幼叶黄化油菜突变体Cr3529中Toc33 cDNA的克隆和序列分析

 分别提取甘蓝型油菜幼叶黄化突变体Cr3529和野生型近等基因系3529幼叶期总RNA,反转录合成cDNA,根据拟南芥Toc33基因的编码区序列设计引物,RT-PCR扩增出叶绿体外膜转运机器构件蛋白基因Toc33。扩增产物与T载体连接,转化E.coli。获得cDNA克隆,分别命名为BnToc33-c和BnToc33,长度均为894 bp,与拟南芥Toc33cDNA有着较高的同源性。突变油菜Cr3529与野生型3529在Toc33的基因序列上有3处碱基存在差异,均为错义突变,其中一处位于TOC33蛋白的跨膜区域     

猕猴桃果实L-半乳糖内酯脱氢酶和脱氢抗坏血酸还原酶cDNA片段的克隆与序列分析

克隆猕猴桃果实L-半乳糖内酯脱氢酶(GalLDH)和脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)基因,可为揭示猕猴桃高抗坏血酸(AsA)含量的分子机制奠定基础。研究以猕猴桃果实为材料提取总RNA,采用RT-PCR法,克隆出L-GalLDH基因的cDNA片段857 bp和DHAR基因的cDNA片段594 bp并测序,根据测序结果推测其氨基酸序列,并与刺梨、拟南芥、花椰菜、甘薯和草莓等植物的GalLDH基因和DHAR基因氨基酸序列进行亲缘分析。结果表明,猕猴桃GalLDH基因氨基酸序列和核苷酸序列与刺梨的相似性高达88%,其在同源基因进化关系树中单独聚为一类;DHAR基因氨基酸序列和核苷酸序列与苹果的相似性高达98%和99%,两者在进化关系上聚为一类。可知克隆到的2个核苷酸片段确为猕猴桃L-GalLDH和DHAR基因cDNA片段,同源基因植物亲缘关系聚类与传统的形态分类有一定的差异。     

cDNA芯片筛选亚洲棉短绒分化发育相关基因

 【目的】筛选亚洲棉短绒分化发育相关基因。【方法】利用cDNA芯片技术在棉纤维发育前期开花前3天(-3DPA)、开花当天(0DPA)、开花后3天(+3DPA)、5天(+5DPA)、7天(+7DPA)筛选野生型DPL971与其短绒突变体DPL972的差异基因。通过与模式植物拟南芥数据库相结合,找到与棉纤维起始发育相关基因,并通过RT-PCR和Real-Time PCR（QRT-PCR）验证部分侯选基因。【结果】筛选出与亚洲棉纤维起始分化发育相关基因8个,其中相对应的与拟南芥同源性较高的蛋白有7个,分别为KAK（DR461366）、MYB5（ES812048）、TTG1（ES811600）、MYB23（DR453866）、CSLD3（DR459646）、RHD2（DR461821）和ZWI（ES791383）,这些基因在拟南芥的表皮毛起始发育过程中都起着重要的作用。RT-PCR和QRT-PCR结果表明MYB23、MYB5、TTG1、CSLD3、RHD2这5个基因在短绒突变体DPL972与其野生型DPL971的+3DPA胚珠中表达差异都有差异。【结论】上述结果表明这5个基因可能与短绒分化发育相关,第1个基因可能抑制短绒分化和发育,后4个则促进短绒分化和发育。     

3株鸽源新城疫病毒陕西分离株F基因的克隆与序列分析

对3株鸽源性新城疫病毒F基因进行扩增和序列分析,探讨分离毒株相互之间以及与疫苗毒之间的遗传进化关系.采集病料,通过非免疫鸡胚接毒传代分离病毒,HA及HI试验鉴定其为ND病毒;设计特异性引物,RT-PCR扩增分离ND病毒F 基因的重要功能区片段(1 395 bp),并对其进行克隆、测序及序列分析.结果表明:3株鸽源NDV陕西分离株相互之间F 基因核苷酸序列的同源性在98.0%～99.3%,氨基酸序列同源性为98.5%～99.1%;其F 基因裂解位点的氨基酸组成与NDV 强毒株的特征性结构(112 R-R-Q-K-R-F117 )一致.系统发育进化树表明,此3 株强毒株与某贵州分离株(登录号:EF589137) 高度同源,处于进化树的同一分支,属于基因Ⅵ型.分离到的3株鸽源NDV之间同源性较高,鸡胚病变和序列分析表明其为强毒,与传统的La Sota,B1等疫苗株同源性很低.     

