猪瘟疫苗微载体悬浮培养生产工艺试验

为优化猪瘟病毒(CSFV)的BT细胞悬浮培养工艺以提高CSFV抗原含量,采用2 L生物反应器对BT细胞的最佳接种密度、CSFV的最佳接种剂量进行了摸索和优化,采用优化的工艺参数,进行了BT细胞5倍消化放大工艺验证,同时对比了BT细胞悬浮培养工艺与转瓶培养工艺增殖CSFV的差异。结果表明,在3 g/L微载体浓度下,采用1.5×10~5个/mg的细胞初始接种密度,培养72 h可获得最佳细胞密度;采用MOI(感染复数)为0.5的接种剂量可收获≥106.8FAID_(50)/mL的CSFV抗原;BT细胞从2 L到10 L生物反应器的5倍消化放大工艺验证试验,3批细胞培养96 h均能达到4.0×10~6个/mL以上;悬浮培养工艺增殖的CSFV抗原含量约是转瓶培养工艺的15倍。以上试验为猪瘟疫苗的生物反应器规模化生产奠定了基础。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(TJM-F92株)微载体悬浮培养疫苗比较研究

为了改进高致病性猪繁殖与呼吸综合征(HP-PRRS)疫苗培养工艺,对HP-PRRSV微载体悬浮培养(TJM-F92株)活疫苗的抗原生产工艺、疫苗的安全性及免疫效力等方面进行研究,并与转瓶培养工艺进行比较。结果表明:微载体悬浮培养工艺生产HP-PRRSV(TJM-F92株)优于转瓶培养工艺,其病毒含量比转瓶培养工艺高约10倍,且批间差异小;HP-PRRSV微载体悬浮工艺活疫苗(TJM-F92株)安全性与转瓶培养工艺活疫苗相比无显著差异,均安全;4批活疫苗细菌、支原体、外源病毒检测合格,病毒含量、真空度和剩余水分均符合标准,但免疫效力明显优于转瓶培养工艺活疫苗。说明从疫苗工业化生产及产品质量控制方面来衡量,微载体悬浮培养工艺比转瓶培养工艺更具有优势。     

细胞悬浮培养技术实现规模化生产禽流感疫苗

<正>历经7年科技攻关,青岛市科技企业青岛信得科技股份有限公司(以下简称"山东信得")利用国际最先进的细胞悬浮培养技术,率先在国内实现了应用生物反应器进行细胞大规模悬浮培养生产禽流感疫苗的重大工艺创新和突破,获得了重组禽流感病毒(H5N1亚型)灭活疫苗的生产文号,这标志着该产品进入规模生产和市场供应阶段,使青岛产禽流感病毒灭活疫苗迈入国际先进行列。"细胞悬浮培养技术是在传统的转瓶培养基础上发展而来的大量培养动物细胞的新兴技术,目前,该技     

犬细小病毒YA-16-C66株纸片载体培养工艺优化及其与转瓶培养工艺的比较分析

采用微型生物反应器确定纸片载体上F81细胞最佳的接种密度和最佳接毒剂量,在NBS反应器中验证温度对犬细小病毒YA-16-C66株增殖的影响。经过三次重复试验,确定利用NBS生物反应器培养犬细小病毒YA-16-C66株最佳工艺为：采用同步接毒法,培养基为含1%新生牛血清的199溶液,细胞接种密度为1.5×10_⁷cells/g,接毒剂量为0.05 MOI,在pH7.2条件下,37.0℃培养48h后降温到35.0℃继续培养24-48小时,细胞病变达到80%~90%时收获上清液。三批次反应器与转瓶工艺产品比较,结果表明：反应器比转瓶收获液病毒含量高1.1~1.9 lg TCID₅₀/100μL;相同培养面积,反应器所得病毒总量是转瓶所得病毒总量的2.8-18.5倍。     

