鸭病毒性肠炎gB基因的原核表达及产物的抗原性分析

利用DNAStar分析并筛选出鸭病毒性肠炎病毒gB基因的两段主要抗原区域,PCR扩增出这两段主要抗原区域并克隆进入载体pMD18-TVector,目的基因经PCR和酶切鉴定后连接至原核表达载体pET-32a(+)。获得的重组质粒分别转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞,SDS-PAGE电泳分析显示重组蛋白在IPTG诱导下以包涵体的形式高效表达,Western-bloting及免疫鼠血清ELISA抗体检测结果表明重组蛋白具有良好的免疫原性。     

鸭坦布苏病毒Capsid蛋白原核表达及多克隆抗体制备

【目的】本研究选择原核表达系统表达鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus, DTMUV)核衣壳蛋白(Capsid protein),并制备其多克隆抗体,为DTMUV分子机制研究奠定基础。【方法】根据DTMUV-201909株基因序列,运用一步克隆技术将Capsid基因克隆至表达载体pET-30a(+)中,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,利用IPTG进行诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白;使用ISA206佐剂与纯化后的重组蛋白混合乳化后免疫BALB/c小鼠,以获得多克隆抗体。间接ELISA方法测定获得的多克隆抗体效价,并对多克隆抗体进行Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)验证。【结果】试验成功构建pET-30a-Capsid重组质粒,SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白大小约为18 ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果表明,该蛋白能与抗His标签鼠单克隆抗体发生特异性反应,具有良好反应原性。间接ELISA结果显示,制备的鼠抗Capisd蛋白多克隆抗体效价可达1...     

鸭坦布苏病毒E蛋白的原核表达

本研究利用RT-PCR方法扩增鸭坦布苏病毒(Duck tembusu virus,DTMUV)奉贤株(FX2010)的结构蛋白E基因,并将其克隆至原核表达载体pET32a(+),构建重组表达质粒pET32a-E。将其转化受体菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导进行表达。SDS-PAGE和Western blot试验检测结果表明,E基因在大肠杆菌中得到了表达,并且可与抗DTMUV的多克隆抗体发生特异性反应。E基因的成功表达为DTMUV的诊断试剂盒、疫苗等的研制奠定基础。     

鸡毒支原体黏附蛋白PvpA的原核表达与纯化

利用基因重组技术将PvpA基因的PCR扩增产物与原核表达栽体pET-41a(+)连接,转化入DH5a感受态细胞,通过PCR、双酶切及测序鉴定后,将阳性重组质粒转化入大肠杆菌BL21(D3)受体菌,用IPTG诱导蛋白表达.用纯化后的融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备PvpA蛋白多克隆抗血清,并用Western blotting检验抗体特异性.结果表明,本研究成功获得PvpA纯化蛋白,在免疫印迹试验中,兔抗PvpA高免血清能与目的蛋白发生阳性反应,证实表达产物为特异性蛋白.     

委内瑞拉马脑炎病毒E2蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

原核表达并纯化委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus,VEEV)E2蛋白胞外区,并以此为抗原免疫动物制备多克隆抗体。利用PCR扩增VEEV E2蛋白胞外区基因并将其插入到原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒pET-30a(+)-VEEV-E2,转化至大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白表达。优化诱导条件并对目的蛋白进行亲和纯化,用纯化后的蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,通过间接免疫荧光方法检测抗体的结合能力。通过PCR扩增出约为1 023bp的VEEV E2基因胞外区,成功构建重组表达质粒pET-30a(+)-VEEV-E2,在37℃,0.6mmol/L IPTG诱导3h条件下目的蛋白表达量最高且主要以包涵体形式存在;将纯化的目的蛋白免疫BALB/C小鼠成功制备了抗VEEV E2蛋白胞外区鼠源多克隆抗体,经间接免疫荧光鉴定制备的抗体能够特异性识别真核表达的VEEV E2蛋白。VEEV E2基因胞外区在大肠杆菌中获得稳定表达,且表达的目的蛋白具有良好的免疫原性,为VEEV快速诊断方法及新型疫苗的研究奠定了基础。     

猪圆环病毒2型CC株ORF3基因的克隆与原核表达

为原核表达猪圆环病毒2型(PCV2)的ORF3编码蛋白,本研究采用PCR方法以PCV2的CC株的基因组DNA为模板扩增ORF3基因,将其克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,转化大肠杆菌BL21 (DE3),经IPTG诱导表达.SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白约为31ku,并且以包涵体形式存在;western blot分析表明,ORF3重组蛋白能够与鼠抗His标签单克隆抗体发生特异性反应,表明原核表达的ORF3重组蛋白具有良好的反应原性.     

