国产IBV疫苗株膜蛋白基因的亲缘关系研究

利用自行设计的引物Wx和Ws，通过RT－PCR方法分别扩增出IBVD41株、H120GD株、H120SH株、H520GD株4个国产疫苗株和标准强素M41－E4株完整的M基因cDNA，然后将其分别克隆到pGMET－Easy或pMD18－T载体中。测序结果发现：这5个IBV毒株的M基因均为678bp，分别编码由225个氨基酸残基组成的多肽。序列分析表明：D41株、H120GD株和H120SH株M基因之间的核苷酸序列及推导氨基酸序列同源性均为100％，它们在系统发生进化树中处同一分支；而H52GD株和国内的M41－E4株和国外的M41株M基因之间的核苷酸及推导氨基酸序列同源性分别为99．9％和99．6％，它们之间的亲缘关系最近，在系统发生进化树上处另一个分支。     

国产IBV疫苗株核衣壳蛋白基因的亲缘关系

利用自行设计的引物Cx和Cs，通过RT－PCR方法分别扩增出鸡传染性支气管炎病毒（IBV）D41株，H120GD株、H120SH株、H52GD株等4个国产疫苗株和标准强毒M41－E4株完整的N基因cDNA,然后将其分别克隆到pGEM T-Easy或pMD 18-T载体中并测序。测序结果表明，这5个IBV毒株可分2组，其中D41株，H120GD株和H120SH株为一组，它们的核苷酸和推导氨基酸序列同源性为99．7％－99．8％和99．0％－99．5％，而H52GD株与M41－E4株构成另一组，其核苷酸和推导氨基酸序列同源性为99．7％和99．5％；而2组之间的最大同源性仅为91．0％和93．2％。在系统发生进化树上，这2组分别位于不同的分支簇上。值得注意的是，国内的H52GD株与国外报道的H52株不在同一分支簇上，相反却与国内强毒M41－E4株以及国外报道的M41株在同一分支簇上。这一结果表明，国内的H52GD疫苗株与国外报道的H52疫苗株不同，它们在亲缘关系上更靠近M41－E4株和M41株。     

鸡传染性支气管炎病毒(IBV)ZZ2004株核衣壳蛋白基因的克隆及原核表达

本研究旨在克隆并表达鸡传染性支气管炎病毒（IBV）的核衣壳蛋白（N）。根据IBV ZZ2004株的N基因设计1对引物,提取IBV ZZ2004株的RNA,利用RT-PCR技术扩增大小约1.23 kb的片段,将其插入克隆载体pGEM-T构建pGEM-T-N。将pGEM-T-N用EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切,将酶切后的N基因片段克隆到表达载体pGEX-6P-1,转入大肠杆菌BL21（DE3）菌中,经IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE电泳,结果显示外源基因获得了表达且为可溶性蛋白;Western blotting检测结果显示N蛋白可与相应的IBV ZZ2004阳性血清发生特异性反应,结果表明N蛋白有一定的生物活性。本研究为IBV诊断试剂盒及新型IBV重组亚单位疫苗研制奠定基础。     

IBV青岛腺胃分离株S1纤突蛋白质基因的克隆与鉴定

参考Genebank发表的传染性支气管炎病毒（IBV）S1纤突蛋白基因序列,自行设计合成了1对引物,对IBV青岛腺胃分离株（SD/97/02）RNA进行RT-PCR扩增。产物经琼脂糖凝胶电泳分析,呈现1条1657bp的条带,将其克隆入pMD18-T载体中,并进行序列测定,证实为S1基因。将此重组质粒命名为pMDQXS1。     

鸡传染性支气管炎病毒T株核衣壳蛋白基因(N)的克隆及序列测定

根据IBV病毒已报道基因序列设计了一对用于扩增鸡传染性支气管炎病毒T株核衣壳蛋白基因（N）的引物，经RT－PCR得到了预期大小的扩增产物；将目的的条带纯伦并回收以后，克隆到pMD18－T质粒载体中，对插入片段进行序列测定，并与已发表的IBVN基因序列进行了比较和分析，表明具有高度相似性。证明我们克隆了IBVT株的N基因。     

IBV结构蛋白的研究进展

鸡传染性支气管炎病毒(Avian infectious, bronchi-tis virus,IBV)是冠状病毒中的一种,其主要的结构蛋白为S蛋白、M蛋白、N蛋白.这3种结构蛋白在病毒的感染和诱变免疫保护上发挥着怎样的作用,一直是国内外学者的研究热点.IBV可引起鸡传染性支气管炎(avian infectious bronchitis,IB),不同日龄的鸡均易感染,但主要危害1～4周龄的幼鸡.现将IBV结构蛋白的研究进展综述如下.     

