人骨形成蛋白3全长基因转化烟草的初步研究

将含有人骨形成蛋白3(hBMP-3)全长基因的质粒pCAMBIA1300-hBMP-3通过电激法转化到根癌农杆菌LBA4404中,以烟草无菌苗叶盘为外植体,通过农杆菌介导法进行遗传转化,获得了抗潮霉素(Hy-gromycin,Hyg)的再生植株,通过潮霉素抗性鉴定及PCR检测,初步确定人骨形成蛋白-3(hBMP-3)全长基因已整合到烟草的基因组中。     

根癌农杆菌介导的香蕉炭疽菌转化

利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的转化方法,以香蕉炭疽菌(Colletotrichum musae)的分生孢子为受体,pTHPR1为双元载体,成功实现了植物病原真菌香蕉炭疽菌的遗传转化.在诱导培养基pH 5.6、乙酰丁香酮200 μg/mL、共培养时间24 h等适宜条件下,最高转化率可达260个转化子/106个孢子.对转化子的PCR检测表明,T-DNA已整合到香蕉炭疽菌的基因组中,转化子的遗传表现稳定.     

根癌农杆菌介导基因转化的研究进展

本文综述了根癌农杆菌介导基因转化的一些最新研究进展,包括近几年来备受关注的参与农杆菌介导转化的相关植物编码因子的研究,标记基因的剔除方法,介导转化范围的扩展等.针对上述领域,指出了其中仍然存在的一些问题并提出了一些构想.     

根癌农杆菌介导油菜CBF1基因转化拟南芥

[目的]为油菜CBF1基因应用于作物抗逆遗传改良提供理论依据。[方法]采用根癌农杆菌介导法将油菜CBF1基因转入拟南芥,筛选抗性转基因拟南芥植株,进行PCR检测和GUS染色。[结果]与不抗潮霉素的野生型拟南芥幼苗相比,对潮霉素具有抗性的转基因拟南芥幼苗的叶片比较大,根特别长。PCR检测表明38株抗性拟南芥植株中有29株能扩增出与目的基因大小一致的条带,阳性率为76.3%,而野生型拟南芥植株没有扩增出相应条带。阳性PCR扩增产物的测序结果表明油菜CBF1基因已经转入到拟南芥。GUS染色表明有22株转基因拟南芥植株呈现阳性。[结论]油菜CBF1基因可以整合到拟南芥基因组并能稳定表达。     

根癌农杆菌介导FPF1基因转化菊花的研究

经过转化材料的筛选、KM筛选浓度、Cef抗菌浓度以及延迟筛选时间的测定,以根癌农杆菌（Agrobactriumtumefaciens）LBA4404菌株介导FPF1基因转化菊花,对转化材料进行连续KM筛选,获得105株抗性苗,部分植株经PCR检测呈阳性.田间观察部分抗性株与对照相比在株型、叶色及花期上表现出差异.     

根癌农杆菌介导FPF1基因转化菊花的研究

经过转化材料的筛选、KM筛选浓度、Cef抗菌浓度以及延迟筛选时间的测定,以根癌农杆菌(Agrobactrium tumefaciens)LBA4404菌株介导FPF1基因转化菊花,对转化材料进行连续KM筛选,获得105株抗性苗,部分植株经PCR检测呈阳性.田间观察部分抗性株与对照相比在株型、叶色及花期上表现出差异.     

根癌农杆菌介导LFY基因转化苹果的研究

将苹果杂交种（长富2号×新红星）种子打破休眠,经消毒处理后接种在MS培养基上获得无菌组培苗。以组培苗叶片为试材,通过不同激素组合试验,获得了适宜植株再生的培养基MS＋NAA 0.4 mg/L＋TDZ 2.0 mg/L。利用含LFY基因的根癌农杆菌EHA105转化苹果叶片,得到转LFY基因的阳性植株,经PCR和RT-PCR检测,有2株出现特异性条带,证明该基因已经整合到苹果基因组中。     

