苦参碱人工抗原的合成与鉴定

【目的】合成并鉴定苦参碱人工抗原,以获取具有特异性和高亲和性的苦参碱多克隆抗体,为建立苦参碱的酶联免疫分析方法奠定基础。【方法】通过对槐果碱不饱和双键进行亲核加成、叠氮化、催化氢化合成苦参碱半抗原13氨基苦参碱(ST),并经MS、NMR法对其结构进行鉴定;采用戊二醛法将半抗原与载体蛋白偶联合成苦参碱的人工抗原(ST-BSA和ST-OVA),经紫外光谱扫描法、SDS-PAGE法、红外光谱扫描法对人工抗原进行鉴定;将制备的苦参碱人工抗原免疫健康新西兰大白兔获得苦参碱的多克隆抗体,通过间接非竞争ELISA方法测定其效价。【结果】成功合成了一种苦参碱半抗原13-氨基苦参碱(ST),与载体蛋白BSA、OVA偶联后得到了免疫原(ST-BSA)和包被原(ST-OVA),免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,效价达到128 000。【结论】成功合成了苦参碱人工抗原,为苦参碱免疫分析方法的研究提供了条件。     

邻苯二甲酸二丁酯人工抗原的制备及免疫鉴定

【目的】制备并鉴定1种新型邻苯二甲酸二丁酯人工抗原。【方法】以4-硝基邻苯二甲酸为原料,经过酯化、还原生成4-氨基邻苯二甲酸二丁酯(DBAP),DBAP再与戊二酸酐反应,衍生生成4-戊二酸单酰邻苯二甲酸二丁酯(DBCP)。将合成的半抗原衍生物DBCP通过活性酯法与牛血清蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)偶联,得到人工抗原。通过免疫新西兰大白兔获得抗血清,经间接竞争酶联免疫法(ic ELISA)检测抗体特异性。【结果】经质谱、氢核磁共振谱图鉴定,半抗原衍生物合成成功,经紫外光谱、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫试验证实偶联成功,并计算得出DBCP与载体蛋白BSA和OVA的结合比分别为11∶1和17∶1。经ic ELISA法检测,兔1和兔2的血清效价均达到1∶128 000,IC50分别为301和308 ng·m L-1,反应特异性较好。【结论】半抗原衍生物的合成是方便、安全的。邻苯二甲酸人工抗原的成功制备使获得DBP多克隆抗体以及建立DBP免疫分析方法成为可能。     

斑蝥素人工抗原的制备与初步鉴定

【目的】合成并鉴定斑蝥素人工抗原,为建立斑蝥素的酶联免疫分析方法提供依据。【方法】对斑蝥素进行化学修饰,引入羟基合成N-羟乙基斑蝥酰亚胺(BY),并经MS、NMR、IR法对其结构进行鉴定。进一步经琥珀酸酐法合成琥珀酸酯(BYS)并纯化,在此基础上,分别采用混合酸酐法和碳二亚胺法将半抗原与载体蛋白偶联,合成斑蝥素的人工抗原(BYS-HS-BSA、BYS-TY-BSA、BYS-HS-OVA、BYS-TY-OVA),并经MS、IR法对人工抗原进行定性鉴定。免疫原免疫兔子获得抗斑蝥素多克隆抗体并测定其效价。【结果】成功合成了一种斑蝥素半抗原,与载体蛋白BSA、OVA偶联后得到免疫原(BYS-HS-BSA、BYS-TY-BSA)和包被原(BYS-HS-OVA、BYS-TY-OVA),免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,效价分别为8 000和16 000。【结论】初步合成并鉴定了斑蝥素人工抗原,在设计合成斑蝥素的半抗原时不能破坏其关键的环结构。     

培氟沙星人工抗原的合成与鉴定

【目的】制备培氟沙星(Pefloxacin,PEF)完全抗原,并对其免疫学特性进行鉴定。【方法】以培氟沙星与牛血清白蛋白(BSA)为材料,用碳二亚胺(EDC)法制备培氟沙星-牛血清白蛋白完全抗原(PEF-BSA),变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及紫外扫描(UV)检测其免疫学特性;利用PEF-BSA免疫BALB/c小鼠,无菌条件下收集血清,用间接ELISA测定多抗血清(pAb)效价。并用同样的方法制备和鉴定培氟沙星-鸡卵清白蛋白完全抗原(PEF-OVA)。【结果】培氟沙星与牛血清白蛋白及鸡卵清白蛋白偶联成功,PEF-BSA偶联比为8∶1,PEF-OVA偶联比为6∶1。间接ELISA测得多抗血清效价均达到4 000以上,得到了较好的免疫效果。【结论】成功得到了培氟沙星完全抗原,该抗原具有较强的特异性及良好的敏感性。     

