提高外源基因在转基因植物中表达效率的途径

利用转基因技术获得具有目的性状的转基因植株,是进行作物品种改良的有效方式.但基因沉默等现象降低了外源基因在转基因植物中的表达效率.从外源基因的DNA修饰水平、翻译后蛋白的定位、以及转基因方式等方面综述了国内外植物基因工程中的相关研究;分析了外源基因表达效率低的原因;提出了克服基因沉默并实现外源基因高效表达的途径.     

基因枪法转移反义油酸脱饱和酶基因获得转基因油菜

以油菜子叶柄作为轰击受体材料，利用基因枪转化方法，将反义的油酸脱饱和酶基因（Fad2）导入油菜，获得了抗潮酶素的再生苗。对所得到的再生苗进行多种分子生物学检测，证明外源基因已整合到油菜基因组中。     

转基因阿尔巴斯白绒山羊外源DsRed基因拷贝数与外源基因表达的关系

转基因动物的外源基因通过使用体细胞克隆与胚胎移植的方法将表达载体转入细胞后获得,大多以随机整合的形式存在于受体动物的基因组中,而转基因动物中外源基因的整合拷贝数是影响外源基因表达水平及遗传稳定性的重要因素之一,作为转基因动物遗传稳定性的鉴定指标,获得存活的转基因动物后便有必要对其外源基因拷贝数进行检测.为了研究转基因阿尔巴斯白绒山羊(Capra hircus)基因组内外源海葵红色荧光蛋白(red fluorescence protein from Discosoma sp.,DsRed)基因的拷贝数与其表达量之间是否存在一定的联系,本研究采用较鉴定外源基因拷贝数的传统方法DNA印迹杂交(Southern blot)更为高效率、高灵敏度、高准确性的绝对定量qRT-PCR法检测了6只转基因白绒山羊外源DsRed基因表达框中3个不同片段的拷贝数.结果表明,外源基因3个片段的拷贝数分别为巨细胞病毒(Cytomealovirus,CMV)启动子:2.80±0.38～13.68±0.16;DsRed基因:1.34±0.04～11.84±0.02;CMV启动子与DsRed连接处:1.58±0.04～19.22±0.38.通过qRT-PCR中相对定量的方法检测了6只转基因白绒山羊外源DsRed基因mRNA表达量,将其与外源基因中3个不同片段的拷贝数数据分别使用SPSS软件进行相关性分析后,相关性系数P值的结果为:CMV启动子为P=0.763;DsRed基因为P=0.665;CMV启动子与DsRed连接处为P=0.803,3组P值均大于0.05,无显著性相关.上述结果表明,在所检测的6只转基因阿尔巴斯白绒山羊中外源CMV启动子启动的DsRed基因的表达量与其在转基因白绒山羊基因组内的拷贝数在0.05的水平没有显著相关性.另外验证了绝对定量qRT-PCR法在大型转基因家畜的外源基因拷贝数的研究中的可靠性:其重复性良好,误差可控,可以成为检测转基因动物外源基因拷贝数的首选方法.     

转基因植物的生态安全性风险

转基因植物的应用在对农业生产带来重大变革的同时,其安全性风险备受关注。本文重点论述了转基因植物的生态安全性风险,即转基因植物的使用带来的直接或间接的生态影响,包括：目标害虫对转基因植物的抗性,转基因植物对非目标害虫的毒性及其对寄主嗜好性、有益生物及天敌的安全性、生物多样性及生态系统结构的影响;基因漂移及杂草化问题及应用转基因作物后植保费用的变更等。针对这些关键问题,定量风险评估和制定风险预防与治理策略具有重要意义。     

利用微滴数字PCR分析转基因生物外源基因拷贝数

微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)是一种基于泊松分布原理的核酸分子绝对定量技术,在核酸分子的绝对计数/定量领域具有极大的应用潜力。本研究基于ddPCR平台,以转基因水稻(Oryza sativa)T1c-19和转人乳铁蛋白基因基因山羊(Capra hircus)134为例,建立了转基因生物(genetically modified organisms,GMOs)外源基因拷贝数分析方法,并比较了其与传统的实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)和Southern blot方法的准确性。实验数据表明,T1c-19的杀虫晶体蛋白基因(insecticidal crystal protein,Cry1C*)在qRT-PCR和ddPCR测定结果比较一致,约为2拷贝,但已报道的Southern blot分析结果为1拷贝;ddPCR对bar基因的分析结果高于qRT-PCR,分别为2.09拷贝和1.51拷贝。转人乳铁蛋白基因(human lactoferrin,HLF)山羊134在qRT-PCR和ddPCR的分析结果基本一致,均测得含有1拷贝的HLF基因。研究结果表明,微滴数字PCR方法是一种经济、快速和准确的外源基因拷贝数分析新方法,灵敏度和准确性高,将会在拷贝数分析中广泛应用。     

我国转基因抗除草剂水稻的生态风险与控制

转基因抗除草剂水稻(Oryza sativa)的生态风险备受业界和公众关注。探讨其生态风险大小和收益多少,对于防范风险、明辨是非、权衡利弊、科学决策具有重要参考价值。以往研究注重单项风险分析,主要采用模拟条件分析,风险和效益的对比少、全局和集成分析不足。本文较全面地分析了转基因抗除草剂水稻的生态风险和收益,提出了控制生态风险的技术措施,对于促进我国转基因抗除草剂水稻的健康稳步发展具有现实意义。     

