布鲁菌S2疫苗株免疫牛与牛种、羊种布鲁菌自然感染牛ELISA鉴别诊断方法的建立

为建立区分猪种布鲁菌S2疫苗株接种奶牛与布鲁菌自然感染奶牛,BLAST比对分析羊种、牛种、猪种、犬种、沙林鼠种和绵羊种6种布鲁菌基因序列,发现repA-related基因是猪种布鲁菌与牛种及羊种布鲁菌的差异基因。设计引物PCR扩增获得repA-related基因片段,克隆并原核表达得到了布鲁菌repA-related融合蛋白,以repA-related蛋白建立间接ELISA检测方法。用repA-related蛋白间接ELISA检测猪种S2疫苗株接种动物血清为阳性,检测牛种和羊种布鲁菌自然感染动物血清为阴性。repA-related蛋白间接ELISA能从试管凝聚实验(SAT)及常规ELISA检测阳性的奶牛血清样本中,区分出S2疫苗接种牛与牛种布鲁菌感染牛。     

布氏杆菌S2疫苗株GL_0002181基因的原核表达

为了鉴别羊种布氏杆菌自然感染和S2疫苗(猪种)免疫羊,选用布氏杆菌S2疫苗株进行了全基因组测序,预测出的编码基因与已公布的布氏杆菌基因组数据库比对分析,找出S2特有基因GL_0002181,对GL_0002181基因进行原核表达及免疫原性验证,同时用BP26蛋白作为对照组。Western blot结果显示:以S2疫苗免疫绵羊血清作为检测抗体,重组菌BL21(pETGL_0002181)、BL21(pETBP26)与BL21(DE3)空菌比较,分别在31 ku、32 ku处出现了特异性条带,说明重组蛋白能够与S2免疫血清中的抗体发生特异性反应,具有较好的免疫原性;而重组表达菌BL21(pETGL_0002181)菌体蛋白与自然感染血清不反应,重组蛋白BP26与自然感染血清反应,说明GL_0002181基因在S2疫苗株中存在,在羊种自然流行株中不存在。结果表明:GL_0002181抗原可用于布氏杆菌S2疫苗免疫与羊种布氏杆菌自然感染鉴别诊断,为布氏杆菌病有效诊断提供理论依据。     

布鲁氏菌S2号苗对孕猪保获力试验研究

猪布鲁氏菌病严重地影响着养猪业的发展及人体健康。国外尚无预防猪布病的菌苗。在国内虽S2号布氏菌苗对牛羊免疫已获肯定，但对猪布病的预防效果未能得到证实。故与北京流行病研究所等单位承接世界卫生组织（WHO）课题任务：配种及子宫途径攻击强毒研究S2布鲁氏菌苗对孕猪的保护力。经人工授精与攻毒，进行细菌分离、鉴定、毒力测定、病理组织学检查、血清学反应与临床观察。免疫组流产率仅5％，对照组则为63％，免疫组猛猪成活率为对照组的2．3倍。     

聚合酶链反应检测鉴别鸡毒霉形体强毒株和弱毒疫苗株的研究

根据鸡毒霉形体(MG)强毒株和弱毒疫苗株基因组结构特点，分别设计合成2对引物XZ1、XZ2和XZ45、XZ16，建立了可检测MG强、弱毒株的PCR方法。以引物XZ1、XZ2对MG强毒株和弱毒株进行的PCR，均可扩增出732bp的特异性片段；而以另1对引物XZ45、XZ46对MG弱毒株进行PCR，可扩增出524bp的特异性片段，但对鸡毒霉形体标准强毒株和野毒株的PCR，则扩增不出任何条带。特异性试验表明，这2对引物对其他种类鸡毒霉形体及其他对照禽病病原核酸模板的扩增均为阴性。敏感性试验结果显示，2对引物PCR均能检出100fg的MGDNA。研究结果表明，通过上述2对引物的2次PCR扩增，在数小时内即可鉴别出MG毒株是强毒株还是弱毒疫苗株。     