磺胺二甲基嘧啶人工抗原的合成及鉴定

用重氮化方法将SM2偶联于载体蛋白BSA和OVA上,合成了免疫抗原BSA-SM2和包被抗原OVA-SM2。紫外扫描及SDS-PAGE电泳结果表明,BSA-SM2,OVA-SM2的紫外吸收光谱与BSA,OVA,SM2相比均发生了改变;用BSA-SM2免疫BALB/C小鼠,获得了高效价和特异的多克隆抗体,表明半抗原SM2和载体蛋白偶联成功。     

抗异丙隆多克隆抗体的研制

 【目的】为了建立测定脲类除草剂异丙隆残留的免疫分析方法（ELISA），对制备高效价抗异丙隆多克隆抗体的方法进行了研究。【方法】以对异丙基苯基异氰酸酯、N-甲基吡咯环酮和N-甲基己内酰胺为反应原料，经两步化学反应合成了两种异丙隆半抗原：1-(3-丙基羧基)-3-(4-异丙基苯基)-1-甲基脲（HAPTEN 4C）和1-(5-戊基羧基)-3-(4-异丙基苯基)-1-甲基脲（HAPTEN 6C）。通过活性酯法将半抗原与载体蛋白(BSA、OVA)偶联制备了两种异丙隆的人工抗原HAPTEN 6C-BSA和HAPTEN 4C-OVA。利用免疫抗原HAPTEN 6C-BSA免疫新西兰大白兔获得了高效价的异丙隆的多克隆抗体。建立了以HAPTEN 4C-OVA为包被原的间接竞争ELISA方法。【结果】合成的半抗原经薄层色谱、IR、1HNMR确证；人工抗原HAPTEN 6C-BSA和HAPTEN 4C-OVA的结合比分别为46﹕1和36﹕1。抗血清的最高效价为1.6105。经优化确定的间接竞争ELISA分析方法中包被抗原的浓度为0.1 g•ml-1,抗血清的工作稀释倍数为1.0×105。根据异丙隆的标准抑制曲线，异丙隆对免疫反应的的IC50值为0.07 g•ml-1。抗体对氯溴隆、绿谷隆、特丁塞隆等6种取代脲类除草剂的交叉反应率都小于0.1%。【结论】异丙隆是小分子，本身没有免疫活性，也没有与载体蛋白偶联的活性基团。高效价、高特异性抗体的制备是利用免疫学方法进行异丙隆残留分析的最关键因素。本研究合成的两种异丙隆的相似物具有不同长度碳链的羧基，并且使异丙基和苯基充分暴露，具备了异丙隆半抗原的特点。将半抗原偶联到载体蛋白上获得的人工抗原经免疫兔子后获得了高效价、高特异性的抗异丙隆抗体。     

泰妙菌素完全抗原制备及鉴定

为建立泰妙菌素(Tiamulin,TML)完全抗原制备方法,分别用混合酸酐法(Mixed anhydride,MA)和N,N-羰基二咪唑法(1,1′-Carbonyldiimidazole,CDI)将半抗原泰妙菌素偶联至载体牛血清白蛋白(Bovine serum albumen,BSA),以制备泰妙菌素完全抗原。对2种方法制备的抗原进行紫外扫描鉴定和SDS-PAGE凝胶电泳鉴定,根据SDS-PAGE凝胶电泳图估算出完全抗原的偶联比。结果均显示抗原偶联成功,估算出的偶联比分别约为1∶23.6和1∶8.1,说明,混合酸酐法制备泰妙菌素完全抗原时偶联率更高。     