BHK-21细胞悬浮驯化及对新城疫病毒悬浮培养工艺研究

为建立新城疫病毒在BHK-21细胞的无血清全悬浮培养工艺以获得高滴度和高纯度的新城疫悬浮培养抗原,通过悬浮培养驯化和筛选获得了形态良好、稳定传代的BHK-21-sc悬浮细胞株;该细胞以初始密度0.5×10~6 cells/mL接种,培养72 h可增殖到6×10~6cells/mL,细胞活率达95%。以5 L生物反应器悬浮培养BHK-21-sc细胞,对鸡新城疫病毒La Sota株的接毒剂量、TPCK胰酶添加浓度、病毒培养温度、收获时间等工艺参数进行了摸索和优化;并在5L-16L-50L生物反应器中进行逐级放大,以优化后的鸡新城疫悬浮培养工艺进行3个批次病毒悬浮培养。最终确定鸡新城疫病毒La Sota株接种BHK-21-sc悬浮细胞株的悬浮培养工艺:BHK-21-sc细胞悬浮培养的第3天按照感染复数(multiplicity of infection,MOI)为0.005接种病毒,并添加终浓度为5μg/mL的TPCK胰酶,于33℃培养72 h后收获病毒液。应用该悬浮培养工艺在5、16、50 L反应器上悬浮培养BHK-21-sc悬浮细胞株生产鸡新城疫病毒HA滴度不低于9log2,病毒含量不低于10~(6.0)TCID_(50)/0.1mL。表明BHK-21-sc细胞无血清全悬浮生产鸡新城疫病毒工艺稳定,可以实现逐级放大和规模化生产。     

应用Cephodex微载体规模化生产伪狂犬病疫苗的研究

为实现伪狂犬病病毒(PRV)的大规模生产,本研究应用Cephodex微载体悬浮培养BHK-21细胞,通过对培养工艺的研究,初步实现了病毒抗原的高效生产。整个过程采用流加方式和动物细胞微载体培养技术,在细胞反应器中进行BHK-21高密度培养和PRV的高滴度增殖。结果表明,微载体工艺比转瓶培养法获得的病毒液滴度高约100.525TCID50/0.1 m L。因此,应用Cephodex微载体悬浮培养BHK-21细胞在伪狂犬病疫苗规模化生产中具有重要的应用价值。     

悬浮培养技术在生物制药中的应用和展望

综述了国内外细胞悬浮培养产业化发展现状及其关键技术。细胞悬浮培养是利用生物反应器大规模培养动物细胞生产生物制品的核心技术,结合筛选驯化的高表达细胞株和个性化细胞培养基,控制细胞培养过程,实现提高生产效率及产品质量、降低生产成本的目的,是当前国际上生物制品生产的主流模式。但该技术目前在国内尚未得到广泛应用,生物制品生产仍主要采用病毒产率低、生产成本高、劳动强度大的转瓶细胞培养方式。随着现代生物技术发展,利用细胞悬浮培养技术进行生物制品生产是生物制药行业发展的必然趋势。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(JXA1-R株)微载体悬浮培养工艺研究

为了建立高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)的Marc-145微载体细胞悬浮培养工艺以提高HPPRRSV抗原效价,以BC-7L生物反应器微载体悬浮培养Marc-145细胞,对HP-PRRSV接毒时间、接毒剂量、维持液血清浓度、溶氧量参数、病毒增殖温度等工艺参数进行了摸索和优化。通过细胞悬浮培养逐级放大工艺,在BC-100L生物反应器中培养Marc-145细胞,以优化后HP-PRRSV悬浮培养工艺进行3个批次的病毒悬浮培养。结果在Marc-145细胞微载体悬浮培养的第4天按照感染复数(multiplicity of infection,MOI)为0.1的剂量接毒,接毒后以2%新生牛血清的维持液进行维持培养,溶氧参数设置为40%,最佳培养温度为37℃,最佳收获病毒时间为70~74 h。BC-100L生物反应器中培养的3批病毒增殖曲线与BC-7L培养的病毒增殖曲线相近,在接毒后72 h左右达到病毒效价高峰,病毒含量均不低于108.0TCID50/m L。表明HP-PRRSV悬浮培养工艺稳定,可以实现逐级放大、规模化生产。     

微载体悬浮培养ST细胞增殖猪瘟兔化弱毒的工艺研究

从细胞接种密度、病毒接毒量、培养基三个方面进行研究和优化,并进行放大培养,建立了猪瘟病毒的微载体悬浮培养工艺:细胞接种密度为每个微载体15个细胞,病毒接毒量0.05 MOI,采用DMEM/F12培养基进行培养和细胞消化瓶批式消化分散细胞,培养的细胞可以完成生物反应器10 L到50 L的放大,培养的病毒含量达到7.6 l...     

