H9亚型禽流感病毒HA基因的重组禽痘病毒构建

本试验构建了H9亚型禽流感病毒HA基因禽痘病毒转移载体,经转染、蓝斑克隆、筛选和纯化,获得了遗传性状稳定的HA基因重组禽痘病毒。提取感染重组病毒的鸡胚成纤维细胞(CEF)的DNA进行PCR扩增,获得1.7kb的携带有外源目的基因片段。收集纯化的重组病毒CEF细胞,用H9亚型禽流感病毒多克隆血清作一抗,碱性磷酸酶标记的鸡IgG为二抗进行Western blot检测,结果表明重组痘病毒能在体外的CEF细胞表达HA糖蛋白。     

HSN1亚型禽流感病毒NA基因在重组禽痘病毒中的表达及其产物的免疫原性

将禽流感病毒A／Goose／Guangdong／1／96（H5N1）株的NA基因及LacZ报告基因克隆到禽痘病毒载体pSY681中，构建重组转移载体pSY（NA＋LacZ），将其转染鸡胚成纤维细胞，经蓝白斑筛选，纯化表达NA基因的重组禽痘病毒rFPV-NA，用其免疫SPF鸡，检测该重组禽痘病毒的免疫原性。结果显示，该重组禽痘病毒能够在体外培养细胞内表达具有生物学活性的NA蛋白，表达产物的分子质量约为55ku；用该重组禽痘病毒免疫SPF鸡后，能够使免疫鸡获得对H5N1和H7N1两种亚型HPAIV攻击的部分保护。表明，重组禽痘病毒rFPV—NA具有良好的免疫原性。     

鹅细小病毒VP3基因重组禽痘病毒转移载体的构建

从含有鹅细小病毒（GPV）H1株主要结构蛋白VP3基因的重组质粒pPROEX HTb-VP3中切取GPV H1株VP3基因片段，将其亚克隆于pSY538的EcoRI位点，并将带有痘苗病毒启动子P11的LacZ报告基因平端克隆于上述重组子的SmaI位点，再用Not I切下同时含有VP3基因和LacZ报告基因的片段，亚克隆于pSY681的NotI位点，构建了含有VP3基因的重组禽痘病毒转移载体。上述结果为GPV基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

禽流感病毒A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)NA基因克隆及序列分析

采用RT-PCR技术扩增了禽流感病毒A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)(GD3/96)NA基因，并对其进行了克隆与测序，该苷酸序列测定结果表明：NA基因全长为1410bp，共编码469个氨基酸。其序列与A/Hongkong/156/97(H5N1)、A/Chicken/HongKong/220/97(H5N1)、A/Goose/guangdong/1/96(H5N1)及A/teal/Hongkong/W312/97(H6N1)分离株核苷酸序列的同源性在88.4%-99.0%之间，其相应氨基酸序列的同源性在89.8-99.2%之间。氨基酸序列与香港流感分离株氨基酸序列相比，在茎部没有出现19个氨基酸残基的缺失，表明香港流感毒株由我国大陆禽流感病毒株直接进化而来可能性不大。     

表达H5亚型禽流感病毒HA蛋白的重组禽痘病毒的构建

为构建表达H5亚型禽流感病毒(AIV)A/Duck/Anhui/1/06(H5N1)(简称AH/06)HA蛋白的重组禽痘病毒,本研究利用感染-转染的方法通过转移载体pSY681-gfp-gpt将AIV株AH/06的HA基因同源重组到禽痘病毒(FPV)中,并利用gfp和gpt双重筛选标记在鸡胚成纤维细胞中经过多轮筛选,得到纯化的重组禽痘病毒(rFPV-gfp-gpt-AHHA)。通过PCR、序列测定和western blot的方法对rFPV-gfp-gpt-AHHA进行鉴定和抗原活性分析。结果表明AH/06的HA基因稳定的重组到rFPV-gfp-gpt-AHHA中,其表达的HA蛋白能够与AH/06的阳性血清反应,显示出了良好的抗原性。同时病毒的生长曲线也显示外源HA基因的插入并没有影响亲本病毒的复制。这些结果为进一步的免疫效力研究奠定了基础。     

