR和MEGA软件分析其氨基酸变异和遗传进化特点。试验结果显示,细胞适应传代后,FCV各代次毒株滴度逐渐稳定,均位于10~(-9)TCID_(50)/mL~10~(-10)。TCID_(50)/mL之间。ORF2基因测序表明,FCV传代后氨基酸变异位点包括CH—JL1的P57S和G494R、CH-JL3的S440L和N519D、CH—JL4的V614I、CH—SH的K448R。遗传进化分析表明CH—JL2和CH-JL3处于同一进化分支上,同源性为95.9%;CH-JL1和国内FB-NJ-13株、CH-SH和国内GD株分别在一个进化分支,CH-JL4和国外F65株遗传关系较近。5株猫杯状病毒在F81细胞传代后滴度较高,稳定性良好,为将来FCV疫苗株的研发奠定了基础。     

猫细小病毒的遗传演化及分离毒株的致病性分析

本研究旨在了解猫细小病毒（feline parvovirus,FPV）流行株的遗传演化情况及分离毒株的致病性。2018—2020年,在山东地区采集54份疑似猫瘟粪便拭子,并通过PCR和VP2基因克隆进行VP2基因全长测序,构建遗传进化树,并推导出氨基酸序列并与疫苗株进行比对,分析遗传变异情况。用F81细胞分离培养1株FPV毒株,命名为FPV-QDC20,经电镜观察、间接免疫荧光、血凝试验、TCID₅₀测定、全基因测序及动物回归试验研究该毒株生物学特性。结果表明,采集样品中16份样品VP2基因全长测序成功,其中,15份为FPV,1份为猫源犬细小病毒（CPV）。构建系统进化树显示,本研究的FPV毒株均处于同一大分支,与中国其他地区已发表的FPV毒株亲缘关系较近,与欧洲分离株以及疫苗株亲缘关系较远。氨基酸序列分析表明,某些关键位点的改变可能导致宿主范围和感染性的改变,有可能导致免疫失败情况发生。毒株QDBL2毒株中出现了80、93、103三个FPV保守位点的变异,或许与犬猫细小病毒的共感染和重组有关。动物回归试验表明,毒株FPV-QDC20有较强致病性,试验猫出现典型的临床症状和病理变化,并最终死亡。本研究有助了解我国FPV毒株遗传演化方向,为将来的疫病监控和疫苗研究提供参考。     

猫杯状病毒分离株VP1基因序列与致病性分析

旨在了解上海地区猫杯状病毒(feline calicivirus, FCV)VP1基因与致病性,采用常规方法分离鉴定出13株FCV,经RT-PCR和测序获得分离株VP1的基因序列,与参考株VP1基因进行同源性和遗传演化分析,对2株分离株进行动物致病性试验。结果显示,13株上海地区分离株VP1基因核苷酸序列相互间相似性为74.3%～99.8%,与参考株核苷酸序列和氨基酸序列相似性也较低,符合FCV易突变的特征;进化树分析表明,上海地区FCV流行株主要来自国内北方地区,少数毒株来自国外地区;通过对宿主临床症状、VP1进化树和VS-FCV特征性氨基酸位点进行分析,筛选出7株FCV强毒株;动物致病性试结果验表明,FCV-SH202101株和FCV-SH202113株可导致感染猫发病和死亡,潜伏期为1～2 d,接种后第3天即可检测到排毒,不同年龄段猫的病程不一致,可导致幼猫5 d后死亡,成年猫病程可持续11～18 d, 2株分离株在致病性方面均符合VS-FCV特征。本研究丰富了中国FCV的分子流行病学资料,为VS-FCV毒株的筛选提供了有力的证据,也为FCV疫苗的研究提供了技术支持。     

猫泛白细胞减少症病毒的分离鉴定及VP2基因遗传变异分析

为了探究呼和浩特地区猫泛白细胞减少症病毒(Feline panleukopenia virus, FPV)的流行毒株及其VP2基因的遗传变异情况,试验采用病毒分离、形态学观察、PCR方法及间接免疫荧光试验对疑似感染FPV猫的粪便进行检测,通过动物致病性试验检测病毒的致病性,采用PCR方法扩增病毒的VP2基因并测序,分析其遗传变异情况。结果表明：分离毒株在F81细胞中培养96 h后出现细胞病变;电镜观察到直径为25 nm左右的病毒粒子;PCR检测可扩增得到大小约为1 555 bp的特异性条带;间接免疫荧光检测可观察到绿色荧光;分离株对猫具有致病性;测序后确定分离株为FPV,将其命名为HHHT-1株。HHHT-1株与GenBank中18株FPV参考毒株的同源性为98.8%～99.7%,与FPV-Beijing-01株、FPV-Shenyang-05株位于同一分支,遗传距离较近,同源性在99.4%～99.7%之间。HHHT-1株的VP2基因序列中只是个别碱基发生变化,编码的氨基酸未发生缺失。说明FPV的VP2基因变异率较低。     

