昆虫细胞无血清培养基的研究

为开发昆虫细胞无血清悬浮培养基,以基础培养基Grace's Insect medium为基础,添加葡萄糖、水解乳蛋白、酵母粉和PF-68等组份后,分别接种Sf-21、Hi-five两种昆虫细胞进行无血清悬浮培养。结果显示:两株昆虫细胞生长均较好,均能够很好的全悬浮生长,Sf-21细胞最高密度可达(39.8±2.6)×105/ml,Hifive细胞最高密度可达(44.4±1.0)×105/ml。本研究为昆虫细胞培养提供一种无血清悬浮培养基配方,为我国利用昆虫细胞杆状病毒表达系统生产生物制品提供基础保障。     

昆虫细胞无血清培养基研究进展

随着昆虫杆状病毒表达载体系统的广泛应用,昆虫细胞大规模无血清培养已成为一种发展趋势。目前的昆虫细胞培养基中主要有糖类、维生素、氨基酸、脂类、无机盐、有机酸等基础成分,此外还需要添加血清或酵母提取物和水解乳蛋白等血清替代物。然而使用血清会带来诸多难以解决的问题,因此开发使用血清替代物和无血清培养基已成为生物制品行业关注的主要方向。论文综述了昆虫细胞无血清培养基的研究进展,包括研究历程、研究现状、基础成分和其他添加物等。     

Vero细胞无血清培养基研究进展

Vero细胞是世界卫生组织和我国生物制品规程认可的生产人和动物疫苗的细胞系。为了避免外来污染和血清中不确定成分对细胞生长及其下游工作带来的影响,用无血清培养基或化学成分明确的培养基培养Vero细胞已成为病毒疫苗生产的一个重要发展趋势。Vero细胞无血清培养基的组成包括基础培养基和添加因子两大部分,常见的添加因子有转铁蛋白、胰岛素、微量元素、生长因子和维生素等。论文对Vero细胞无血清培养基的研究进展做一综述,以期为Vero细胞的无血清培养基研制及疫苗的生产提供参考。     

哺乳动物细胞无血清全悬浮培养技术研究进展

随着生物制品行业的快速发展,哺乳动物细胞无血清全悬浮培养技术已经运用到越来越多的领域中。该技术能够扩大哺乳动物细胞培养的规模,提高生物制品的产量及质量,拓宽哺乳动物细胞的应用领域,并促进哺乳动物细胞生产实现工业化与产业化。但悬浮驯化后的细胞,与父母代细胞相比,蛋白表达水平与生长调节通路均发生了不同程度的改变,使其生产性能受到影响。对此,国内外学者开展了大量的研究并取得了较好进展。作者阐述了哺乳动物细胞无血清全悬浮培养技术的研究现状以及临床生产工艺的优化策略,以期为哺乳动物细胞无血清全悬浮培养技术的发展提供参考。     

Marc-145细胞培养条件摸索及其初步应用

Marc-145细胞,上皮样细胞,来源于猴肾细胞,从母细胞(Ma-104细胞)克隆而得到,可连续传代培养。此细胞主要用于病毒的培养,特别是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)对此细胞尤为敏感,本试验主要研究Marc-145的适宜培养条件,以及PRRSV野毒株在该细胞中的增殖。     

Marc-145细胞PKR基因遗传分析与表达

旨在克隆Marc-145细胞蛋白激酶R(PKR)基因,对其进行遗传特性及表达研究。利用RT-PCR克隆获得Marc-145细胞PKR基因,并对其核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行同源性与遗传进化分析;将该基因分别插入pEGFP-C1与pEGFP-N1多克隆位点,构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合真核重组质粒,转染HEK293细胞,通过荧光显微镜观察、Western blot检测EGFP标签,开展PKR融合表达研究。结果显示,成功克隆获得Marc-145细胞PKR基因,编码区为1 653 bp,推导编码550个氨基酸,与选取的灵长类及哺乳动物参考物种PKR基因核苷酸序列同源性在72.2%～99.8%之间,氨基酸序列同源性在55.4%～99.5%之间,与豚鼠及其供体物种非洲绿猴(Cercopithecus aethiops)同源性分别为最低、最高;成功构建了EGFP-PKR融合质粒,但荧光蛋白观察及Western blot检测表明,仅C端融合质粒成功表达。结果表明,成功克隆了Marc-145细胞PKR基因并进行了融合表达,为进一步开展猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在感染细胞与细胞内...     