禽流感病毒分离株A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)HA基因序列分析

采用RT_PCR技术,以A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)RNA为模板,扩增了1.73kb 的HA 全基因cDNA。将HAcDNA克隆后进行了序列测定,测序结果表明所扩增的1728 个核苷酸片段包含了完整的HA基因的开放阅读框架和上下游引物序列、蛋白质合成的起始密码子和终止密码子。核苷酸序列比较分析结果表明:A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1) 与A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)有11 个核苷酸差异,同源率99.4% ;与A/HongKong/156/97(H5N1) 有25 个核苷酸差异,同源率98.6 % ;与A/Chicken/HongKong/258/97 (H5N1) 有30 个核苷酸差异,同源率98.3% ;它们的氨基酸序列同源率依次分别为99 .2 % 、98.6% 和98.1% 。受体结合位点的氨基酸序列完全一致;HA裂解位点氨基酸序列也完全一致,各有5 个碱性氨基酸插入。这说明上述4 个流感病毒分离株可能来自同一个祖先,具有相同的毒力和相似的生物学特性。     

禽流感病毒血凝素与核蛋白在重组禽痘病毒中的共表达

为克服禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)仅诱导机体产生亚型特异性免疫应答的不足,本研究拟将病毒核蛋白(NP)基因与HA基因在重组禽痘病毒中实现共表达。首先构建转移载体,从测序质粒pUCNP中切下目的基因克隆到载体pSY538早晚期启动子LP2EP2的下游,再将含有禽痘病毒早晚期启动子LP2EP2的NP基因片段亚克隆到已有的AIVHA基因重组禽痘病毒转移载体中,即得到同时含有HA和NP两种基因的重组转移载体pSY(HA NP)。将转移载体脂质体转染已感染禽痘病毒亲本株S-FPV-017的鸡胚成纤维细胞。根据报告基因β-半乳糖苷酶(LacZ)基因的表达,蓝白斑法筛选重组病毒,经数轮蚀斑纯化,PCR鉴定及West-ern-blot分析,结果表明所获得的重组病毒能高效表达AIVHA及NP两种蛋白。此研究为进一步研制更为有效的禽流感基因工程活病毒载体疫苗奠定了基础。     

禽流感病毒分离株A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)全基因克隆及序列分析

本研究用无特定病原体（ＳＰＦ）鸡胚增殖禽流感病毒鹅体分离株Ａ／Ｇｏｏｓｅ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ／１／９６（Ｈ５Ｎ１）（ＧＤ１／９６）,提取病毒基因组总ＲＮＡ,运用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术分别扩增该病毒分离株的８个基因片段的ｃＤＮＡ,分别克隆后进行序列测定。序列分析结果表明,所扩增到的８个片段均包含相应的病毒基因的完整开放阅读框架。ＧＤ１／９６株与１９９７年香港禽流感事件中的４株香港流感病毒分离株（分别来自人、鸡、鸭和鹅）的ＨＡ基因的高度同源性说明它们可能起源于同一种系,但ＮＳ基因的差异说明它们分属于不同的基因群系。ＧＤ１／９６株与香港流感病毒分离株的核苷酸和推导的氨基酸序列的同源性较低（６３．９％￣９８．１％）,而香港流感病毒分离株之间的核苷酸和氨基酸序列的同源性很高（９６．５％￣１００％）,且香     