一例梅花鹿布氏杆菌和日本乙型脑炎混合感染的诊断

2018年3月17日,贵州省某梅花鹿场的梅花鹿(Cervus nippon)出现关节肿大、下颌肿大、睾丸单侧肿胀,还伴有严重的跛行等症状。采集4份该发病梅花鹿的血样送检。检测结果表明,通过虎红平板凝集试验2份血样检测出了布氏杆菌感染,4份血样经RT-PCR均扩增出了JEV NS1部分基因的特异性条带,PCR产物测序结果分析显示,4份梅花鹿血样的JEV NS1基因(GZ-015、GZ-019、GZ-022、GZ-039)间的核苷酸同源性分别为99. 9%、99. 3%、99. 4%,与强毒株SA-14、国内外的疫苗株及四川、吉林等地的JEV分离株之间核苷酸同源性为99%以上,GZ-015、GZ-019、GZ-022、GZ-039与强毒株SA-14、弱毒株、国内外的疫苗株及四川、吉林等地的JEV分离株处于同一个较大的遗传进化分支。     

嵌合猫杯状病毒F9株感染性克隆的构建及病毒拯救

为构建猫杯状病毒(FCV)弱毒株F9的感染性克隆,本研究利经PCR分段扩增了FCV各基因片段,并拼接出FCVF9全基因组序列。经测序显示,其1823位多出一个碱基造成该序列存在移码突变,经替换为pOK-2280(已构建出的FCV强毒株的感染性克隆)相应序列并对差异氨基酸逐个突变,最终获得嵌合FCVF9全基因组的重组质粒pOK-F9H。将线性化的pOK-F9H体外转录,获得的加帽RNA转染F81细胞,得到了拯救病毒rFCVF9。经过对拯救病毒与亲本病毒的蚀斑形成能力、CPE形成能力和多步生长曲线分析,结果显示rFCVF9与亲本株在复制能力和体外生长能力方面基本一致,表明构建了嵌合FCVF9株的感染性克隆并拯救出重组病毒。本研究构建的嵌合FCVF9株感染性克隆可以为FCV的基因功能研究以及新型FCV疫苗的研发奠定基础。     

规模化猪场戊型肝炎病毒感染状况的调查与分析

为调查规模化猪场中戊型肝炎病毒(HEV)感染和流行特征,首先在4个猪场采集血样80份,用酶联免疫吸附试验(ELISA)榆测抗-HEV IgG抗体.在此基础上,作者于2007-2009年采集规模化猪场肛拭子样品415份,及规模化猪场送检的临床病猪肝脏样品135份,应用巢式PCR(RT-nPCR)方法进行HEV RNA检测,将PCR扩增产物测序,利用Neighbour-joining法进行进化分析.结果:4个猪场80份血清中HEV阳性血清56份,抗-HEV抗体阳件率高达60.0%以上.8个规模化猪场中有5个猪场的肛拭子检测到HEV,肛拭子阳性率8.43%(35/415);从临床送榆的发病猪采集的肝脏样品中HEV阳性率为15.55%(21/135);HEV RNA最早检出日龄为7 d,最晚检出日龄为84 d.遗传进化分析表明:测序的38株阳性毒株之间同源性为92%～100%,均属于HEV基因4型.其中,从肛拭子中分离的毒株(FJ445406)与猪源毒株DQ279091株处在同一分支上;而肝脏中分离的毒株(GQ202266.1)和人源毒株处在一个亚支,属于4型巾的同一亚型,表明该毒株与人源毒株亲缘关系较近.本研究表明华中地Ⅸ猪群中普遍存在HEV感染,阳性率较高.本研究为规模化猪场HEV的防控提供了依据.     

东北三省部分地区猫细小病毒VP2基因进化分析

为了研究我国东北三省部分地区猫细小病毒(Feline parvovirus, FPV)基因的遗传进化情况,试验用PCR方法对我国东北地区25份猫肛拭子进行检测,并对检测结果呈阳性的猫进行细小病毒VP2基因克隆测序,然后进行遗传进化分析。结果表明:经PCR扩增有10份为FPV阳性,其VP2基因序列与标准株M38246和疫苗株EU498681及EU498680的相似性达99.1%以上,有9株属于G1群,1株属于G2群。说明东北地区FPV基因型主要以G1群为主。     

检测猫杯状病毒RT-qPCR方法的优化与应用

为建立一种通用性良好的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法,根据GenBank上猫杯状病毒(feline calicivirus, FCV) ORF1保守区域序列,设计合成1对特异性引物,用于FCV的快速检测。灵敏性试验结果显示,该方法的检测下限为4.93×10¹拷贝/μL,比普通RT-PCR检测下限高100倍;特异性试验结果显示,该检测方法与猫疱疹病毒、猫细小病毒、猫传染性腹膜炎病毒等无交叉反应;通用性试验结果显示,针对引物靶位点区间,该方法对所有已知变异位点的人工合成质粒和本实验室保存的不同变异位点的FCV毒株,均能够良好检出;重复性试验结果显示,组内的变异系数为0.09%～0.71%,组间变异系数为0.05%～0.82%,均小于1%。对23份临床样品进行检测,该方法的阳性检出率为60.9%,检出的14份阳性病料分别接种到CRFK细胞中,对细胞病变产物进行扩增并测序,BLAST对比后结果证实为FCV毒株。结果表明,本试验建立的荧光定量RT-PCR检测方法可用于FCV的快速诊断及流行病学的调查。     