百菌清人工抗原的合成及多克隆抗血清的制备

将百菌清(CTN)进行化学修饰后引入羟基活性基团,合成具有半抗原结构特征的百菌清衍生物(CTN-OH);采用N,N-羰基二咪唑法(CDI)将CTN-OH与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联合成人工免疫抗原CTN-BSA和包被抗原CTN-OVA,用紫外分光光度法(UV)和凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定;通过动物免疫试验获得鼠源多抗血清,并使用间接ELISA和阻断ELISA的方法对多抗血清进行鉴定。结果表明,半抗原CTN-OH与载体蛋白偶联成功;受免3只小鼠的效价均达1∶12 800,且2号小鼠对CTN的IC50为93.593μg/L,成功获得高效价、高敏感性、特异性强的鼠源多克隆抗血清,为CTN单克隆抗体制备及快速检测方法的建立奠定基础。     

天名精内酯酮多克隆抗体的制备

【目的】合成并鉴定天名精内酯酮人工抗原,制备天名精内酯酮多克隆抗体,为天名精内酯酮作用靶标的免疫化学定位奠定基础。【方法】通过天名精内酯酮4位羰基和盐酸氨基脲氨基的亲核加成反应制备半抗原天名精内酯酮缩氨基脲(CN),使用MS和NMR对其结构进行鉴定;采用戊二醛法将半抗原和载体蛋白牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联,合成天名精内酯酮免疫原(CN-BSA)和包被原(CN-OVA),采用紫外吸收扫描法、红外光谱法对免疫原及包被原进行鉴定;用制备好的免疫原免疫健康BALB/c小鼠获得天名精内酯酮多克隆抗体,通过间接非竞争ELISA法测定其效价。【结果】成功制备了天名精内酯酮免疫原(CN-BSA)和包被原(CN-OVA),获得了效价为128 000的天名精内酯酮多克隆抗体。【结论】成功制备了天名精内酯酮多克隆抗体。     

重叠延伸PCR法扩增猪囊尾蚴AgB基因及其在BHK-21细胞中的表达

 【目的】克隆猪囊尾蚴AgB基因并在体外细胞中表达。【方法】采用 RT-PCR法分别扩增AgB基因的上半段和下半段序列。采用重叠延伸PCR法（splicing overlap extension PCR method,SOE-PCR）把具有35个相同碱基的上下半段扩增为全长基因,并构建到真核表达载体pVAX1,将酶切、PCR、测序鉴定的阳性质粒经脂质体转染 BHK-21细胞。通过SDS-PAGE、Western-blotting、间接免疫荧光法,检测细胞中B抗原的表达。【结果】琼脂糖凝胶电泳显示扩增的不同片段大小分别与预期的相同。重组表达载体转染BHK细胞后有荧光出现。表达的蛋白能被猪囊尾蚴病阳性血清所识别。【结论】通过重叠延伸PCR法成功扩增了AgB基因全长并构建到真核表达载体,目的蛋白在BHK-21细胞中表达。     

几种SDS-PAGE凝胶电泳染色方法的比较

[目的]对几种SDS-PAGE凝胶电泳染色方法进行比较。[方法]从凝胶背景颜色、染色时间及灵敏度的角度对6种SDS-PAGE凝胶电泳快速染脱色方法进行比较研究,并对适用于椰子和油棕总蛋白质SDS-PAGE凝胶电泳的实用方法进行总结。[结果]方法 F最快速,条带清晰,染料及试剂都较少,是一种经济、快速、安全、实用的染色方法,整个过程仅需1 h左右。[结论]试验比较了几种SDSPAGE凝胶电泳染色方法,对进一步开展椰子和油棕蛋白质组学研究具有重要意义。     

枣树叶片蛋白质提取及SDS-PAGE单向电泳条件优化

[目的]对枣树叶片蛋白质提取方法及其SDS-PAGE单向电泳条件进行优化。[方法]对枣树5种蛋白质提取方法和影响SDS-PAGE单向电泳的因素进行比较研究。[结果]改良丙酮沉降法提取出的蛋白质杂质较少,条带数量多且清晰,同时通过研究确定了一套适用于枣树蛋白检测的SDS-PAGE凝胶制备及电泳方法。[结论]该研究为进一步从分子生物学的角度研究枣树与枣疯病植原体的互作机制提供了技术的基础。     

宽体金线蛭抗凝物质的提取与纯化

采用丙酮三氯乙酸法、凝胶过滤层析、阴离子交换层析、Sep-pak C18柱宽体金线蛭中抗凝物质进行分离与纯化,并且进行SDS-PAGE凝胶电泳。结果表明：SDS-PAGE电泳为单一条带,并且提取的物质具有抗凝活性,测序结果表明得到一种新的抗凝物质。     