共表达H5亚型AIV HA 基因与鸡IL-18基因的重组鸡痘病毒的构建

以鸡痘病毒(FPV)疫苗株为载体,将H5亚型AIV血凝素基因(HA)和鸡白细胞介素18(IL-18)基因分别插入到鸡痘病毒表达载体pUTA-16-LacZ复合启动子(ATI-P7.5×20)和单一启动子(P7.5)下游,构建了携带AIV HA基因和鸡IL-18基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL-H5HA-IL18.将H5亚型AIV HA基因插入到鸡痘病毒表达载体pUTA2复合启动子(ATI-P7.5×20)下游构建了携带H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTA2-H5HA.应用脂质体转染法,将重组鸡痘病毒转移载体质粒与282E4株鸡痘病毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),在BrdU药物加压下进行3次蚀斑筛选.以不同代次细胞的mRNA为模板,利用H5亚型AIV HA基因和鸡IL-18基因特异引物进行RT-PCR和蛋白印迹检测,筛选出能共表达H5亚型AIV HA基因与鸡IL-18基因和单独表达H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒rFPV-H5HA-IL18和rFPV-H5HA,这些重组鸡痘病毒的构建为AIV活载体疫苗的研制奠定了基础.     

共表达鸡IL-6和H5亚型禽流感病毒HA基因重组鸡痘病毒免疫抗体消长规律及免疫效力研究

为评价共表达鸡IL-6和H5亚型禽流感病毒HA基因重组鸡痘病毒(rFPV-AIH5AIL6)的免疫抗体消长规律及免疫效力,将重组病毒通过颈部皮下注射和翅部皮下注射2种不同的免疫途径来免疫鸡群,结果发现,2种免疫途径中,重组鸡痘病毒对鸡体质量增加均无影响,而野生型鸡痘病毒均可抑制鸡体质量增加。翅部皮下注射疫苗组能够产生较高的血凝抑制(HI)抗体水平,免疫21d后抗体水平达到高峰,28d后开始下降,49d时仍保持在一定的水平。免疫SPF鸡21d后攻毒,表明该重组病毒能使经滴鼻攻毒的SPF鸡抵抗H5亚型AIV的致死性攻击,保护率为95%,与油苗组相同,与单表达H5亚型禽流感病毒HA基因重组鸡痘病毒组(40%)差异显著;攻毒后3、5、7d采集喉头、泄殖腔棉拭子检测排毒情况,结果发现第3天排毒率最高,其中rFPV-AIH5AIL6免疫组排毒率为最低,显示IL-6在rFPV-AIH5IL6免疫过程中起到了免疫佐剂的作用,这为研制新型的禽流感重组鸡痘病毒疫苗奠定了基础。     

鹅源H5N1亚型禽流感病毒株HA基因的克隆与序列分析

本研究对1株鹅源H5N1亚型禽流感病毒血凝素（HA）基因进行了扩增、克隆及序列测定。结果表明：所扩增的片段长1707bp，包含完整的开放阅读框架，编码568个氨基酸。该毒株裂解位点的氨基酸序列为RRRKKR，具有高致病性的分子特征；该毒株有6个潜在糖基化位点；受体结合位点的氨基酸分别为YWIHELY，其左侧壁氨基酸为SGVSSA，右侧壁为NGQSGR。该毒株与国内外一些参考毒株的HA基因序列比较，核苷酸同源率为76.8％～98．1％，氨基酸同源率为85．7％～97．4％，属于欧亚种系。     

表达H5亚型禽流感病毒HA基因的重组鸡痘病毒在水禽的免疫效力

利用表达 H5亚型禽流感病毒血凝素基因的重组鸡痘病毒 ( r FPV- HA)和油乳剂全病毒灭活疫苗分别接种商品鹅 ,评价疫苗在水禽的免疫保护作用。结果发现 ,免疫后 2 1 d,r FPV- HA免疫组 HI抗体检测为阴性 ,灭活疫苗免疫组HI抗体阳性率为 70 % ;用 H5亚型禽流感病毒攻击后 ,与阴性对照组相比 ,r FPV - HA免疫组鹅的口腔和泄殖腔排毒率降低 ,病理变化减轻 ,感染鹅易康复 ,保护率为 80 % ,总体保护效力达到灭活疫苗水平。结果表明 r FPV - HA免疫家鹅可诱导良好保护 ,显示出了良好的应用前景     