非洲猪瘟病毒Georgia 2007/1株CD2v蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

本研究旨在通过原核表达系统表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)Georgia 2007/1株EP402R基因,获得其编码的CD2v重组蛋白,并针对纯化的CD2v重组蛋白制备多克隆抗体。将ASFV EP402R全长基因进行密码子优化后连入pET-28a(+)表达载体,构建原核重组表达质粒,经1 mmol/L IPTG于16℃诱导12 h后,利用SDS-PAGE和Western blotting对重组蛋白进行表达鉴定和反应原性分析。以纯化的CD2v重组蛋白为免疫原制备鼠源抗CD2v多克隆抗体,随后以间接ELISA方法、间接免疫荧光试验及Western blotting分别检测多克隆抗体的效价和特异性。结果显示,ASFV EP402R基因克隆至pET-28a(+)获得pET-28a-EP402R重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后经诱导表达获得CD2v重组蛋白,其大小约为47 ku,重组蛋白主要以包涵体形式存在,部分也可以融合表达蛋白形式存在。Western blotting结果显示,其可溶性上清经镍柱纯化后能被ASFV阳性血清识别,具有良好的反应原性。间接ELISA检测该多克隆抗体效价可达1∶512 000,间接免疫荧光试验和Western blotting表明该多克隆抗体可特异性识别真核表达的CD2v蛋白。以上结果表明,通过原核表达的ASFV CD2v重组蛋白具有较好的免疫原性,利用重组蛋白制备的多克隆抗体具有较高的抗体效价和特异性,为进一步研究ASFV EP402R生物学功能及基因缺失毒株的鉴别诊断和疫苗开发提供技术储备。     

鸭坦布苏病毒NS1基因的克隆及原核表达

为原核表达鸭坦布苏病毒(Duck tembusu virus,DTMUV)NS1重组蛋白,本研究通过RT-PCR方法扩增NS1基因,将其亚克隆至pET32a(+)载体中构建重组表达质粒pET32a-NS1。将其转化大肠杆菌Rosetta中,经IPTG诱导表达了约59 ku的重组蛋白。Western blot分析表明,该重组蛋白可以与DTMUV阳性血清发生特异性反应,表明其具有良好的反应原性。     

鸭坦布苏病毒E蛋白结构域Ⅰ-Ⅱ与Ⅲ的反应原性和免疫原性比较

为了比较鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus, DTMUV)E蛋白结构域Ⅰ-Ⅱ(EDⅠ-Ⅱ)与结构域Ⅲ(EDⅢ)的反应原性和免疫原性,试验将重组质粒pET-EDⅠ-Ⅱ[EDⅠ-Ⅱ基因插入表达载体pET-30a(+)构建的重组质粒]和pET-EDⅢ[EDⅢ基因插入表达载体pET-30a(+)构建的重组质粒]分别转化至大肠杆菌(E.coli)Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后,对表达产物进行SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定,采用亲和层析法纯化重组蛋白EDⅠ-Ⅱ和EDⅢ,通过Dot-blot试验和间接ELISA试验比较二者的反应原性;将重组蛋白EDⅠ-Ⅱ和EDⅢ免疫小鼠,通过测定免疫小鼠血清中特异性抗体、病毒中和(VN)抗体和细胞因子(IL-6、IFN-γ)水平比较两者的免疫原性;将DTMUV分离株感染重组蛋白EDⅠ-Ⅱ和EDⅢ免疫小鼠,采用实时荧光定量PCR方法检测小鼠肺脏、肝脏和脑组织中DTMUV RNA相对表达水平,比较重组蛋白EDⅠ-Ⅱ和EDⅢ对免疫小鼠的保护力。结果表明：含重组质粒pET-EDⅠ-Ⅱ和pET-EDⅢ诱导4 h的菌体蛋...     