根癌农杆菌介导的fad2 RNA干扰体基因转化甘蓝型油菜的研究

Δ12-油酸去饱和酶(Delta-12 oleate desaturase FAD2)是植物产生多聚不饱和脂肪酸的关键酶。对fad2基因表达进行抑制,可提高油菜种子油酸的相对含量。依据hpRNA介导的RNAi技术的原理,构建了以甘蓝型油菜fad2基因为靶标的RNAi植物表达载体pCAMBIA3301-fad2i。以甘蓝型油菜Y14-1的带柄子叶作为转化受体,利用根癌农杆菌介导法,将fad2RNA干扰体基因导入甘蓝型油菜中,获得了PPT抗性植株。同时还探讨了影响Y14-1品种转化频率的几个要素,为甘蓝型油菜的高效转化提供参考依据。对获得的再生植株进行GUS组织化学染色检测和PCR检测,证明外源基因已整合到油菜基因组中。     

根癌农杆菌介导的植物遗传转化研究

介绍了农杆菌介导的植物原位转基因方法发展状况、技术环节以及在转化机制上的研究结果,并对存在的问题以及应用前景进行了讨论。     

根癌农杆菌介导转化抗虫基因获得转基因烟草

将抗虫ＰＩ基因构建到ｐＩＧ１２１Ｈｍ质粒的Ｔ－ＤＮＡ上，利用农杆菌ＬＢＡ４４０４介导转化烟草，获再生植株。经ＧＵＳ检测和Ｄｏｔ ｂｌｏｔ分析，证实外源基因已插入植物细胞基因组中，再生植株的转化率为６４．３％。     

根癌农杆菌介导的芪合酶基因转化烟草遗传体系的优化

【目的】研究根癌农杆菌介导的芪合酶基因转化烟草遗传体系的优化条件。【方法】以"中烟99"叶片为受体,采用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens,GV3101)介导法,将芪合酶基因导入烟草基因组,并对其遗传体系进行了优化,对筛选获得的转基因烟草植株进行检测。【结果】根癌农杆菌介导的芪合酶基因遗传转化的最佳条件为:将预培养2 d的烟草外植体,用稀释10倍的GV3101菌株菌液(OD600=0.6)浸染8 min后,共培养3 d,然后转入含卡那霉素(Km)50 mg/L和羧苄青霉素(Cb)500 mg/L的筛选分化培养基上诱导分化,待抗性芽长到2~3 cm后,转入含Km 50 mg/L和Cb 500 mg/L的筛选生根培养基上进行筛选,在以上最佳遗传转化条件下,初步筛选到54株转化体,经PCR和RT-PCR检测获得25株转化烟草植株。【结论】经卡那霉素筛选、PCR、RT-PCR检测后,初步证明芪合酶基因已被整合到烟草基因组中,并可以正常转录。     

油菜遗传转化体系中卡那霉素浓度的筛选及抑菌剂的选择

利用根癌农杆菌(Agribacteriumtumefaciens)介导的下胚轴转化方法,将一抗病基因转化甘蓝型油菜.在遗传转化体系的建立过程中进行了卡那霉素(Km)浓度的筛选及抑菌剂的选择,以确定合适的选择压力及适宜的杀菌剂.试验结果表明:选择培养基中附加25 mg/L Km较适宜;抗性苗筛选过程中羧苄青霉素(Cb)对芽苗分化影响较小,且在500 mg/L时能够很好的抑制农杆菌的过度生长.生根培养基中添加头孢霉素(Cef)和Cb对根分化的影响没有明显差异.     