PRRSV NVDC-JXA1株在Marc-145细胞上增殖条件的优化

为了在Marc-145细胞上获得更高滴度的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)NVDC-JXA1株,优化了细胞培养条件、病毒接种剂量、病毒吸附时间、收毒时间和病毒冻融次数等条件。结果表明Marc-145细胞在MEM培养基、新生牛血清含量80 mL/L,细胞接种密度150 000个/mL,pH7.0条件下生长状态最好;PRRSV NVDC-JXA1株的最佳接种剂量为400 TCID50/mL,病毒吸附时间为30 min,收毒时间为接种后72 h,在-20℃冻融3次,PRRSV NVDC-JXA1株增殖效果最好。该结果为NVDC-JXA1株PRRSV疫苗的生产提供了依据。     

生物反应器中PRRSV TJM株在Marc-145细胞上最佳增殖条件研究

为了在Marc-145细胞上获得更高滴度的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)TJM株,对细胞培养条件、细胞接种量、微载体的用量以及病毒培养时间等条件进行了优化。结果表明,利用生物反应器悬浮培养Marc-145细胞在血清为金源康且含量为10%、培养基为DMEM、细胞接种密度为20~30细胞/球、微载体为5 g等条件下生长状态最好;病毒最佳培养时间为27~36 h,病毒增殖效果好且能够达到最高的病毒滴度。本试验为微载体培养条件下大规模生产PRRSV-TJM株疫苗奠定了一定理论基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒在Marc-145细胞微载体上培养条件的研究

通过研究搅拌程序,细胞接种密度,微载体浓度与细胞生长的关系,探索Marc-145细胞在微载体上的生长条件,并测定猪繁殖与呼吸综合征病毒在微载体培养的细胞上的TCID50。结果表明:细胞接种密度为4.28×105 cells/mL时,病毒滴度可达到107.5TCID50,这说明利用微载体繁殖PRRSV是可行的,为猪繁殖与呼吸综合征疫苗的大规模生产奠定实验基础。     

中药体外对Marc-145细胞的影响及抗PRRSV突变株的作用

将板蓝根、甘草和鱼腥草3种单味中药各含量为100mg/mL的中药粗提物作连续倍比稀释后,采用CPE和MTT法将其在Marc-145细胞上进行最大安全质量浓度和对细胞增殖的影响试验,同时采用体外细胞培养的方法在Marc-145细胞上进行抗猪繁殖与呼吸综合征病毒突变株(PRRSV PX株)作用试验。结果显示,3种中药粗提物最大安全作用质量浓度板蓝根和甘草均为3.125g/L、鱼腥草为1.563g/L;板蓝根、甘草、鱼腥草分别在3.125～0.049、3.125～0.195、1.563～0.391g/L时测得细胞D值大于细胞对照组,对细胞分裂增殖均有促进效果,最佳作用质量浓度均为1.563g/L;3种中药粗提物有不同程度的抗PRRSV PX株作用,板蓝根和甘草粗提物阻断、抑制PRRSV PX株感染及直接灭活PRRSV PX株效果最好的质量浓度;阻断为3.125、3.125g/L、抑制为1.563、0.391g/L:阻断、直接灭活为0.782、0.782g/L,鱼腥草粗提物在0.782g/L时阻断和抑制PRRSV PX株效果为好,但其对PRRSV PX株基本没有直接灭活作用。     

稳定高效表达猪CD163的Marc-145细胞系的构建与鉴定

试验旨在构建一株高效表达猪CD163(pCD163)的Marc-145细胞系,为猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的临床分离和疫苗生产奠定基础。根据GenBank中序列设计引物从猪肺泡巨噬细胞(PAM)中扩增pCD163基因,将其插入真核表达载体pCI-neo构建真核表达质粒pCI-pCD163,将该重组质粒转染Marc-145细胞,通过G418筛选、单克隆化并扩大培养筛选获得表达pCD163的Marc-145细胞系,IFA、Western blotting鉴定其表达情况。IFA结果显示,构建的pCD163-Marc细胞系中荧光明显亮于普通Marc-145细胞;Western blotting结果显示,pCD163-Marc细胞系中CD163蛋白表达量约为对照Marc-145细胞中CD163蛋白表达量的8.7倍。且该细胞系可稳定传至20代,各代次之间表达量无差异。证明高效表达猪CD163的Marc-145细胞系构建成功。     

不同猪繁殖与呼吸综合征病毒分离株在Marc-145细胞的生长特性研究

本试验对PRRSV-CG、YN9、TP、TP-A及SHB株在Marc-145细胞上进行了部分体外生长特性研究。病毒生长曲线分析发现TP-A毒株产生病变速度快且病毒滴度高,其次为YN9、TP、CG和SHB;病毒蚀斑形态学分析发现TP-A和YN9较其余毒株形成的蚀斑大且比较均一,为大蚀斑。综合可见不同的PRRSV分离株体外生长特性具有较大的差异,为病毒的分子生物学研究奠定了基础。     