BHK-21细胞规模化培养鸡新城疫病毒工艺的研究和初步应用

为了实现鸡新城疫病毒HN2018株(基因Ⅶ型)在乳仓鼠肾(BHK-21)细胞上的无血清规模化培养，本试验采用悬浮培养技术驯化和筛选了1株能够稳定传代的BHK-21-xh悬浮细胞株；使用该细胞以初始密度为100×10⁴个/mL接种摇瓶进行培养，并对摇瓶培养鸡新城疫病毒HN2018株的接毒细胞密度、培养温度、接毒量、收毒时间等工艺参数进行摸索和优化；利用摇瓶优化的病毒培养工艺，在10和100 L生物反应器中逐级放大培养BHK-21-xh悬浮细胞，接种鸡新城疫病毒；采用生物反应器悬浮培养的鸡新城疫病毒HN2018株细胞毒与鸡胚毒分别制备成灭活疫苗，免疫SPF鸡进行免疫效力的比较。结果显示，在摇瓶中培养72 h细胞密度均不低于800×10⁴个/mL,细胞活率均不低于96%;按照BHK-21-xh细胞密度不低于800×10⁴个/mL,病毒感染复数(MOI)为0.216进行接毒，同时添加终浓度为20μg/mL的胰蛋白酶，于35℃温度条件下培养64～72 h收获病毒液，鸡新城疫悬浮培养细胞毒红细胞凝集(HA)效价最高能够达到10log...     

应用大转瓶结合微载体培养大量生产疫苗的研究

在普通转瓶细胞培养系统中加入微载体进行细胞培养试验。在几种微载体和营养液培养比较试验的基础上,对转瓶单层培养、转瓶载体培养及转瓶单层培养加载体培养三种方法进行了比较。进而应用10000ml大转瓶,用牛胎皮肤继代细胞、IBRS-2细胞,以效果较好的转瓶单层培养加载体培养的方法,进行了病毒疫苗生产试验。经3个毒株、8个大转瓶培养试验,证明培养量可增加1倍,而且TCID_(50)/ml均在8.0以上,方法简便易行,无需特殊的设备与条件。     

细胞转瓶培养研究进展

转瓶培养细胞作为大规模培养技术成熟前的一种细胞过渡阶段,是各种培养条件（血清浓度、细胞密度、接毒时间）从实验室放大到车间生产进行优化的一个重要步骤。对转瓶技术在细胞大规模培养生产中的地位变化及现状进行了综述,为进一步优化和改进转瓶培养技术提供参考。     

MDCK细胞悬浮驯化及对H9亚型禽流感病毒敏感性的研究

为获得对H9亚型禽流感病毒敏感的纯悬浮MDCK细胞株,通过逐渐降低血清的方法对贴壁依赖的MDCK细胞进行了无血清纯悬浮驯化,最终获得了一株对H9亚型禽流感病毒敏感的纯悬浮细胞株MDCK-sus。通过测定表明,该细胞株能够迅速增殖,倍增时间为24h,使用H9亚型禽流感病毒BX13株感染该细胞,培养72h,培养液的病毒HA价可达到1∶512,每0.1mL病毒含量达到108.5EID50,为利用生物反应器大规模悬浮培养制备H9亚型禽流感病毒抗原奠定了基础。     

哺乳动物细胞无血清全悬浮培养技术研究进展

随着生物制品行业的快速发展,哺乳动物细胞无血清全悬浮培养技术已经运用到越来越多的领域中。该技术能够扩大哺乳动物细胞培养的规模,提高生物制品的产量及质量,拓宽哺乳动物细胞的应用领域,并促进哺乳动物细胞生产实现工业化与产业化。但悬浮驯化后的细胞,与父母代细胞相比,蛋白表达水平与生长调节通路均发生了不同程度的改变,使其生产性能受到影响。对此,国内外学者开展了大量的研究并取得了较好进展。作者阐述了哺乳动物细胞无血清全悬浮培养技术的研究现状以及临床生产工艺的优化策略,以期为哺乳动物细胞无血清全悬浮培养技术的发展提供参考。     