葡萄GRAS基因家族生物信息学分析

为研究葡萄中GRAS基因家族的特征,本文首先利用生物信息学方法对葡萄91条GRAS蛋白序列的系统发生和GRAS基因组定位进行分析,然后对其氨基酸组成成分、理化性质以及二级和三级结构进行预测和分析,同时还分析了葡萄与拟南芥的GRAS基因家族之间的联系。结果显示这91条蛋白序列与拟南芥35个GRAS基因蛋白序列一起分成了8个亚族,说明拟南芥与葡萄GRAS基因间具有较高的保守性。基因组定位结果发现91条GRAS基因分布在17条染色体上。研究还发现不同亚族间氨基酸数目、氨基酸序列间的疏水性存在一定的差异;而二级结构预测结果发现,91条氨基酸序列以α-螺旋和随机卷曲为主要组成部分,且91条氨基酸序列三维结构相似。     

高等植物F3′HcDNA及其氨基酸序列的生物信息学分析

用生物信息学方法对GenBank中拟南芥、油菜、大豆、矮牵牛和高梁等的类黄酮3′-羟化酶基因的cD-NA序列及其编码氨基酸序列的结构、理化性质、信号肽、疏水性/亲水性、亚细胞定位、跨膜结构域、功能域和进化关系进行了初步预测和分析。结果表明:不同植物类黄酮3′-羟化酶基因cDNA序列的相似性为69.5%,其起始密码子均为ATG,终止密码子均为TAA、TAG或TGA,包括5,′3′非翻译区和一个开放阅读框;不同植物类黄酮3′-羟化酶基因cDNA序列编码的氨基酸序列的理化性质基本一致,相似性为72.5%,含有6段保守氨基酸序列,是"PPGR"、"AGTDT"、"RPPN"、"AYNY"、"IKALLL"、"TPLS";在进化关系上可划分为两大类;不同植物类黄酮3′-羟化酶具有一个跨膜结构域、定位于内质网上,并有一段与细胞色素P450功能区相匹配的功能域;类黄酮3′-羟化酶属具转运肽的亲水性稳定分泌蛋白,其二级结构为α-β型,α-螺旋和无规卷曲为最主要的结构元件,延伸链和β-转角散布于整个结构。可为类黄酮3′-羟化酶基因的克隆和遗传操作提供理论参考。     

奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼几种谷胱甘肽S-转移酶基因克隆与分析

通过RT-PCR法和RACE法,分别从奥利亚罗非鱼(Oreochromisco aureus)肝脏获得alpha、rho1、rho2型GST(GSTA、GSTR1、GSTR2)基因cDNA全序列,从尼罗罗非鱼(Oreochromis nilotica)肝脏获得GSTR1、GSTR2基因cDNA全序列。结果表明:奥利亚罗非鱼GSTA基因cDNA全序列为933bp,5′非翻译区(5′-UTR)为98bp,3′非翻译区(3′-UTR)为166bp,开放阅读框(ORF)为669bp,编码222个氨基酸。奥利亚、尼罗罗非鱼GSTR1基因ORF均为681bp、均编码226个氨基酸;奥利亚、尼罗罗非鱼GSTR2基因ORF均为693bp,均编码230个氨基酸。氨基酸序列同源性比较和系统进化分析均表明,罗非鱼GST基因与鱼类GST同源性较高,与哺乳类、鸟类、两栖类GST同源性较低。     