鸡传染性支气管炎病毒四川分离株N基因DNA免疫质粒的构建

采用SDS-蛋白酶K法抽提鸡传染性支气管炎病毒(IBV)四川分离株SAIBWJ的基因组RNA，参照基因库中的N基因序列设计了1对引物，扩增出了单一的DNA产物。将该产物插入pUC18载体的HindⅢ和BamHⅠ酶切位点。构建了pUC-NWJ质粒。序列测定结果表明，获得的克隆质粒包含了全部N基因。再将N基因亚克隆到pcDNA3．1( )载体的HindⅢ和XhoⅠ酶切位点，构建了IBVSAIBWJ N基因的DNA免疫质粒pcDNA-NWJ。     

利用IBV重组N蛋白建立ELISA抗体检测试剂盒的研究

利用表达鸡传染性支气管炎病毒Gray株N蛋白的基因工程重组菌，表达IBV—N蛋白，并利用表达载体上带有组氨酸标记的特点，应用金属螯合填料将其纯化。用纯化的IBV—N蛋白作为包被抗原，成功地建立了一种检测血清中IBV抗体的间接ELISA方法。确定抗原最佳包被浓度为0．58μg／ml；被检血清的最佳稀释度为1：100；酶标二抗的工作浓度为1：1000。确定了血清样品阴、阳性临界0D值为0．14。与IDEXX公司IBV抗体检测试剂盒比较，结果表明自建ELISA试剂盒具有较高的敏感性和特异性。     

IBV疫苗株基因组3‘末端序列分析

以5株鸡传染性支气管炎病毒（IBV）疫苗株（D41、H120GD、H120SH、H52BJZH和H52GD株）和IBV标准强毒M41-E4株的基因组RNA为模板，利用RT-PCR技术，扩增出1条特异性条带，包括部分核衣壳蛋白（N）基因以及紧接着N基因下游的基因组3‘端非编码区（UTR）。测序结果表明，从D41、H120GD和H120SH株扩增的特异性片段长度为614bp；而从H52BJZH、H52GD和M41-E4株扩增的特异性片段长度为406bp。序列分析发现，被检的6株IBV毒株可分为两组，其中D41、H120GD和H120SH株为一组，核苷酸序列同源性为99.7%-99.8%；而H52BJZH、H52GD和M41-E4株构成另一组，其核苷酸序列同源性为99.3%-100%；两组之间的最大同源性仅为94.6%。在系统性发生进化树上，这两组分别位于不同的分支簇上，国内的H52BJZH、H52GD与国外的H52株不在同一分支簇上，相反却与国内强毒M41-E4株以及国外M41株在同一分支簇上。提示国内H52疫苗株与国外H52疫苗株不同，它们在亲缘关系上更靠近M41-E4株和M41株。     

传染性支气管炎病毒疫苗株H52的全基因组克隆与分析

采用RT-PCR方法克隆测定传染性支气管炎病毒（Infections Bronchitis Virus,IBV）疫苗株H52全基因组序列,并与其它已知全基因组序列的我国分离株进行比较分析,以分析我国IBV地方分离株与疫苗株的分子遗传关系。结果表明,H52基因组全长为27630bp（不包括polyA）,A＋T含量为61．8％,它与我国IBV分离株全基因组同源性在83．9％～95．2％之间,其中与KQ6的同源性最高（95．2％）,与其余株均在88％以下。在基因组内基因的同源性中,以S1、S2与E变异最大,除KQ6外,其余各株（含台湾株）与H52在S1蛋白上的同源性只有72．4％～80．7％,在S2蛋白上的同源性为85．5％～88．1％,E蛋白为82．9％～93．3％。系统进化分析表明,国内分离株,除KQ6外,在进化分支中已独立于H52和其它Massachusetts型衍生毒株。H52与我国地方分离株存在较大的分子遗传差异,这些差异可能导致单纯Massachusetts型疫苗（如H120,H52）不能有效地免疫保护我国的鸡群。     

63株IBV分离株M基因的遗传变异与系统进化分析

对1993－2010年从中国不同地区分离的63株传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)野毒株,采用RT-PCR方法克隆测定所分离野毒株的M基因核苷酸序列,并与GenBank中公布的部分国内外IBV毒株的M基因序列进行比较分析,研究中国IBV的分子流行病学特点和分子遗传变异规律。结果显示,所测毒株M基因具有6种不同长度的开放阅读框,这些长度的差异是由于5'端的核苷酸插入或缺失造成的;N端含有1~2个N-糖基化位点,其中1个糖基化位点"Asn-Cys-Thr"(NCT)是高度保守的。63个IBV分离株间氨基酸序列相似性为88.9%~100%,分离株与参考株间相似性为87.2%~100%。系统进化分析结果显示,本研究的63个IBV分离株可分为9个基因型,2005－2010年IBV中国流行株大部分与Mass型疫苗株处于不同的基因型,而且氨基酸序列相似性都小于94%。     