一种改进的双色SDS-PAGE凝胶和可视化上样电泳方法

SDS-PAGE电泳是蛋白质分析和研究中的重要高效手段．由于分离胶、浓缩胶与电泳缓冲液以及空气都是无色透明的物质,在胶的制作和点样过程中仅仅通过浓缩胶相与缓冲液水相或空气相对光的折射来准确判断点样孔的位置并进行点样操作,因而比较困难．该文介绍1种在浓缩胶中添加颜色染料,使浓缩胶显现颜色,以此可视化区分浓缩胶中点样孔（井）位置的方法,可以准确而高效完成点样操作,使传统的SDS-PAGE点样过程通过折光性来判断变为可视化准确判断,提高点样效率和电泳质量．      

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳4种染色方法的比较研究

[目的]比较SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中蛋白质的染色方法,建立美洲大蠊抗肿瘤活性部位SDS-PAGE后更为合适的染色方法。[方法]以牛血清白蛋白(BSA)为标准品,采用考马斯亮蓝染色法、氯化钾染色法、钙染色法和银染色法进行比较,在此基础上,将样品美洲大蠊抗肿瘤活性部位进行SDS-PAGE电泳和染色。[结果]结果表明银染法能够准确、快速、简便的对美洲大蠊抗肿瘤活性部位的SDS-PAGE进行染色。[结论]为美洲大蠊药用价值的研究奠定了基础。     

山西不同品种大豆贮藏蛋白提取及亚基分析

用不同盐缓冲溶液分别提取大豆贮藏蛋白,对提取效果分析比较,结果表明,Tris-HCl(pH 7.8)缓冲溶液的提取方法最为合适;在确定提取方法的基础上,对山西不同品种大豆的贮藏蛋白进行了SDS-PAGE分析,电泳图谱显示,不同品种间贮藏蛋白亚基在数量和含量上有较大差别。     

小麦叶片蛋白质双向电泳的改良方法

以普通小麦叶片为实验材料，在原有双向电泳基础上通过对样品制备、样品溶解、等电聚焦电泳、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳以及染色方法等关键步骤进行改进和优化，在小麦叶片可溶性蛋白的分析中获得了满意的双向电泳图谱。     

番茄幼苗根系总蛋白SDS-PAGE方法的优化

[目的]建立一套适合番茄幼苗根系蛋白质组分析的SDS-PAGE方法和获得清晰的电泳图谱。[方法]以番茄幼苗根系为试材,对根系蛋白的提取方法和上样量等因素进行了优化。[结果]上样量为60μg时,改良后的TCA-丙酮沉淀法提取的蛋白能够获得分辨率较高、图像清晰、重复性好的SDS-PAGE图谱。[结论]该法可以基本满足番茄幼苗根系蛋白质组学的研究。     

番茄幼苗根系总蛋白SDS-PAGE方法的优化

[目的]建立一套适合番茄幼苗根系蛋白质组分析的SDS-PAGE方法,获得清晰的电泳图谱。[方法]以番茄幼苗根系为试材,对根系蛋白的提取方法和上样量等因素进行了优化。[结果]上样量为60μg时,改良后的TCA-丙酮沉淀法提取的蛋白能够获得分辨率较高、图像清晰、重复性好的SDS-PAGE图谱。[结论]该法可以基本满足番茄幼苗根系蛋白质组学的研究。     

犬血清IgG的纯化、抗体制备及其鉴定

[目的]探讨犬血清IgG的纯化方法。[方法]采用硫酸铵盐析法结合SephadexG-200凝胶柱层析提取纯化犬血清IgG,利用SDS-PAGE电泳和免疫印迹法鉴定所得产品的纯度和免疫活性。[结果]获得的纯化犬血清IgG的SDS-PAGE图谱中存在2条蛋白条带,表明获得了高纯度的犬血清IgG;重链分子量为58kD,轻链分子量为27kD,IgG分子量为170kD。特异性检测发现犬血清IgG重链和轻链都能与鼠抗犬血清IgG抗体结合,表明纯化犬血清IgG具有免疫原性和反应原性。[结论]硫酸铵盐析法结合SephadexG-200凝胶柱层析可获得纯度高、活性好的纯化犬血清IgG,为犬血清IgG相关的免疫学试验提供了高质量的免疫材料。