草莓AP1同源基因的克隆、表达及启动子分析

【目的】从草莓（Fragaria×ananassa）中克隆APETALA1(AP1)同源基因,并分析其在不同组织、器官及不同花发育阶段的表达水平,探讨其在草莓植株成花进程中的作用。【方法】根据其它物种AP1同源基因的保守序列设计简并引物,以草莓幼叶和花芽为试材,克隆得到AP1的基因片段,在此基础上利用RACE的方法分离获得其cDNA全长。利用实时定量RT-PCR分析草莓不同组织、器官及不同花发育阶段中AP1同源基因的表达水平。利用染色体步移的方法分离启动子序列。【结果】从草莓品种‘花姬’中克隆出AP1同源基因的cDNA全长序列,命名为FaAP1;其CDS长度为735 bp,编码245个氨基酸,与玫瑰AP1-1的氨基酸序列同源性最高,达到92%,与拟南芥AtAP1的氨基酸序列同源性为64.00%。FaAP1编码的氨基酸全长序列符合MADS-box基因家族特征,包含MADS-box、I-间插域、K-box域和C-末端几个结构域,是MIKC类型的MADS-box基因家族的成员。实时定量RT-PCR结果表明,在不同组织、不同花器官及不同花发育阶段中FaAP1的表达量存在差异。其启动子除了具有TATA/CAAT-box外还包含一些特异作用元件。【结论】从草莓中分离出的FaAP1基因,在花分生组织形成和花器官发育中有一定的调控作用。     

刺梨果实半乳糖内酯脱氢酶基因cDNA片段的克隆及在不同器官的表达

 根据GenBank中登录的拟南芥、花椰菜、甘薯和草莓等植物的半乳糖内酯脱氢酶基因(GalLDH)保守序列设计引物，采用RT-PCR法，从刺梨果实中扩增出该基因的cDNA片段855 bp并测序。序列分析表明，刺梨GalLDH与草莓GalLDH的相似性达92%，与其它植物同源基因的相似性也在80%左右；该片段编码285个氨基酸，推导的氨基酸序列与其它植物同源基因的相似性高达75%～87%。Northern杂交分析表明，该基因在刺梨不同器官中的表达差异明显：在果实内有很高的表达水平，叶内较弱，而在茎和根内只能检测到微弱的信号。这种差异与不同器官中维生素C的积累量高度一致。     

红海榄液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因的克隆与分析

根据液泡膜Na+/H+反转运蛋白基因(fHXl)的保守序列设计引物,通过RT-PCR扩增得到红海榄Na+/H+反转运蛋白基因的cDNA片段,然后采用cDNA末端快速扩增法(RACE)得到RsHX1基因的全长cDNA序列,GenBank登录号为FJ627273,被命名为RsNHXl.该基因序列的长度为2 094 bp,包...     

棉铃虫CYP4家族基因片段克隆及序列分析

以5龄实验室品系棉铃虫的总RNA为模板,采用一对昆虫细胞色素P450简并引物,利用反转录—多聚酶链式反应(RT-PCR)扩增并筛选出10个新的长度约450bp的cDNA片段,并对这些序列与GeneBank中已知序列进行相似性分析,初步推测这10个P450基因片段属于CYP4家族的CYP4M和CYP4S2个亚家族。     

野生一粒小麦糖原合成酶激酶基因TbGSK1的克隆与分析

根据普通小麦糖原合成酶激酶基因序列设计引物,以野生一粒小麦cDNA为模板,利用RT-PCR技术,扩增出野生一粒小麦糖原合成酶激酶基因的cDNA序列,克隆到T载体上并进行测序。结果显示,该基因全长1543bp,开放阅读框1068bp,编码一个由355个氨基酸组成的蛋白。Southern blot分析显示,其在野生一粒小麦基因组中为单拷贝基因。该基因与普通小麦、玉米、烟草、苜蓿、拟南芥等植物的糖原合成酶激酶基因序列同源性分别达到94.1%、91.3%、83.2%、81.5%、72.8%。     

水稻盐胁迫相关基因sos5的克隆与序列分析

采用RT-PCR扩增的方法,从水稻(Oryza sativa)中克隆获得了1 574 bp的cDNA片段。基因测序和序列同源性分析结果表明,所克隆的基因片段包含1 284 bp的开放阅读框,编码一个含有427个氨基酸的多肽,该蛋白与拟南芥SOS 5蛋白同源性达45.6%,与小麦同源性达71%。     

日本百脉根牻牛儿基牻牛儿基氢化酶的电子克隆及进化分析

根据物种间同源基因相对保守的特点,利用生物信息学的方法,以拟南芥牻牛儿基牻牛儿基氯化酶（GGH）基因cDNA序列为信息探针,搜索GenRank中的HTGs数据库,找到一个与之高度匹配的日本百脉根基因组DNA序列LJT46M09,用GENSCAN软件分析该序列得到一个包含2个外显子和1个内含子的基因。以此基因序列BLAST检索GenBank中的est-others数据库获得了同源的EST片段。进行EST拼接后得到该基因的cDNA序列,GenBank登录号为DQ013361,由1389bp核苷酸组成,具有完整的开放阅读框架（ORF）,推测编码蛋白为462个氨基酸。推导的氨基酸序列与大豆、截形苜蓿、烟草、拟南芥、小麦、水稻的牻牛儿基牻牛儿基氢化酶基因氨基酸序列的一致率分别为91％、89％、84％、81％、73％、74％。访基因与叶绿素等的生物合成有关。     

