应用鸭胚肝细胞培养鸭肝炎病毒的研究

利用鸭胚肝细胞成功地培养了鸭肝炎病毒，并呈现典型ＣＰＥ，向其细胞维持液中加入１％的鸭胚尿囊液，ＣＰＥ的维持时间可延长至６０小时，将该病毒的细胞培养物回归鸭胚和雏鸭，其致病力不见明显减弱。鸭胚中和试验证明，鸭肝炎病毒在鸭胚肝细胞上形成ＣＰＥ的能力能被特异血清所中和。     

新型鸭肝炎病毒的分离鉴定

为调查发病鸭场的病原,本试验从发病鸭场中分离到1株鸭肝炎病毒,Reed-Muench法测定该病毒对鸭胚ELD₅₀为10^-5.53/0.2 mL,动物回归试验显示攻毒雏鸭复制出原发病鸭场鸭的临床症状和病理变化,鸭病毒性肝炎病毒(DHV)Ⅰ型阳性血清对分离株病毒无中和作用,RT-PCR鉴定分离株病毒为新型鸭肝炎病毒。     

新型鸭肝炎病毒的分离鉴定

对从广东地区流行鸭肝炎病例中分离到的1株病毒(命名为"GD株")进行了鸭胚(DE)传代培养.DE2～DE6代鸭胚毒的ELD50在10-5.17/0.2 mL～10-6.38/0.2 mL之间.DE6代毒回归雏鸭后可以产生与1型鸭肝炎病毒(DHV)相同的临床症状和解剖病变.鸭肝组织毒对4日龄、8日龄和16日龄雏鸭的LD50分别为10-6.5/0.5 mL、10-5.38/0.5 mL和10-4.83/0.5 mL.病毒对氯仿、乙醚和胰酶不敏感,能够耐受pH3.0酸处理,62℃30 min不能被完全灭活.病毒核酸类型鉴定为RNA病毒.生物学和理化学特性鉴定结果表明,GD株为强毒DHV.使用标准1型DHV阳性血清进行的交叉中和试验和交叉被动保护试验表明,GD株病毒在抗原性上与1型DHV无关.对DHv抗原相关的VP1基因序列分析和同源性比较表明,GD株与DHV-1的VP1核苷酸序列同源性为69.82%,氨基酸序列同源性为71.77%.GD株属于一种在我国流行的新型DHV强毒(暂命名为"CN-DHV").     

新型鸭肝炎病毒的分离及初步鉴定

从北京和广西发病鸭群中分离到2株病毒，分别编号为B株和G株，病毒大小约40nm，无囊膜。血清中和试验表明，2株病毒为同一血清型，与1、3型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒无血清学相关性。人工感染试验表明，G株对雏鸭具有很强的致病性，可引起典型的鸭肝炎病变，但死亡率随雏鸭日龄的增长而明显下降；B株病毒不能致死正常雏鸭，但雏鸭经过环磷酰胺处理后，感染B株病毒可引起雏鸭死亡，死亡鸭肝肿胀、出血。     

新型鸭病毒性肝炎病毒巢式RT-PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank上登录的新型鸭病毒性肝炎病毒(N-DHV)基因组序列,设计合成内外2对引物,优化PCR反应条件,建立了检测新型鸭肝炎病毒的巢式RT-PCR方法.结果显示,该方法对Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒(DHV-Ⅰ)、新城疫病毒(ND)、传染性法氏囊病毒(IBDV)、鸭病毒性肠炎病毒(DEV)、鸭细小病毒(DPV)的扩增结果均为阴性;该方法第1次扩增的敏感性是10 pg,第2次扩增的敏感性是0.1 pg,第2次比第1次扩增的敏感性高100倍.结果表明,建立的巢式RT-PCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好等优点,可以准确快速检测出极低含量的N-DHV,解决了新型鸭肝炎病毒不易在组织病料中检出困难的难题,为新型鸭病毒性肝炎的快速诊断、净化及深入研究奠定了基础.     

