山羊血管紧张素转换酶2基因的克隆表达与生物信息学分析

[目的]血管紧张素转换酶2(ACE2)是RAS系统的关键调控酶,在动物上的研究较少,本试验研究了山羊ACE2的相关理化性质和功能。[方法]利用同源克隆及RT-PCR技术,根据牛的ACE2基因mRNA序列设计引物,从山羊肾脏组织中扩增出ACE2基因编码区的特异性片段,TA克隆到p MD19-T载体并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,对生长出的单菌落进行验证后测序分析。根据测序分析结果设计引物,经PCR扩增和酶切连接,构建原核表达载体p ET-28a-ACE2,经过验证后转化大肠杆菌BL21(DE3)并用IPTG诱导表达ACE2蛋白。[结果]山羊ACE2基因c DNA编码区共包括2 415个核苷酸,编码804个氨基酸残基。同源性比对发现,山羊ACE2基因核苷酸序列同源性与绵羊ACE2最高,为99%,与斑马鱼最低,仅为60%。遗传进化分析也表明该ACE2基因与绵羊的遗传距离最近,与斑马鱼处在两个不同的分支上。蛋白结构及理化性质分析预测该山羊ACE2蛋白属于稳定型蛋白,蛋白信号肽序列位于第1氨基酸(aa)~18氨基酸(aa)之间,蛋白跨膜螺旋预测为Ⅰ型跨膜蛋白。成功构建山羊ACE2蛋白胞外部分(19~738 aa)表达载体,表达出的蛋白相对分子质量约为90×103,主要以包涵体的形式在BL21(DE3)中表达。[结论]本试验首次成功克隆了山羊ACE2基因编码区(基因序列号:KF921008.1),并对其蛋白结构及理化性质进行了初步预测,同时在大肠杆菌中高效表达了其胞外区蛋白。     

血管紧张素转换酶2(ACE2)基因在家猫不同组织中的表达差异分析

【目的】分析血管紧张素转换酶2 (ACE2)基因在家猫不同组织中的相对表达量及特定组织中的蛋白定位,为后续以ACE2基因为受体的疫病防控提供理论基础。【方法】采用qRT-PCR技术检测ACE2基因在家猫8个组织(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰腺、小肠和肠系膜淋巴结)中的mRNA相对表达水平,并利用免疫组织化学法检测家猫肾脏、胰腺和小肠中ACE2蛋白的组织定位。【结果】ACE2基因在家猫肾脏、胰腺和小肠组织的表达量极显著高于肺脏组织(P<0.01),在心脏、脾脏和肠系膜淋巴结组织的表达量极显著低于肺脏组织(P<0.01);不同性别家猫的ACE2表达量存在一定差异,但不显著;ACE2蛋白在小肠组织中的表达量最高,其次是肾脏,在胰腺的表达量最低。【结论】家猫ACE2基因在各组织中广泛分布且存在一定的表达差异。     

昆嵛山血管紧张素转换酶抑制剂原料植物资源调查

血管紧张素转换酶抑制剂是近年来正迅速发展的一类心血管药物。对昆嵛山血管紧张素转换酶抑制剂原料植物资源进行调查,为该资源的开发利用提供基础资料。     

鸭血管紧张素转换酶2(ACE2)双抗体夹心ELISA检测方法的建立与应用

为建立鸭血管紧张素转换酶2 (angiotensin converting enzyme 2, ACE2)双抗体夹心酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)定量检测方法,首先利用纯化的鸭ACE2重组蛋白,成功制备了兔抗鸭ACE2多克隆抗体,间接ELISA法确定抗体效价为1∶800;然后利用制备的鼠抗鸭ACE2多克隆抗体作为捕获抗体,通过戊二醛二步法对兔抗鸭ACE2多克隆抗体进行HRP标记,并将HRP标记的兔抗鸭ACE2多克隆抗体作为检测抗体,纯化获得的鸭ACE2重组蛋白作为标准品,建立鸭ACE2双抗体夹心ELISA定量检测方法,并对抗体浓度、捕获抗体最适包被条件、孵育条件、封闭条件及显色条件等进行优化;通过Western blot法检测正常白鸭与患传染性浆膜炎的病鸭不同组织间ACE2表达的变化;利用RT-qPCR方法检测正常鸭与患传染性浆膜炎的病鸭不同组织中ACE2基因的相对表达量。结果表明：所建立的双抗体夹心ELISA方法最低检测浓度为5 ng·mL^-1,最佳线性范围为25～1 600 ng·mL     