玉米ZmPTF1基因克隆和过表达分析

PTF是一类具有bHLH结构域的转录因子,在低磷胁迫应答中调节一系列下游磷胁迫基因的表达.根据拟南芥和水稻中的序列信息,通过RACE的方法获得ZmPTF1的全长cDNA序列.序列分析表明该1709bp的cDNA片段含有1446bp的完整开放读码框,编码481个氨基酸的多肽链,含有一个bHLH结构域,与已报道的OsPTF1在氨基酸水平上有65%的相似性.构建了pCAMBIA1300-Pubi-ZmPTF1-Tnos-als质粒转化玉米,得到过表达的转基因后代.对低磷营养液浇灌下的T2代植株分析表明:过表达ZmPTF1促进了植株根系的发育,提高了植株对低磷环境的耐受性.     

Cloning and Expression Level Analysis of Two BnaANT Candidate Genes in Brassica napus

AINTEGUMENTA （ANT） gene has been proved to have a novel function on controlling the organ size and the seed weight in Arabidopsis thaliana, the research on its orthologous gene in Brassica napus will be of potential interest to elucidate the molecular mechanism of rapeseed development and increase the rapeseed output. A SMART cDNA library of the flower bud from B. napus cultivar Zhongshuang 9 was constructed, and the full-length cDNAs of two homologous BnaANT candidate genes were cloned by PCR in B. napus, namely BnaX.ANT.a （GenBank accession no. DQ211969） and BnaX.ANT.b （accession no. DQ211970）. They shared 87.1 and 83.4% amino acid identity with ANT of A. thaliana, respectively. There is 87.4% amino acid identity between BnaX.ANT.a and BnaX.ANT.b. By quantitative real-time PCR, the obviously differential expression levels of the two BnaANT candidate genes were detected in the 28 DAF seeds of the big and small grains B. napus lines, the expression abundance of BnaANT in the 28 DAF seed of 9311 was over three times compared to that of 9260, which indicates that these two BnaANT genes are also likely related to the floral organ size and the seed weight in B. napus.     

水稻盐胁迫相关基因sos 5的克隆与序列分析

采用RT-PCR扩增的方法,从水稻(Oryza sativa)中克隆获得了1 574 bp的cDNA片段.基因测序和序列同源性分析结果表明,所克隆的基因片段包含1 284 bp的开放阅读框,编码一个含有427个氨基酸的多肽,该蛋白与拟南芥SOS 5蛋白同源性达45.6%,与小麦同源性达71%.     

苹果NADP依赖的苹果酸酶基因克隆、序列和表达分析

【目的】克隆苹果（Malus×domestica B.）中苹果酸代谢的关键酶基因MdNADP-ME,进行序列特征分析,研究MdNADP-ME在苹果中组织表达的情况。【方法】利用RT-PCR技术获得苹果MdNADP-ME1,2,3全长的cDNA序列。对该序列进行生物信息学分析,采用荧光实时定量PCR技术研究MdNADP-ME1,2,3的组织表达。【结果】测序结果显示,获得的3个NADP-苹果酸酶基因（MdNADP-ME1、MdNADP-ME2 和 MdNADP-ME3; GenBank 登录号为JX971883、JX971884和JX971885）,其ORF分别为1 512、1 782和1 926 bp,推测其分别编码503、593和641个氨基酸的多肽。氨基酸序列和结构分析显示,这3个基因均含有5个保守的氨基酸区域（motif I-V）,含有2个功能结构域：malic和NAD_bind_1_malic_enz。进化树分析结果显示,MdNADP-ME1 和MdNADP-ME2属于双子叶植物细胞质NADP-ME型,MdNADP-ME3属于双子叶植物质体NADP-ME型。荧光实时定量PCR结果表明,MdNADP-ME1-3在被检测的组织中均有表达,但表达差异明显。【结论】MdNADP-ME1-3属于植物NADP-ME家族,结构高度保守,并且在苹果的不同组织中有不同表达模式。