新型鸭肝炎病毒FS株全基因组序列分析

本试验参考GenBank中已公布的新型鸭肝炎病毒全基因组序列,应用Primer Premier5．O软件,在序列保守区域分别设计了7对引物,通过RT-PCR方法对本实验室已鉴别纯化的新型鸭肝炎病毒Fs株进行了分段扩增,经过测序拼接整理,获得Fs株全基因组序列（GenBank中登录号为EU877916）。序列分析表明,Fs株全长7792个碱基,一个大的开放阅读框编码2251aa。将各基因与国内外已发表的新型鸭肝炎病毒参考毒株进行相似性分析,结果表明,与G株（GenBank登录号为EU755009）核苷酸相似性最高,为99．2％,而FS株与G株和C—GY株（GenBank登录号为EU352805）的氨基酸相似性最高,均为99．6％,与DHV—HS株和DHV-HSS株的相似性最低,均为83．6％。系统发育树分析发现,与G株亲缘关系最近。     

新型鸭肝炎病毒感染雏鸭血液生化指标的动态变化

用新型鸭肝炎病毒人工感染9日龄健康樱桃谷雏鸭。对感染雏鸭的临床症状、病理变化进行观察。并测定了感染雏鸭在接种后12、24、48、96、168h和14d时血糖、谷草转氨酶、谷丙转氨酶等13项血液生化指标。结果表明：血清葡萄糖含量（Glu）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLB）均降低。仅总蛋白在接毒后24h有一过性升高；血清谷草转氨酶（AST／GOT）、谷丙转氨酶（ALT／GPT）的活性升高；胆碱酯酶（CHE）仅在接毒后12h明显升高。碱性磷酸酶（ALP）在接毒后12、24和96h表现出明显变化，其中接毒后12h和96h呈降低状态。接毒后24h升高。血清尿酸（UA）的浓度在接毒后168h降至最低值。以后便恢复正常。血清肌酐（CRE）的含量在接毒后12h降低。随后在24h升高。其他时间无变化。血清钙（Ca）、磷（P）变化无明显规律。血清α-淀粉酶（α-Amylase）活性在整个试验期间无明显变化。说明新型鸭肝炎病毒感染雏鸭血清葡萄糖、总蛋白、白蛋白含量和谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性的变化规律与患1型鸭肝炎雏鸭的变化规律相一致。     

一株广西新型鸭肝炎病毒的分离与初步鉴定

从广西南宁疑似鸭病毒性肝炎（DVH）的发病鸭群中分离到1株鸭肝炎病毒（DHV）,命名为GX—NN201201株,其鸭胚半数致死量（ELD50）为10-4.5／0．2mL。对分离毒株GXNN201201进行了DHVRT—PCR诊断、部分片段基因的克隆、序列测定与动物回归试验,结果表明：分离病毒的核酸能被韩国新型DHV特异性引物扩增,而不能被DHV-1的特异性引物扩增。GXNN201201分离株与韩国新型DHV及其他类韩国新型DHV之间的核苷酸序列同源性高达94．0％～98．9％,而与DHV-1疫苗毒株及台湾新型DHV之间的同源性则较低。遗传进化关系分析结果进一步表明该分离株与韩国新型DHV分布在同一分支上,并且与国内类韩国新型DHVGD株的遗传关系最近,属于基因C型DHV。人工感染的病死鸭可见典型的DVH临床特征,与临床发病表现相似。因此,初步确定GX—NN201201为广西新型DHV。     

新型鸭肝炎病毒实验感染雏鸭的组织病理学

以“新型鸭肝炎病毒”实验感染雏鸭，对感染雏鸭的组织病理变化进行了观察。结果表明，接毒后24－48h为感染鸭死亡高峰，试验发病的死亡率为80％；感染雏鸭肝、脾、胰、肾的组织病理变化分别表现为出血性、坏死性肝炎，坏死性脾炎，胰局灶性坏死及肾小叶的异嗜性粒细胞浸润。肝、肾组织的脂肪染色结果表明，肝脏有脂肪蓄积，而肾脏未见有脂肪蓄积。     