猫血管紧张素转换酶2的三维结构模拟与真核表达

家猫能自然及人工感染SARS病毒,本研究旨在探讨家猫ACE2潜在的SARS病毒受体功能。以人血管紧张素转换酶2(ACE2)序列为模板,用同源模建法模拟了家猫ACE2的三维空间结构,发现家猫ACE2与人ACE2结构十分相似,其结合严重急性呼吸综合症(SARS)病毒囊膜纤突(S)蛋白的关键氨基酸的同源性很高(15/18)。将家猫血管紧张素转换酶2基因N端1-367 aa对应的基因片段及其跨膜区克隆到真核表达载体pcDNA3.1/myc-his( )B中,构建了表达质粒pcDNA-mA367,转染HeLa细胞,间接免疫荧光检测表明fACE2的N端片段已在细胞膜上成功表达。     

慢性心力衰竭患者血管紧张素转换酶I/D基因多态性及其与盐酸贝那普利疗效的关系

目的研究慢性心力衰竭（CHF）患者血管紧张素转换酶（ACE）基因I／D多态性及其与盐酸贝那普利疗效的关系。方法用多聚酶链式反应（PCR）对120例慢性心力衰竭患者进行ACE基因分型,并用盐酸贝那普利治疗8周,比较不同基因型患者的心功能、左室收缩末容积（ESV）、左室舒张末容积（EDV）及左室射血分数（LWF）的变化。结果CHF患者的Ⅱ、ID、DD型基因型频率分别为31．7％、33．3％、35．0％,I、D等位基因频率分别为55．8％、44．2％,患者的DD基因型频率及D等位基因频率明显高于对照组CP〈0．01）。服用盐酸贝那普利后,DD基因型患者的NYHA分级及EDV改善值大于Ⅱ、II）基因型患者（P〈0．01）。结论CHF患者ACE基因分型与盐酸贝那普利的疗效有关。     

酶解工艺对海带酶解液抑制血管紧张素转化酶活性的影响

为明确海带对血管紧张素转化酶活性的抑制作用,通过单因素试验和响应面优化试验,探讨不同纤维素酶添加量和酶解时间对海带浆抑制血管紧张素转化酶活性的影响。结果表明:采用纤维素酶对海带浆进行酶解,建立了海带酶解液血管紧张素转化酶(ACE)活性抑制率Y与纤维素酶添加量X₁、酶解时间X₂的数学模型:Y=-114.273 04+0.005 72X₁+1.491 99X₂-3.33333×10^-7X₁X₂-2.552 00×10^-7X₁²-0.004 47X₂²,得到优化酶解条件为:海带经切分匀浆后,在pH 6.0、添加纤维素酶11 060 U·g^-1、在室温条件下酶解169 min,所得酶解液对ACE活性的抑制率可达到41.43%左右。试验可知海带酶解液对血管紧张素转化酶(ACE)活性具有较高的抑制作用。     

斑马鱼CDKAL1基因的生物信息学分析

[目的]深入了解斑马鱼CDKAL1基因的结构特点。[方法]运用生物信息学方法对斑马鱼CDKAL1基因的基因序列、编码蛋白的理化性质、结构及功能进行分析。[结果]分析结果显示,此基因一部分存在于细胞质,并存在一个跨膜结构域,没有信号肽。该基因编码蛋白质的变异不大;含有3个功能结构域,均为Erk D-domain,分别位于L189L、384、V315;在Y292位置有一磷酸化位点;有UPF0004超家族、Radical SAM超家族和MiaB结构域3个保守结构域;在脑、肌肉、肾脏中表达。推测该基因表达的蛋白质可能是酶、异构酶或者中间代谢产物,与胰岛素受体的作用有关。[结论]该研究为今后进一步研究人类Ⅱ型糖尿病提供了科学依据。     

血管紧张素Ⅱ对牛肉品质的影响

取屠宰后5头杂交牛(鲁西黄牛×西门塔尔)的背最长肌,置于2~4℃贮藏7 d,注射样品重10%的血管紧张素Ⅱ,观察在成熟过程中血管紧张素Ⅱ对牛肉剪切力、肌原纤维小片化指数(MFI)、凋亡酶活力,以及肌纤维直径变化的影响。结果显示:贮藏期间对照组和处理组样品剪切力均显著下降(P<0.05),MFI值逐渐增大,caspase-3、6、9酶活力宰后迅速激活随后其活力逐渐下降;血管紧张素Ⅱ注射处理显著降低了牛肉的剪切力值和肌纤维直径(P<0.05),而对MFI值及caspase-3、6、9活力无显著影响。因此,caspase-3、6、9对牛肉嫩度的影响可能仅发生在宰后初期极短的一段时间内;肌细胞宰后生理和活体状况下不太一致,血管紧张素Ⅱ注射降低了牛肉剪切力可能由于它能显著防止肌纤维的收缩。     