农杆菌介导的菜心遗传转化体系的建立

以建立的菜心高频再生体系为基础,利用GU S染色组织分析法研究了根癌农杆菌菌株、乙酰丁香酮(A S)、预培养时间、浸染时间和共培养时间等因素对菜心((B rassica camp estris L.var.p arach inesis)子叶遗传转化的影响,探讨了适宜菜心转化的卡那霉素与抑菌抗生素使用浓度。结果表明,农杆菌菌株AGL 0对菜心的浸染能力最强,添加100μm o l/L的乙酰丁香酮有利于菜心转化;子叶外植体预培养2 d后浸染(菌液浓度OD600值为0.8)15m in,共培养2 d,然后转移到含15 m g/L卡那霉素和100 m g/L T icarc illin的筛选培养基上,进行转化植株的再生,植株再生率及外植体GU S阳性率均较高,是较优的转化条件;本试验共获得8株转化植株,转化率达2.44%,经PCR分析和Sou thern杂交检测表明,GU S基因已整合进入菜心基因组。     

转pepc基因油菜及其光合生理表现

采用下胚轴侵染法和花序浸染法将玉米C₄型pepc光合基因导入到甘蓝型油菜中,对转基因植株进行PCR鉴定并测定磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）活性及其相关光合生理指标。结果表明,2种转基因方法均能将玉米C₄型pepc基因导入油菜中。转pepc基因油菜的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）平均活性比原种提高17倍左右,净光合速率（P_n）比原种提高15.5%,胞间CO₂摩尔分数（C_i）比原种降低35%。表明pepc基因在转基因油菜中得到高效表达。     

Production of Transgenic Tall Fescue Plants with Enhanced Stress Tolerances by Agrobacterium tumefaciens-Mediated Transformation

In order to improve stress tolerances of turf-type tall fescue （Festuca arundinacea Schreb.）, Agrobacterium tumefaciens strain EHA105 carrying plasmid pCMD containing stress tolerance-related CBF1 gene from Arabidopsis thaliana was used to transform mature seeds-derived embryogenic calli of four cultivars. A total of 112 transgenic plants were regenerated from 32 independent lines and verified by histochemical detection of GUS activity, PCR assay and Southern hybridization analysis. The transformation frequency ranged from 0.92 to 2.87% with apparent differences among the cultivars. Stress tolerances of transgenic plants were enhanced, which was shown by the facts that transgenic plants had distinct growth superiority and significantly higher survival rate than non-transformed ones under high salinity and high osmosis stresses, and that relative electronic conductivity of in vitro leaves treated with low and high temoeratures, dehvdration and high salinity stresses was 25-30% lower in transgenic plants than in control plants.In addition,it was observed that growth of transgenic plants was inhibited due to constitutive overexpression of CBF1 gene under normal environmental conditions.     

人骨形成蛋白3基因cDNA部分序列的RT-PCR克隆

针对人骨形成蛋白 3基因的 c DNA序列设计引物 ,通过反转录 PCR技术 ,从人骨纤维肉瘤组织中扩增出目的片段。从胶中回收目的片段 ,将其与 p MD18- T载体连接 ,转化大肠杆菌 DH 5α后 ,经 H ind 酶切鉴定 ,进行测序。结果显示所得到的片段大小为 84 5 bp,与所设计的序列同源性为 10 0 % ,说明已经成功地扩增、克隆了人骨形成蛋白 3(h BMP- 3)基因 c DNA的大部分序列。     

人类HBxAg蛋白反式激活基因5的原核表达及其蛋白纯化

为了更深入研究XTP5蛋白(也称人类次要组织相容性抗原(mHA-8))的生物学功能,以HepG2细胞总RNA为模板、应用RT-PCR技术获得XTP5基因,再利用基因工程技术对其进行克隆和原核重组表达载体构建和诱导表达,成功克隆XTP5基因,并成功构建原核重组表达空载体pET-32a(+)-XTP5;阳性重组质粒转化大肠杆菌E.coliBL21后,在37℃经终浓度1 mmoL/L IPTG诱导5 h后,受体菌大量表达76.88 ku XTP5重组蛋白;West-ern-blot证实宿主菌表达的蛋白特异性好;肝素亲和层析柱纯化表达产物XTP5蛋白效果良好。结果表明,成功克隆了人类XTP5基因,并获得纯度较高的融合蛋白XTP5。