鸡肠炎沙门氏菌ompA基因的克隆与表达

根据GenBank中鸡肠炎沙门氏菌ompA基因序列设计1对引物,以鸡肠炎沙门氏菌贵州分离株基因组为模板,扩增鸡肠炎沙门氏菌ompA基因,将其亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET-32a-ompA,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞, 经IPTG诱导, 实现了鸡肠炎沙门氏菌ompA蛋白在大肠杆菌中的表达。SDS-PAGE分析结果表明, 该重组蛋白的分子质量约为55 ku,可溶性分析结果表明表达蛋白大部分以包涵体形式存在。Western blotting分析结果表明,该重组蛋白具备免疫原性。     

扩展莫尼茨绦虫vasa基因的原核表达及多克隆抗体的制备

试验旨在表达、纯化扩展莫尼茨绦虫VASA蛋白,并制备兔抗VASA多克隆抗体。根据扩展莫尼茨绦虫全基因核苷酸序列设计特异性引物,利用PCR方法扩增vasa基因片段;将扩增产物与原核表达载体pET-22b(+)连接,获得重组质粒pET-22b-VASA;经Amp抗性筛选阳性菌,双酶切、PCR测序鉴定后,将其转化大肠杆菌(DE3)感受态细胞中,并进行IPTG诱导表达;重组融合蛋白经镍柱纯化后,进行Western blot鉴定;将融合蛋白免疫兔,制备多克隆抗体。结果显示,重组质粒pET-22b-VASA构建正确,通过IPTG诱导获得大小约32 200的VASA重组融合蛋白;Western blot分析表明其与鼠抗His单克隆抗体呈阳性反应。纯化的VASA蛋白免疫兔获得了多克隆抗体,ELISA检测其效价为1∶128 000。本试验成功制备了具有免疫原性的VASA蛋白及其兔源多克隆抗体,为VASA蛋白生物学功能及该蛋白在绦虫体内的分布等研究奠定基础。     

瑶山亚种树鼩ISG15蛋白表达及其多克隆抗体制备

【目的】克隆瑶山亚种树鼩干扰素刺激基因15(interferon stimulating gene 15,ISG15)基因,在大肠杆菌中高效表达并纯化、制备多克隆抗体,为其生物学应用及检测方法的建立奠定基础。【方法】提取瑶山亚种树鼩外周淋巴细胞总RNA,经RT-PCR扩增出ISG15基因,亚克隆到真核表达载体构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-ISG15,并瞬时转染仓鼠肾细胞(baby hamster syrian kidney, BHK-21);同时亚克隆到原核表达载体pET-28a(+)构建重组表达质粒pET-28a-ISG15,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达树鼩ISG15蛋白;重组蛋白经镍离子亲和层析法纯化并免疫小鼠,获得鼠抗树鼩ISG15多克隆抗体,利用Western blotting和间接免疫荧光技术(IFA)检测其反应性。【结果】成功克隆瑶山亚种树鼩ISG15基因,并构建了其真核和原核表达载体,真核表达载体在BHK-21细胞中能高效表达;原核表达载体在大肠杆菌中30℃、0.5 mmol/L IPTG诱导6 h获得重组蛋白(分子质量22 ku),...     

犬瘟热病毒N基因原核表达及多克隆抗体的制备

采用PCR方法扩增犬瘟热病毒N基因,将其克隆至原核表达载体p ET-32a(+)中,构建犬瘟热N基因原核表达重组质粒,然后转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达重组N蛋白。从包涵体中纯化重组蛋白,制备多克隆抗体,采用Western blot检测其特异性。结果显示PCR扩增得到犬瘟热N基因,重组N蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中得到表达,制备的多克隆抗体能与N蛋白特异性反应。     