充血性心力衰竭患者的ACE基因多态性分布及其对预后的影响

目的 观察充血性心力衰竭患者ACE基因多态性的分布及其对预后的影响.方法 选择2014年6月至2015年6月在我院就诊的充血性心力衰竭患者150例,对其采用聚合酶链式反应进行血管紧张素转换酶I/1基因多态性的检验,并分析其预后.结果 经检测,其ACE I/D基因多态性分布频率:33.3％为纯合子DD基因型,18.0％为纯合子Ⅱ基因型,48.7％为杂合子ID基因型,此3型患者在年龄、性别、种族、病因、血压、心率、NYHA心功能、LVEF以及药物治疗方面比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).Ⅱ、ID、DD型的1a生存率为51.9％、43.8％、34.0％(x2=2.490,P＞0.05);2a生存率分别为22.2％、8.2％、2.0％(x 2=9.094,P＜0.05),携带ACE DD等位基因患者的2a生存率明显低于Ⅱ基因型.结论 对于充血性心力衰竭患者而言,其ACEI/D基因多态性中DD型以及D等位基因与预后有密切的关系,可作为心力衰竭患者预测指标.     

斑马鱼促性腺激素释放激素及相关肽基因的克隆与序列分析

从斑马鱼脑组织提取总RNA,应用RT-PCR方法克隆促性腺激素释放激素(GnRH) cDNA,其长度为646 bp,包括一个258 bp开放阅读框;编码的GnRH前体为86个氨基酸残基,由一个信号肽、GnRH十肽和一个由蛋白水解位点(Gly-Lys-Arg)连接的促性腺激素释放激素相关肽(GAP)组成;其中信号肽和相关肽的长度分别为24和49个氨基酸.该cDNA编码的GnRH的前体氨基酸序列与其他物种的GnRH前体基本一致.表明物种间GnRH cDNA的蛋白编码区高度保守,而非编码区的保守性程度很低.进化分析发现,斑马鱼与鲤、鲫、拟鲤、黑头软口鲦等淡水鲤科鱼类的同源性较高.     

猪肺血管紧张素转化酶的提取与纯化

[目的]研究猪肺血管紧张素转化酶（ACE）的提纯方法,为其生产利用提供技术支撑.[方法]以新鲜猪肺组织为试验材料,匀浆离心后经硫酸铵分级沉淀透析,然后采用离子交换-超滤离心联合法对猪肺ACE粗提物进行纯化,测定ACE的分子量、酶活力、纯化倍数及酶活力回收率.[结果]通过离子交换-超滤离心联合法分离纯化猪肺ACE,可得到相对分子量182 kDa、酶比活力1.2476 U/mg的电泳级纯品ACE,其纯化倍数达357.31倍,酶活力回收率达12.28％.ACE催化反应动力学米氏常数（Km）为0.849 mmol/L,最大反应速率（Vmax）为9.775 nmol/min.[结论]采用离子交换-超滤离心联合法纯化猪肺ACE能够极大缩短分离与纯化时间,且获得较高的纯化倍数和酶活力回收率,是猪肺ACE的高效纯化方法.     

斑马鱼Hoxa-11a基因克隆及序列分析

用PCR法从斑马鱼基因组DNA中扩增了Hoxa-11a基因的完整编码序列,并将其克隆到PCR-TOPO载体.该基因包括两个外显子,长度分别为622 bp和233 bp,其间的内含子为726 bp,共编码284个氨基酸.它与人、鼠、鸡、爪蟾和矛尾鱼Hoxa-11基因氨基酸序列的同源性分别为50.0%、51.3%、53.3%、56.7%和59.7%.除同源异型盒外,外显子Ⅰ区和内含子中也存在保守序列.外显子Ⅰ中丙氨酸同聚物与其两侧富含甘氨酸和丝氨酸亚区的积累是不同动物Hoxa-11基因长度变化的主要因素.     