鸭肝炎病毒GD株的分离与RT-PCR鉴定分析

本研究分离了1株鸭肝炎病毒(duck hepatitis virus,DHV),并对其进行了分型研究。取广东某鸭场疑似DHV致死8日龄雏鸭肝脏,肝脏组织处理后经鸭胚接种分离纯化病毒。分离毒株经动物回归试验、ELD₅₀测定、中和试验等确定为血清Ⅰ型DHV,同时通过RT-PCR检测及序列分析,从基因分型角度也验证分离毒株为DHV-Ⅰ,并将该分离毒命名为GD株。     

一株新型鸭肝炎病毒的分离与鉴定

从辽宁省某鸭场疑似鸭病毒性肝炎病料中分离到一株病毒,经PCR检测初步鉴定其为鸭肝炎病毒,命名为YK株,应用易感鸭胚和雏鸭进行传代及病毒含量测定,E_1~E_5代鸭胚适应毒病毒含量在10~(6.5)~10~(6.9)ELD_(50)/0.2 m L之间,E2代鸭肝组织毒病毒含量为10~(6.3)LD_(50)/0.1 m L。动物试验结果表明,YK株鸭胚适应毒E_2代对7日龄雏鸭的致死率高达100%。序列测定分析表明,YK株与DHV-A的VP1基因同源性在71.4%~72.3%之间,与DHV-B的VP1基因同源性在71.9%~72.3%之间,与DHV-C的VP1基因同源性在94.3%~98.8%之间。试验表明,YK株与韩国新型鸭肝炎病毒在同一分支上,属于基因C型DHV。     

一株鸭肝炎病毒的分离与鉴定

从山东某养殖场送检的疑似鸭病毒性肝炎病料中分离到一株病毒（暂命名为SD株）,分别用鸭胚、雏鸭进行传代和病毒含量测定,E1-E8代鸭胚适应毒的ELD50在1015^-5.0-10^-6.0／0．1mL之间,E1、E2代鸭肝组织毒的LD50分别为10^-5.5／0．1mL、10^-6.7／0．1mL。动物回归试验结果表明,SD株鸭胚适应毒E2对4日龄雏鸭的致死率为100％;雏鸭毒力测定试验结果表明SD株雏鸭肝组织毒E,代对12日龄内雏鸭具有较高致死率,12日龄后随着日龄的增大,雏鸭的死亡率逐渐降低;理化特性鉴定结果表明,SD株为无囊膜病毒,对脂溶剂（乙醚和氯仿）、胰酶、酸、热均不敏感,且无血凝性。血清交叉中和试验和交叉保护试验结果表明,在血清型上,SD株与DHV-1无关。通过对SD株与韩国N-DHVVP1基因的序列比对和进化树分析,发现二者同源性在99％以上。结果证实,SD株是新型鸭病毒性肝炎病毒,而不是DHV-1。     

一株鸭病毒性肝炎病毒的分离与鉴定

鸭病毒性肝炎 (Duck viral hepatitis,DHV)是雏鸭的一种高度致死性的病毒性传染病,以发病急、传播快、病程短、死亡率高为主要特征[1].目前,已有多种检测DHV Ⅰ抗原的方法,如免疫电镜、Dot-ELISA和病毒中和试验等,这些方法在DHVⅠ的诊断中各有优势[2].     

Ⅰ型雏鸭肝炎病毒侵染后鸭组织中ALB基因表达的分析

检测Ⅰ型雏鸭肝炎病毒侵染后ALB基因mRNA以及ALB蛋白分别在肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、大脑、小脑、腿肌和胸腺等组织中的相对表达量和含量并分析其意义。分别利用实时荧光定量RT-PCR技术和ELISA法检测ALB基因在易感组、抗病组和对照组各组织中mRNA的表达量以及ALB蛋白含量。总体而言,除腿肌外,ALB基因mRNA在易感组中的表达量极显著低于对照组和抗病组(P<0.01),抗病组显著或极显著低于对照组(P<0.01或P<0.05);各处理组间,肝、小脑和胸腺中ALB蛋白含量与ALB基因mRNA相对表达量规律一致,在其他组织中,各处理组间ALB蛋白含量差异均不显著(P>0.05)。RT-PCR与ELISA的结果比较可见,两者在肝脏、胸腺、小脑等与雏鸭肝炎病直接相关的指示性组织中表现一致。本试验研究结果,进一步揭示了ALB基因为Ⅰ型雏鸭肝炎病的抗性基因,与前期抑制性消减杂交法得到的结果一致,其表达量的变化可以作为区分易感鸭和抗病鸭的标志。     