广西北部湾地区猪圆环病毒2型检测及其ORF2遗传变异分析

为了解猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)在广西北部湾地区的流行情况和其ORF2基因的遗传变异规律,本研究采用PCR方法对2016年采自广西北部湾地区规模猪场和农村散养户的306份疑似PCV2感染猪的血液和组织样品进行了PCV2的病原学检测,同时对分离的4株PCV2 ORF2基因进行PCR扩增、克隆和测序,并与Gen Bank中登录的34株国内外PCV2参考株ORF2序列进行比对和遗传进化分析。结果表明:PCV2检测阳性样品为129份,阳性率为42.16%。随机选取的4份阳性病料PCV2 ORF2基因测序结果显示,4个毒株遗传关系上均属于Group 1(PCV2b),其中BBW-1和BBW-2分离株属于1A分支且分别与Fd3株(AY321984)和NL_PMWS_3株(AY484415)同源性较高,BBW-3和BBW-4分离株属于1B分支且BBW-4分离株与Hu Zhou0301株(AY536756)和NL_Control_1株(AY484407)同源性较高,其ORF2基因核苷酸和氨基酸同源性分别为98.9%~99.5%和93.9%~95.4%,说明该地区PCV2的优势基因型是PCV2b。研究结果不仅有利于掌握广西北部湾地区PCV2流行毒株同源性情况,而且将为该地区(porcine circovirus associated disease,PCVAD)的防治和新型疫苗的研制提供依据。     

河北北部猪圆环病毒2型流行毒株的遗传变异分析

为了掌握河北北部地区猪圆环病毒2型(PCV2)流行病学特点和遗传变异情况,应用PCR检测方法对2015—2017年间收集的河北北部猪场86份临床病料进行PCV2检测,并对阳性毒株的全基因进行扩增、克隆和测序。结果显示,86份临床样品中,有38份样品为PCV2阳性,阳性率为44.19%,选取11株进行病毒全基因扩增,并利用序列比对软件进行遗传变异分析发现,11株病毒之间同源性为95.9%～99.9%,与各参考毒株之间同源性为93.5%～99.9%。在遗传进化关系上,11株病毒分别处于2个分支:PCV2b和PCV2d,表明河北北部地区PCV2流行比较广泛,并且以PCV2b和PCV2d毒株流行为主。本研究充实了河北北部地区PCV2流行病学调查资料,也为河北PCV2疫苗株的研发和选择提供了依据。     

广西地区犬细小病毒检测及VP2基因序列分析

为了调查广西地区犬细小病毒(CPV)的优势毒株及其遗传变异情况,试验利用PCR方法对采自广西地区的423份犬血清样本进行CPV检测并扩增其VP2基因,利用MegAlign软件进行同源性比对并分析VP2蛋白主要突变的氨基酸位点,同时利用MEGA 7.0软件采用邻接法构建遗传进化树。结果表明：共获得55份CPV阳性血清样本,阳性率约为13.0%。PCR扩增得到大小约为1 755 bp的VP2基因。55株分离毒株之间的相似性为98.6%～100%;分离毒株与国内外参考毒株的相似性为97.4%～100%,与疫苗株Pfizer/vaccine/06的相似性为98.3%～98.9%。扩增序列的推导氨基酸主要在第5,297,370,426,440位发生变异。在55株分离毒株中,有32株为New CPV-2a亚型毒株,20株为CPV-2c亚型毒株,3株为New CPV-2b亚型毒株。55株分离毒株形成3个主要的流行分支,与国内参考毒株的亲缘关系较近,而与国外参考毒株、猫细小病毒的亲缘关系较远。说明New CPV-2a、CPV-2c、New CPV-2b亚型毒株在广西地区流行广泛,正逐步取代CPV-2a...     

建立快速区分猪繁殖与呼吸综合征病毒经典毒株、高致病性毒株、天津疫苗株RT-PCR方法的研究

为了快速区分猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)经典毒株、高致病性毒株和天津疫苗株,试验通过建立的RT-PCR方法获得电泳条带大小不同的PCR产物,以此区分猪繁殖与呼吸综合征病毒经典毒株、高致病性毒株和天津疫苗株,并用RT-PCR方法检测实验室保存的12份临床阳性样品。结果表明:可以通过RT-PCR方法区分经典毒株、高致病性毒株、天津疫苗株,并且与猪瘟病毒、猪圆环病毒2型等猪常见病毒无交叉反应;临床样品检测试验显示,1份为经典毒株、5份为高致病性毒株、5份为天津疫苗株,与测序结果相符。说明试验成功建立了同时区分猪繁殖与呼吸综合征病毒经典毒株、高致病性毒株和天津疫苗株的RT-PCR方法,且特异性强、灵敏度较高、重复性好、操作简单。