布鲁菌S2疫苗株免疫牛与牛种、羊种布鲁菌自然感染牛ELISA鉴别诊断方法的建立

为建立区分猪种布鲁菌S2疫苗株接种奶牛与布鲁菌自然感染奶牛,BLAST比对分析羊种、牛种、猪种、犬种、沙林鼠种和绵羊种6种布鲁菌基因序列,发现repA—related基因是猪种布鲁菌与牛种及羊种布鲁菌的差异基因。设计引物PCR扩增获得repA-related基因片段,克隆并原核表达得到了布鲁菌repA—related融合蛋白,以repArelated蛋白建立间接EI．IsA检测方法。用repA—related蛋白间接ELISA检测猪种s2疫苗株接种动物血清为阳性,检测牛种和羊种布鲁菌自然感染动物血清为阴性。repA—related蛋白间接EusA能从试管凝聚实验（SAT）及常规ELIsA检测阳性的奶牛血清样本中,区分出s2疫苗接种牛与牛种布鲁菌感染牛。     

牛种布氏菌自然感染与19号苗免疫之间的血清学鉴别诊断

在间接酶联免疫吸附试验（ｉＥＬＩＳＡ）中，用牛种氏菌自然感染血清与布氏菌１９号苗免疫血清同时滴定强毒牛种布氏菌酶解抗原（ＰＫ抗原），选取最佳鉴别诊断抗原浓度建立了牛种布氏菌自然感染与１９号苗免疫血清学鉴别诊断方法，用该方法与常规抗原浓度ｉＥＬＩＳＡ补体结合试验（ＣＦＴ），试管凝集反应（ＳＡＴ）对６０份采自６头１９号苗免疫不同时期血清，１７５头份分离出牛种布氏菌牛血清进行了比较试验，证实本研究建立的     

基于US区缺失位点猪伪狂犬病病毒疫苗株与野毒株鉴别诊断方法的建立

依据GenBank中公布的猪伪狂犬病病毒全基因组序列,针对gI、gE、28K、TK四个基因序列,设计、合成了5条引物,并对野毒株SA株、gI-/gE-/PRVSA双基因缺失株和Bartha K61疫苗株进行了扩增,得到2061bp、1323bp、801bp和963bp特异性目的条带,其中BarthaK61疫苗株基因组检测最小浓度为136pg/μL。建立了针对野毒株和两种疫苗株的鉴别诊断方法。     

牛布鲁菌强毒株544与猪型疫苗株S2基因组差异筛选与鉴定

应用代表性差异分析技术(Representational difference analysis,RDA)对流产布鲁菌强毒株544和疫苗株S2进行基因组差异分析。经过3轮差减杂交,对差异片段进行Southern-blot验证,BLAST分析和PCR鉴定,最终获得疫苗株S2特有的3条差异片段与已测序的所有猪布鲁菌(Brucella suis)同源性均为100%,只在弱毒株S2基因组中检测出,而在强毒株544中不存在,为建立布鲁菌自然感染菌与疫苗株的基因鉴别诊断方法奠定了基础。     

IS711和omp2作为布氏杆菌种属及种株间分子鉴别诊断标记的研究

布氏杆菌为世界性具重要公共卫生意义的人兽共患疫病原，分6个种。建立种间及种株间安全敏感、经济有效的快速鉴别诊断方法对布病防制及分子流行病学研究具有重要意义。布氏杆菌IS711和omp2基因具有种属特异性，可用于布氏杆菌的PCR分子诊断。其中IS711为转座因子，在不同种布菌种存在插入位置的多态性，外膜蛋白OMP2编码基因则存在反向重复序列及种株间的多态性。为此，分别采用复式-PCR、PCR和限制性酶切片段长多态性（RFLP）分析，对分属于B．mclitcnsis、B．suis和B．abortus的不同种布氏杆菌的不同种株，M5、M16、S2、S6和S19进行分子鉴别诊断。结果显示，根据IS711基因特定PCR扩增片段长多态性，可进行布氏杆菌种间的快速鉴别；而omp2编码基因PCR扩增片段PsrⅠ、KpnⅠ、NcoⅠ和Eco47 Ⅲ等4种限制酶片段长多态性，则可成为布氏杆菌菌株间特异的分子鉴别诊断标记，甚至疫苗株M5和野毒株M16之间的分子诊断标记。