马尔堡病毒糖蛋白RBD基因的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

原核表达并纯化马尔堡病毒(Marburg virus,MARV)糖蛋白(glycoprotein,GP)受体结合域(receptor binding domain,RBD)蛋白,并以此为抗原免疫家兔制备抗MARV-GP-RBD多克隆抗体。参照GenBank提供的MARV GP全基因序列,找到主要抗原表位区域,设计特异性引物,采用PCR方法扩增RBD基因,扩增产物经双酶切(EcoRⅠ/XhoⅠ)后定向克隆至原核表达载体pET-30a(+),构建重组表达质粒pET-30a(+)-GP-RBD,转化BL21(DE3)感受态表达宿主菌,在不同条件下(时间、IPTG浓度、温度)诱导表达目的蛋白,并用His-Band N+柱进行亲和层析纯化;以纯化的重组pET-30a(+)-GP-RBD蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体。通过SDS-PAGE、Western blot和IFA鉴定重组蛋白的反应原性及免疫原性。结果显示:PCR扩增到长度为453bp的RBD基因片段;构建的重组质粒pET-30a(+)-GP-RBD经双酶切后得到与目的片段长度相同的特异性条带,测序结果显示没有突变;转化产物在培养7h、终浓度为0.4mmol/L IPTG和37℃条件下能够充分诱导目的蛋白表达,得到相对分子质量为25 000的重组蛋白,主要以包涵体形式存在,BCA试剂盒产量测定,每升诱导的重组菌可纯化约20mg纯度较高的目的蛋白;Western blot检测证实重组pET-30a(+)-GP-RBD蛋白能同时被抗His标签的单抗和兔源多抗识别并发生特异性反应,证明重组蛋白有良好的反应原性;IFA鉴定证实所制备的兔源多抗能够特异性识别表达MARV GP蛋白的重组杆状病毒rBacmid-GP-VP40,证明重组蛋白具有良好的免疫原性。结果表明:成功表达、纯化了MARV GP RBD蛋白,并完成了兔源多抗的制备,为MARV亚单位疫苗的制备和抗原、抗体检测方法的建立奠定基础。     

流行性乙型脑炎病毒E蛋白主要抗原表位的原核表达

为了克隆乙型脑炎病毒E蛋白主要抗原片段基因的原核表达系统,试验采用RT-PCR方法扩增乙型脑炎病毒E蛋白上2个重要抗原域73~88 aa和292~402 aa,并将其定向连接至原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-EAB,再将重组质粒转入大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞,用IPTG进行诱导表达,应用SDS-PAGE和Western-blot技术对表达产物进行检测与鉴定。结果表明:经SDS-PAGE分析,表达出的目的蛋白主要以包涵体形式存在;再使用Western-blot技术对纯化复性后的包涵体进行检测,证实其具有免疫活性。     

牛副流感病毒3型HNex蛋白表达及其多克隆抗体的制备

本研究旨在获得牛副流感病毒3型(BPIV3)的HNex蛋白及其多克隆抗体。以提取的BPIV3细胞毒的RNA为模板,利用RT-PCR方法扩增包含血凝素神经氨酸酶(HN)的基因片段,然后以此为模板扩增编码HN蛋白膜外区片段(HNex基因),并进行氨基酸序列测定。将HNex基因插入克隆载体pEASY-Blunt Simple中,经双酶切连接至pET-30a(+)表达载体中,构建重组原核表达载体pET-30a-BPIV3-HNex,转化大肠杆菌RosettaTM(DE3)pLysS感受态细胞,IPTG诱导后,用SDS-PAGE和Western blotting方法鉴定表达产物。经亲和层析方法纯化的HNex蛋白作为免疫原,制备兔抗BPIV3-HNex多克隆抗体。结果显示,本研究成功克隆BPIV3 HNex基因。原核表达蛋白结果表明,53 ku处有特异条带出现,并且可以与鼠抗His发生特异性免疫反应。免疫兔的血清中BPIV3 HNex抗体效价为1∶819200。Western blotting结果表明,制备的兔抗BPIV3 HNex多克隆抗体能与BPIV3蛋白发生特异性反应。总之,本研究利用原核表达系统表达BPIV3 HNex蛋白,并获得兔抗BPIV3 HNex多克隆抗体,为进一步探索BPIV3 HN蛋白的功能及亚单位疫苗研制提供参考。     