克螨特农药对斑马鱼急性毒性的研究

[目的]寻找克螨特用于水生动物斑马鱼病虫害防控的安全浓度.[方法]通过室内急性毒性测定试验,设置7个克螨特浓度梯度来检测其对斑马鱼的致死情况,从而计算其半致死浓度(LC50)与安全浓度(SC).[结果]克螨特对斑马鱼在用药96h后的LC50为0.909 mg/L,置信区间分别为0.876～0.943 mg/L.克螨特对斑马鱼的SC为0.091 mg/L.[结论]该研究为克螨特杀灭斑马鱼寄生虫的用药量提供了重要的数据支持.     

甲基睾酮对雌性斑马鱼性腺发育的抑制作用

用含雄性激素甲基睾酮(MT)的饲料饲喂经产雌性斑马鱼(Danio rerio)来探讨外源激素对其性腺发育的影响。通过投饲含0、30、60、120、240和400 mg.kg-1 MT的饲料30 d后,石蜡切片观察斑马鱼卵巢的发育情况。结果表明,随着MT剂量的增加,斑马鱼性腺的发育受到抑制,卵巢结构变化明显。30 mg.kg-1剂量组的成熟系数有明显的降低,至400 mg.kg-1剂量组,成熟系数仅为对照组的1/6;同时外源雄性激素严重影响或抑制了卵巢的进一步发育,较低剂量组性腺发育停滞在Ⅲ时相左右,较高剂量组的性腺明显的退化,至400 mg.kg-1剂量组,卵巢已呈明显的萎缩状态,卵母细胞几乎不可见;卵母细胞在甲基睾酮作用下的退化过程为:抑制卵母细胞发育—细胞核结构变化—累及细胞器—形成凋亡小体、破坏细胞膜结构—凋亡小体逸散、细胞固缩—崩解。结果显示外源雄性激素对雌性斑马鱼的性腺发育影响明显,较高剂量时可导致外源激素的阉割作用。     

斑马鱼迟缓爱德华氏菌的鉴定、致病性及药物敏感性

从患病斑马鱼(Danio rerio)肝脏组织分离到菌株Z1,通过对该菌株形态特征、生理生化特性、ATB系统鉴定和16S rRNA、DNA促旋酶B亚单位蛋白(gyrB)基因测序等综合分析,鉴定Z1菌株为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda).Z1菌株对健康斑马鱼和透明四带无须鲃(Puntius tetrazona)人工感染试验发现,感染发病症状与自然发病症状一致,再分离菌株的特性与Z1菌株相同,并再次感染成功,证实迟缓爱德华氏菌为斑马鱼病原菌.药敏试验发现Z1菌株对呋喃妥因等11种药物敏感,对苯唑西林等6种药物耐受.15种中草药对Z1菌株的体外抑菌试验结果发现,五倍子、石榴皮的抑菌作用明显,最小抑菌质量浓度(MIC)和最小杀菌质量浓度(MBC)均≤6.25 mg/mL;艾叶等有一定抑菌作用,MIC和MBC均在25～200 mg/mL;而野菊花等抑菌作用不明显,MBC＞200 mg/mL.     

斑马鱼CYP11a1基因在不同性腺发育时期的表达

采用实时荧光定量PCR技术,分析了斑马鱼Danio rerio的CYP11a1基因在成鱼4个组织和性腺发育3个时期的表达情况。结果表明:CYP11a1基因在卵巢、精巢、肌肉和脑组织中均有表达且存在差异,在脑中表达量最低(P0.05),在卵巢、精巢、肌肉中的表达量分别为脑中表达量的204.7倍、38.9倍、17.0倍;CYP11a1基因在3个卵巢发育时期的表达量表现为先降低后升高的趋势,其在卵巢成熟期的表达量最低(P0.05),在卵巢成熟前期、卵巢成熟后期的表达量分别为卵巢成熟期表达量的1.7倍、1.5倍;CYP11a1基因在3个精巢发育时期的表达量表现为先升高后降低的趋势,在精巢成熟期表达量最高(P0.05),分别为精巢成熟前期、精巢成熟后期表达量的6.5倍、13.4倍。研究表明,尽管CYP11a1基因在卵巢和精巢发育过程中的表达规律不同,但CYP11a1基因在一定程度上与斑马鱼的性腺发育相关,其可能在促进斑马鱼精子成熟中发挥一定作用。     

苄嘧磺隆对斑马鱼的急性毒性和遗传毒性研究

1材料与方法 1．1动物供试斑马鱼体重12～17g、体长4—4．5cm,购于宠物市场。实验室驯养7d,每天更换1次暴晒24h的水,选取行动活泼,身体健康的个体进行试验。