生物反应器培养BHK-21悬浮细胞增殖伪狂犬病病毒工艺优化

旨在筛选伪狂犬病病毒（PRV）敏感的BHK-21细胞并分析其生长和病毒增殖特性,优化反应器中BHK-21悬浮细胞的培养和病毒增殖条件,建立生物反应器培养BHK-21悬浮细胞增殖PRV工艺。本研究利用响应面和单因素优化法,以细胞生长动力学特性、TCID₅₀病毒滴度等参数为指标,优化1.2 L生物反应器中BHK-21悬浮细胞的最佳培养和增殖病毒条件,在5 L生物反应器中进一步批培养验证。结果显示,筛选获得PRV高敏感的BHK-21-02贴壁细胞和BHK-21-XF02悬浮细胞各1株,BHK-21-XF02悬浮细胞在含3%血清的SLM-BHK低血清培养基和SFM-BHK无血清培养基中均能实现良好的生长和病毒增殖。利用响应面法优化得到1.2 L反应器最佳培养条件为接种密度1.20×10⁶cells·mL^-1、搅拌转速120 r·min^-1、DO值40%,5 L反应器批培养72 h细胞密度可达（7.61±0.18）×10⁶ cells·mL^-1、细胞活率为（96.93±1.18）%。利用单因素法优化得到1.2 L反应器最佳病毒增殖条件为MOI 0.001、培养温度37℃、细胞密度2.0×10⁶cells·mL^-1、搅拌转速80 r·min^-1,5 L反应器批培养接毒后48 h病毒滴度达到最大值（7.13±0.11） lgTCID₅₀·mL^-1。本研究可为PRV疫苗相关研究和规模化生产提供参考。     

动物细胞悬浮培养技术研究进展

细胞悬浮培养是利用生物反应器大规模培养动物细胞生产生物制品的核心技术,是当前国际上生物制品生产的主流模式。作者就微载体的发展、各种生物反应器的基本原理及应用状况、悬浮培养技术存在问题、中国悬浮培养技术产业化存在的挑战和展望等作一综述。     

BHK-21细胞无血清悬浮培养生产新城疫病毒

为建立基于无血清悬浮培养细胞生产新城疫病毒(NDV)的工艺,本研究首先筛选了适于NDV增殖的乳仓鼠肾细胞(BHK-21)单克隆细胞株,并将鸡胚适应的NDV在筛选获得的细胞株(BHK-v002)中传代,获得细胞适应的NDV。进一步采用单因素实验法检测病毒感染复数(MOI)、TPCK-胰酶浓度、细胞培养液的稀释比例等工艺参数对病毒效价的影响。结果显示,NDV在无血清培养的BHK-v002细胞中增殖的最适条件为:当细胞生长至约9.0×10^6个/mL时,以培养液.新鲜培养基为2:1的比例补加新鲜培养基,使细胞密度达6.0×10^6个/m L,按MOI为0.005接种NDV LaSota株,TPCK-胰酶终浓度为5μg/mL。接种病毒后96 h收获病毒液的HA效价为8.5 log2HAU/25μL,单细胞产毒量(Svy)达到1 685.9病毒颗粒/细胞,半数组织细胞感染剂量(TCID50)为7.9 log10TCID50/100μL。本研究确定了NDV LaSota株在BHK-21细胞悬浮培养中的增殖条件,建立了基于BHK-21细胞无血清悬浮培养体系中NDV的生产工艺,该工艺操作简便,易于放大,为当前ND疫苗的鸡胚生产工艺提供了候选替代方案。     

一株MDBK细胞的低血清悬浮驯化研究

研究选取一株背景清晰、纯净的MDBK贴壁细胞,通过直接驯化和逐级降低血清相结合的办法,获得了一株可以在低血清培养基中全悬浮培养的MDBK细胞。该细胞在含0.5%胎牛血清的培养基中悬浮培养48 h后的细胞密度稳定在5.0×10⁶/mL以上,培养72 h后细胞密度最高可达1.16×10⁷/mL,且细胞形态良好,活力在93%以上,具有良好的传代稳定性。应用筛选获得的悬浮培养MDBK细胞株分别接种伪狂犬病毒和传染性牛鼻气管炎病毒后,检测病毒敏感性。细胞在24 h均发生了皱缩,72 h大部分死亡。悬浮培养的MDBK细胞对传染性牛鼻气管炎病毒的滴度在24 h达到最大值107.6TCID50/mL,对伪狂犬病毒的滴度在48 h达到最大值107.6 TCID50/mL,说明虽然细胞的培养方式发生了改变,但并没有影响上述两种病毒在该细胞上的增殖特性。对MDBK细胞的全悬浮驯化研究可为相关病毒类疫苗规模化生产及工艺的升级改进提供细胞学基础资料。