一起鸭甲肝病毒1型和3型混合感染的研究报道

自山东省某疑似鸭肝炎发病鸭肝脏中分离到两株病毒,命名为TA1和TA2,分离毒分别回归3日龄雏鸭,可复制出鸭肝炎的典型症状和病理变化。利用鸭甲肝病毒1型（DHAV-1）和3型（DHAV-3）特异性引物进行RT-PCR 扩增,结果为阳性,经测序证实为DHAV-1和DHAV-3。分别扩增分离毒的VP1基因,经序列测定及遗传进化关系分析发现,分离毒TA1和DHAV-3毒株之间有较高的核苷酸序列相似性,与DHAV-3遗传距离最近,属于基因C型;分离毒TA2和DHAV-1毒株之间有较高的核苷酸序列相似性,与DHAV-1的遗传距离最近,属基因A型。     

新型鸭病毒性肝炎病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中已发表的1型鸭病毒性肝炎(duck hepatitis virus type 1,DHV-1)和新型鸭病毒性肝炎(new type duck hepatitis virus,N-DHV)全基因序列,在非同源区域设计一对新型鸭病毒性肝炎特异性引物P1/P2,对鸭病毒性肝炎病毒、鸭瘟病毒、鹅细小病毒细胞毒、流感病毒等鸭常见病病原进行RT-PCR扩增.结果表明引物特异性良好,引物P1/P2仅能特异性扩增出N-DHV的638bp基因片段;敏感性试验结果表明:N-DHV RNA最低检出量为21 pg.同时对临床样品的检测中发现DHV-1和N-DHV存在混合感染的情况.该方法的建立为鸭病毒性肝炎病毒尤其是新型鸭病毒性肝炎病毒的鉴定及快速诊断提供了可靠的依据.     

7株鸭肝炎病毒分离株及疫苗株的全基因组序列测定与变异分析

为了分析中国鸭肝炎病毒(DHV)的遗传变异和进化关系,作者测定了中国不同地区分离的7株DHV及1株疫苗株的全基因组序列,并与公布的40株DHV序列进行比较分析.结果发现VP1变异程度较大,高变区主要集中在180-194位和213-219位;不同毒株的潜在N-糖基化位点存在较大差异.多数基因的进化分析均表现出一致的结果,测序的8个毒株均分布在同一个遗传谱系,属基因A型,与基因B型和基因C型遗传距离较远,不在同一分支上.而JYZ02株与R85952株的遗传距离最近,属同一个亚支,提示JYZ02株可能由毒株R85952演化而来.结合氨基酸序列相似性分析和代表毒株的血清交叉中和试验结果,表明近年分离并测序的上述7个毒株未发生抗原变异.从多毒株进化分析结果可以看出,血清1型DHV仍是我国流行的优势血清型.     

新城疫疫苗株与分离毒株的蚀斑克隆与毒力鉴定

2株NDV贵州分离株(GN、ND99)与2株疫苗毒株(Ⅰ系和Ⅱ系)经检测为生物异质性毒株.利用蚀斑克隆技术对以上4株毒株进行蚀斑纯化,结果得到11株克隆毒株.其中,10株克隆毒株在鸡胚成纤维细胞上形成圆形、透明无色蚀斑,1株形成圆形、透明、红色蚀斑.经RT-PCR检测,11株克隆毒株中6株为弱毒,形成蚀斑的大小在0.4～8mm之间;5株为强毒,形成蚀斑的大小在1.0～2.0mm之间.结果表明:所形成蚀斑的大小与病毒毒力具有一定的相关性.