Marc-145细胞接种PRRSV后多次收毒的探索

为提高单个Marc-145细胞的产毒数量,减少原材料的损耗,提高生产效率,对接种猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的Marc-145细胞在24h或36h收毒,随后补入不含病毒的维持液,12h或24h后再收毒,反复收毒4次。结果表明,数次收获毒液的TCID_(50)差异不显著,且与常规接毒细胞所产毒液的TCID_(50)基本相同,说明多次收毒在实际生产中具有应用前景。     

PKR基因表达高效阻断Marc-145细胞系建立及其对PRRSV增殖的影响

研究猪繁殖与呼吸障碍综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)在Marc-145细胞蛋白激酶R(interferon-induced, double-stranded RNA-activated kinase, PKR)下调表达状态下的感染特性。以Macr-145细胞PKR基因序列设计3个shRNA,并设阳性对照,合成后插入pSilencer^TM 2.1-U6载体构建重组质粒,与Macr-145细胞PKR+EGFP标签融合表达的重组质粒共转染HEK293细胞,以筛选能下调表达PKR的shRNA,并将该shRNA重组质粒转染Marc-145细胞,潮霉素B抗性筛选并克隆纯化获得PKR下调表达的细胞系,感染重组病毒PRRSV XZ06a-EGFP,通过检测病毒结构蛋白M与EGFP表达、观察细胞病变等,研究此状态下感染特性。结果显示筛选获得致使PKR下调表达的shRNA,以及稳定表达shRNA、PKR表达降低90%以上的Marc-145细胞系,重组病毒感染后48 h, M蛋白与EGFP表达均受到抑制,且...     

Marc-145细胞CD151蛋白主要抗原表位区的表达及其与猪繁殖与呼吸综合征病毒感染关系的研究

为研究CD151与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染的关系,根据GenBank中已发表的CD151蛋白的基因序列设计并合成一对特异性引物,从Marc-145细胞中扩增出294 bp的CD151基因片段并克隆入pGEX4T-3载体,转化人大肠杆菌用IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定.表达蛋白纯化后用于免疫小鼠制备抗CD151蛋白血清,用ELISA和IFA检测抗血清的效价及特异性.将抗CD151蛋白血清与Marc-145细胞孵育后再感染PRRSV,观察细胞CPE验证该血清对PRRSV的阻断效果.结果表明成功构建了pGEX4T-3-CD151,获得了相对分子质量为37 ku的重组CD151蛋白.制备的抗血清特异性结合Marc-145细胞并有效阻断PRRSV感染Marc-145细胞.这些研究结果为进一步阐明CD151与PRRSV感染的关系提供一定的理论基础.     

Nsp9基因在Marc-145细胞上对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的影响

试验旨在验证Nsp9基因是否影响猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）的复制。构建含有Nsp9全长基因的质粒pIRES2-EGFP-Nsp9,并转染到Marc-145细胞中,接毒之后分别通过实时荧光定量PCR和Western blotting方法测定PRRSV N蛋白在mRNA和蛋白水平的表达。结果显示,转染Nsp9基因的Marc-145细胞上PRRSV的N蛋白在mRNA水平上显著高于未转染Nsp9基因的对照组（P<0.05）,是对照组的1.5倍,同时转染Nsp9基因后的Marc-145上PRRSV N蛋白水平也明显高于对照组。随着剂量的增加,N蛋白的表达量在mRNA和蛋白水平都有所增加。由以上结果初步可知,Nsp9基因可以在Marc-145细胞上促进PRRSV的复制,Nsp9基因与其复制密切相关。     

适应无血清培养的HEK293细胞系的培育

为培育适合腺病毒增殖的无血清培养细胞系,本研究采用培养液渐进替换的方法获得了一株适应无血清培养的HEK293细胞(293SF),经检测293SF细胞具有稳定的支持腺病毒增殖与表达外源蛋白的能力;平均病变时间为97 h,比HEK293细胞缩短12.9%;毒价达到107.48TCID50/mL,比HEK293细胞提高43.3%;并且稳定性良好,连续传16代后293SF细胞状态与易感性未发生变化。该细胞系为腺病毒的无血清培养奠定基础。     

猪繁殖与呼吸综合征CH-1R弱毒株低血清培养工艺研究

Marc-145细胞是用于猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)培养的易感细胞。通过对PRRSV CH-1R高敏感Marc-145/D2克隆细胞株培养特性的研究,以及分析病毒在不同血清浓度细胞维持液中的增殖水平,筛选出最佳培养条件。结果表明,以Marc-145/D2克隆细胞株无血清转瓶培养PRRSV CH-1R的抗原效价可达到108.0TCID50/mL以上。