鸡传染性支气管炎病毒广西流行株3种主要结构蛋白基因的遗传变异分析

为了解鸡传染性支气管炎病毒(IBV)广西流行株的遗传变异情况,应用RT-PCR方法对2004-2007年的7株广西IBV分离株的纤突蛋白S1基因、核(N)蛋白和膜(M)蛋白基因进行扩增、克隆、测序和同源性比较及系统进化分析。结果显示广西IBV分离株S1基因存在广泛的基因点突变,部分毒株出现基因插入和缺失,分离株之间氨基酸同源性为74.2%～98.7%;N基因无插入和缺失,但存在基因点突变,分离株之间氨基酸同源性为91.7%～99.3%;M基因存在点突变和插入现象,分离株之间氨基酸同源性为90.7%～98.2%。以疫苗株H120为参照,广西IBV分离株的S1、N和M基因都出现了变异,其中S1基因变异程度最大。7株广西IBV在S1、N和M基因氨基酸序列系统进化树中分别集中在2、3和3个基因群中,其中4株的S1、N和M基因分型结果不一致。结果表明广西IBV分离株的S1、N和M基因已发生变异,广西IBV存在广泛的基因突变、缺失或插入现象。研究的结果提示流行株的遗传变异可能是目前影响疫苗免疫效果的主要原因。     

腺胃病变型鸡传染性支气管炎病毒变异株的比较研究

腺胃病变型鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）变异株Ｈ９５提纯样品经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ,证明Ｈ９５株单抗ＤＥ７和Ｍ４１株单抗６ＤＨ８均能识别Ｈ９５株５４０００蛋白多肽。采用单抗、多抗介导间接ＥＬＩＳＡ试验表明,Ｈ９５毒株能与抗ＩＢＶＭ４１Ｎ蛋白单抗６ＤＨ８和ＩＢＶＭ蛋白单抗ＭＣ发生反应,也能与抗Ｍ４１、Ｇｒａｙ、Ｈｏｌｔｅ、Ｔ、Ｈ５２、Ｎ１１５和分离株Ｃ９００１、ＤＬＺ９１１１的多抗血清反应,同时抗Ｈ９５株的４株单抗、多抗血清也能与上述毒株反应。卵磷脂酶Ｃ处理的Ｈ９５株的血凝活性能被相应的Ｈ９５株的单克隆抗体和高免血清所抑制,也能被Ｍ４１单抗和高免血清所抑制。通过ＲＴ－ＰＣＲ获得了Ｈ９５毒株的免疫原基因Ｓ１,经Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ和ＩＢＶ的Ｓ探针检测呈阳性。     

AsiaⅠ型口蹄疫病毒灭活疫苗毒株不同宿主系传代中VP1基因的遗传变异研究

口蹄疫病毒结构蛋白VP1参与构成病毒粒子的主要中和抗原位点,是4种结构蛋白中最易发生变异的。在病毒传代过程中,对VP1基因进行遗传变异分析是口蹄疫疫苗研制中不可或缺的环节。为此,作者扩增了经不同宿主系（乳鼠、BHK₂₁细胞）连传不同代次的AsiaⅠ型毒株的VP1基因,并对其进行遗传变异分析,毒株间核苷酸同源性为99.4%~99.8%,推导氨基酸序列同源性为98.6%~100%;制苗毒株经过不同宿主系有限传代后,与传代前的原毒(MF1)相比,VP1基因未发生大的变异,主要抗原位点较稳定,说明以此种方式获得的制苗毒株制备的灭活疫苗是稳定的,适用于该毒株流行区域内相关家畜的免疫预防。     