高效表达H9亚型禽流感病毒HA基因的重组鸡痘病毒的构建及免疫效力试验

将禽流感病毒血凝素 H9A基因克隆入插入载体 p FG11S中 ,通过酶切鉴定获得了正向转移载体 p FG11SHA;将其与禽痘病毒疫苗株 (w FPV)共转染鸡成纤维细胞 (CEF) ,通过蓝白斑筛选纯化得到重组病毒 r FPV- Ps- HA;以间接免疫荧光法证实 HA基因得到了表达。将该病毒经颈部皮下免疫 1日龄 SPF鸡 ,免疫后 15 d以 H9亚型禽流感病毒 F株翅静脉攻毒 ,攻毒后第 5天采集泄殖腔棉拭子样品进行病毒分离。将此重组病毒与以痘苗病毒 P7.5启动子表达相同基因的重组病毒 r FPV- P7.5 - HA作比较 ,结果表明 ,r FPV- Ps- HA相对于 r FPV- P7.5 - HA明显抑制了病毒的排出 ;攻毒后第 2、5、7、9、11天分别对 r FPV- Ps- HA、油乳剂灭活苗免疫鸡进行泄殖腔、气管排毒规律的检测 ,发现疫苗组均能很好地抑制排毒 ,攻毒对照组泄殖腔的排毒率明显高于气管排毒率     

免疫剂量和母源抗体对禽流感重组鸡痘病毒活载体疫苗免疫效力的影响

利用表达 H 5亚型禽流感病毒 (AIV)血凝素基因的重组鸡痘病毒 (r FPV- HA)以不同剂量免疫 1日龄 SPF鸡、有或无母源抗体 (FPV、AIV H5)的商品鸡 ,并于免疫后 2 1d利用同亚型 AIV通过肌肉注射进行致死性攻击 ,通过检测免疫后 HI抗体应答、比较攻毒后发病率和死亡率评价免疫剂量和母源抗体对 r FPV- HA免疫效力的影响。结果发现 ,免疫后 2 1d,15 %～ 2 0 %的 SPF鸡和无母源抗体商品鸡可检出 HI抗体 ,而含母源抗体商品鸡检测不到 HI抗体。利用H5亚型 AIV致死性攻击后 ,10 3～ 10 6 PFU的 r FPV- HA可保护 95 %～ 10 0 %的 SPF鸡和无母源抗体商品鸡抵御强毒攻击 ,使之免于发病和死亡 ;而不同剂量 r FPV- HA接种的含母源抗体商品鸡有 80 %～ 90 %发病和死亡。结果表明 ,在较宽的免疫剂量范围内 ,r FPV- HA对 SPF鸡和无母源抗体商品鸡可提供良好的保护 ,显示出一定的应用前景 ;母源抗体影响 r FPV- HA诱导的免疫应答 ,且提高免疫剂量亦不能克服其干扰作用 ,这提示在实际应用中需优化免疫程序 ,避免母源抗体干扰。     

表达H9亚型禽流感病毒HA基因重组鸡痘病毒疫苗的遗传稳定性

将表达H9亚型禽流感病毒HA基因重组鸡痘病毒疫苗连续传代至30代，取第10、20、30代重组病毒作为受检代次，进行外源基因片段的克隆与测序，以间接免疫荧光试验检验各代次的表达，并以第10、20、30代重组鸡痘病毒疫苗进行免疫保护效力试验。对各代次模板进行PCR反应，分别扩增出特异的1．7kb外源基因片段，酶切位点与原始代次相同；各代次外源基因序列与原始序列相比，仅有1个碱基发生变化，不涉及氨基酸的变化；免疫荧光试验显示各代次均有显著表达；各免疫组在免疫后第7、10、14、20天的HI抗体效价(log2)逐渐上升；攻毒后第5天各免疫组排毒率与对照组相比差异显著，各免疫组之间无显著差异。结果表明：此重组载体疫苗具有较好的遗传稳定性，经过30代的传代后外源插入基因及其表达未见变化，免疫保护效力亦与原代一致。