日本脑炎病毒囊膜蛋白的基因原核表达及抗原性分析

参照GenBank中的日本脑炎病毒序列设计一对特异性引物,采用RT-PCR法扩增E基因得到cDNA,克隆至pMD-18T载体,经测序证实后亚克隆至原核表达载体pET-28a中,转化入BL21(DE3),IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析。结果表明,成功构建了重组质粒pET-28a/JEV E,目的蛋白主要以包涵体形式表达。Western blot检测表明,表达产物与兔抗JEV多克隆抗体呈阳性反应,在ELISA试验中,用表达出的E蛋白包被,能够很明显地区分出猪日本脑炎阴性、阳性血清。     

猪NLRP6蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备

试验旨在表达、纯化猪NLRP6蛋白,并制备鼠抗NLRP6多克隆抗体。根据猪NLRP6全基因核苷酸序列(GenBank登录号:XM_003124236.4)设计特异性引物,利用PCR方法从pMD-19T-NLRP6重组载体中扩增NLRP6基因片段,将扩增产物与原核表达载体pET-32a(+)连接,获得重组质粒pET-32a-NLRP6,经抗性筛选阳性菌、双酶切鉴定、PCR及测序分析后,将其转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中,并进行IPTG诱导表达及Western blotting鉴定。对获得的重组融合蛋白进行可溶性分析,经变性、镍柱亲和纯化、复性后得到纯化的融合蛋白,将其免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。结果显示,试验成功克隆大小约为576 bp的NLRP6基因序列,经鉴定重组质粒pET-32a-NLRP6构建正确,通过IPTG诱导获得大小约34 ku的NLRP6重组融合蛋白,Western blotting分析表明其与小鼠抗6×His单克隆抗体呈阳性反应。可溶性分析结果显示,NLRP6重组融合蛋白以包涵体形式存在,约占95%。纯化的NLRP6重组融合蛋白免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,经Western blotting分析显示出特异性反应。本试验成功制备了具有免疫原性的NLRP6蛋白及其鼠源多克隆抗体,为NLRP6蛋白生物学功能及相关疾病致病机制研究提供了基础材料。     

非洲猪瘟病毒B438L蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

本研究旨在通过构建非洲猪瘟病毒（ASFV）B438L基因原核表达系统表达p49重组蛋白,并制备抗p49蛋白的多克隆抗体。根据ASFV Georgia 2007/1（GenBank登录号：FR682468.1）公布的基因序列合成B438L基因,并将其插入pET-28a （+）载体,构建pET-28a-B438L重组质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,在16 ℃经1 mmol/L IPTG诱导12 h,通过SDS-PAGE对重组蛋白表达形式进行分析;利用串联质谱技术鉴定重组蛋白是否正确表达;将纯化的p49重组蛋白免疫小鼠制备鼠源抗p49多克隆抗体,利用间接ELISA方法测定该多克隆抗体的效价,并以间接免疫荧光试验及Western blotting检测该多克隆抗体的特异性。结果显示,试验成功构建了pET-28a-B438L重组质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞后经诱导表达获得了p49重组蛋白,重组蛋白主要以包涵体形式表达,大小约为60 ku;串联质谱技术进一步证实该蛋白为p49。间接ELISA检测制备的鼠源抗p49多克隆抗体效价达1：64 000,间接免疫荧光试验及Western blotting结果表明制备的鼠源抗p49多克隆抗体能特异性识别p49蛋白。以上结果表明,该原核表达的ASFV p49重组蛋白具有良好的免疫原性,利用表达的p49重组蛋白制备的多克隆抗体具有较高的抗体效价和特异性,为进一步研究ASFV p49蛋白的结构与功能、研制相关的ASFV诊断试剂及疫苗提供了生物材料。     

牛诱导型热休克蛋白72多克隆抗体的制备

将扩增的诱导型Hsp72的部分基因片段克隆到pMD-18Tvector中测序。将阳性克隆的PCR产物克隆到质粒pET-32a-c(+)中,并将重组表达载体转化E.coliBL21(DE3)。重组表达载体酶切鉴定,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达有活性的可溶性蛋白。采用纯化后的Hsp72免疫家兔,制备抗血清,Western-blot检测重组抗原的反应原性。Western-blot检测证明,所制备的多克隆抗体可以与Hsp72特异性结合。