鸡传染性支气管炎病毒沈阳分离株生物学特性及其免疫原S1基因的克隆与序列分析

本研究对分离自沈阳地区的一株传染性支气管炎病毒（ＳＹ毒株）进行了生物学特性的研究,同时成功地对其免疫原Ｓ１基因进行了ＲＴ－ＰＣＲ扩增、克隆与序列分析。 通过电镜观察、动物回归试验、血凝特性研究等试验验证分离自沈阳地区的ＳＹ毒株确实为一株传染性支气管炎病毒。气管环组织培养交叉中和试验结果表明,分离株ＳＹ株不同于参考毒株澳大利亚Ｔ、Ｈ５２、Ｍ４１,且不同于国内其它流行株ＨＤ、ＨＢ、ＸＢ、ＤＢ等,是一个新的变异株。 利用ＩＢＶ Ｓ１基因特异性寡聚核苷酸引物,经ＲＴ－ＰＣＲ扩增ＳＹ毒株的Ｓ１基因,得到预期的约１．７Ｋｂ片段;并将扩增所得ｃＤＮＡ插入克隆质粒ｐＵＣ１９的ＥｃｏＲⅠ／ＢａｍＨⅠ位点,在大肠杆菌ＤＨ５ａ中实现目的基因的克隆。经限制性核酸内切酶分析及ＰＣＲ鉴定,证实为阳性重组质粒,利用末端双脱氧链终止法对其测序,得到Ｓ１基因全长１６４０ｂｐ,包括整个开放阅读框。通过序列分析软件ＤＮＡＳＩＳ、ＰＲＯＳＩＳ、ＭＥＧＡ等软件对Ｓ１基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行分析,结果表明：分离株ＳＹ与７株参考株和国内流行株ＨＤ株相比,无论是核苷酸序列同源百分率还是氨基酸序列同源百分离都较低,均未达到８０％,这就提示我们ＳＹ毒     

野猪群体结构基因遗传共适应特性的研究

本研究对吉林、黑龙江、辽宁3省的东北野猪群体随机采样42个,利用PCR-SSCP和PCR—RFLP技术检测到Nanog、瘦蛋白、胰岛素样生长因子蛋白3、JAK2、肠毒素大肠杆菌受体、心脏脂肪酸结合蛋白、钙蛋白酶抑制蛋白7个具有多态性的基因位点,并进行了群体遗传共适应性分析,结果表明：①7个多态性基因位点中有5个处于遗传不平衡状态,占所检测多态性基因位点的71．43％;②位于不同染色体上的基因位点之间的18个组合中有6个处于遗传不平衡状态,其主要原因可能是遗传共适应差异造成;③位于同一条染色体上的3个基因位点之间的3个组合都处于遗传平衡状态,但是Leptin—ECF18R组合处于连锁不平衡状态,这可能是因为遗传共适应和基因间的连锁作用的方向是相反的,两者共同作用使得两位点处于遗传平衡状态。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒主要结构蛋白基因半定量 RT-PCR方法的建立及其在RNA干扰研究中的应用

为了建立以GAPDH基因为参照的半定量RT-PCR检测方法,根据PRRSV VR2332株病毒基因组和GAPDH序列设计4对特异性引物,分别扩增GP5、M、N和GAPDH基因序列,将shRNA表达质粒和GP5、M、N真核表达质粒共转染HEK293A细胞,应用该法检测了转染孔中GP5、M、N的相对表达量。同管和分管扩增法均建立了以GAPDH基因为参照的半定量RT-PCR检测方法。靶向GP5、M和N蛋白基因的shRNA表达质粒对其各自蛋白的抑制率为36%~69%,其中pSi-N3和pSi-G1抑制效果最为显著。结果表明,建立的半定量RT-PCR可以用于PRRSV主要结构蛋白基因表达水平的检测分析中。     

犬瘟热病毒分离株N、H、F蛋白基因的变异分析

通过RT-PCR方法扩增到犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)分离株GS0812-4的N、H、F蛋白基因,然后克隆入pGEM-T Easy载体并进行序列分析和抗原表位预测分析。结果表明,GS0812-4分离株的N、H、F蛋白基因与其他分离株相应序列的核苷酸同源性分别为93.2%~97.8%、90.3%~97.3%、93.2%~97.8%,其推定的氨基酸同源性分别为96.6%~98.7%、91.3%~97.9%和96.6%~98.7%;GS0812-4分离株N、H、F蛋白基因与疫苗株相应序列的核苷酸同源性分别为93.1%~93.8%、89.4%~90.5%、93.1%~93.8%,其推定的氨基酸同源性分别为96.4%~97.3%、89.3%~91.3%、96.4%~97.3%。由基因系统发育树可知,GS0812-4与疫苗株处于不同的分支,其中与MKY-KM08的亲缘关系最近,但GS0812-4在N、H、F 3个基因系统发育树上与其他同一毒株的亲缘关系远近不同。H、F蛋白的抗原表位预测结果表明,GS0812-4与MKY-KM08和疫苗株的抗原表位均有差异。说明GS0812-4是野毒株,与MKY-KM08属于同一基因型,来源于同一毒株,但两毒株间的H蛋白和F蛋白的抗原表位仍有差异。