高产双低杂交油菜长油2号

审定名称：2007年10月四川省审定,定名“长油2号” 品种来源：[9501A（B）×CY18X]隐性核不育两系双低杂交油菜新品种 特征特性：长油2号属甘蓝型中熟双低杂交油菜品种,全生育期223天。株高221．9cm,幼苗生长半直立,长势中等,叶色淡绿,茎、叶皆具蜡粉,分枝部位中等,匀生分枝,单株有效分枝16．4个;平均单株有效角果590．3个,每角粒数15．01粒,平均千粒重3．56g。籽粒呈圆形,黑褐色,粒大饱满,皮薄,含油量高,     

转基因油菜生产的农业环境安全

根据转基因油菜的研究和环境释放现状,对我国转基因油菜可能存在的农业环境安全性问题进行风险分析,认为中国转基因油菜的基因扩散风险高于其他作物,对农业环境安全带来的隐患不容忽视。     

中国转基因油菜的环境安全性分析

根据中国转基因油菜研究和环境释放的现状，对中国环境条件下转基因油菜的生存竞争能力、基因扩散风险以及对生物多样性影响等环境安全问题进行了分析。分析认为，中国是许多十字花科植物进化起源中心和生物多样性中心，生态环境类型复杂；转基因油菜的外源基因可以通过花粉向油菜（Brassica napus）、白菜（B．rapa）和芥菜（B．juncea）类植物扩散；中国转基因油菜的基因扩散风险高于其它作物．存中国，油菜的转基因技术相当成熟，油菜的转基因实验频次很高，涉及的基因种类繁多，进口的转基因油菜数量巨大，隐患不容忽视。在中国，转基因油菜的安全性管理和研究相当薄弱，检测和监测手段无法满足安全管理需求，这一现状必将阻碍中国转基困油菜的产业化进程，并对中国环境安全带来隐患。作者提出，加强转基因油菜的环境安全意识，加强中国转基冈油菜的安全管理及其措施的落实，加强转基因油菜检测和监测等技术平台的建设。     

转Barnase基因无籽植物的研究

种子败育的无籽瓜果具有较强的市场竞争力和可观的经济价值.来源于解淀粉芽胞杆菌(Bacillus A myloliquefaciens)的Barnase基因编码12kD的胞外小分子核糖核酸酶(RNAase).在缺乏其天然抑制物Barstar的情况下,单独表达Barnase通常会造成宿主细胞的死亡.本研究用油菜(Brassica napus)种子特异启动子Napin调控Barnase基因,构建T-DNA表达载体,并用叶盘转化法转化烟草(Nicotiana benthamiana),获得55株转基因植株.随机抽取10株对其花器官进行形态学分析,并比较转基因植株和非转基因植株在不同发育时期花器官的形态学变化,发现转基因植株和非转基因植株在授粉前的花器官形态没有明显差异,但是受精以后转基因植株花瓣逐渐枯萎,不能正常发育形成种子,而非转基因植株能够正常形成种子.为了进一步了解转基因烟草种子败育的原因,将转基因植株和非转基因植株正反杂交,均不能正常结籽,表明转基因烟草的种子败育不是由自交不亲和性引起的.将转基因植株和非转基因植株花粉分别使用亚历山大染液染色,显微观察花粉的大小、形状和色泽,发现转基因花粉和非转基因花粉无明显差别,转基因植株和非转基因植株均能产生具有正常授粉活性的花粉.以上研究表明,使用种子特异性启动子驱动Barnase基因表达,外源基因不会通过花粉渗漏表达.本研究成功获得了Barnase基因在种子中特异表达的无籽转基因烟草,该研究为无籽植物的研制提供了一种全新的模式和思路.     

小油桐外植体的KN1基因遗传转化及其超量表达的转基因植株

本研究采用农杆菌介导法将KN1基因遗传转化小油桐,并获得了转基因植株。在研究中分析了农杆菌菌液菌液的浓度、侵染时间和外植体的大小对遗传转化效率的影响以及KN1基因超量表达对转基因植株再生的影响。研究结果表明：以苗龄15d左右的小油桐无菌苗子叶为外植体,农杆菌菌液浓度OD600为0.6～0.8时,侵染8min,外植体大小为（0.8×0.8）～（1.0×1.0）mm时,遗传转化效果最好;对抗性芽及再生植株进行GUS及PCR检测结果表明,KN1基因已经整合到小油桐植物基因组中。KN1基因的超量表达可提高小油桐再生芽分化,影响转化芽及植株的外观形态及叶片的表型,包括芽及植株矮小,茎杆粗壮;叶片缩小,边缘分裂,对称性丧失,无子叶柄等。     

抗青枯病转群体感应猝灭基因烟草的培育

利用具有猝灭青枯菌群体感应信号分子功能的aac基因构建高效植物表达载体,通过农杆菌介导的方法转化烟草,获得了卡那霉素抗性植株57株。经PCR及RT-PCR检测,筛选得到30株阳性转基因再生苗,并证实了目的基因已经整合到烟草基因组中,且在转录水平上得到表达。转基因植株苗期抗青枯病试验表明,16天后转基因烟草较对照植株病情指数降低了51,相对病情指数为56.5％。     

鄂尔多斯—榆林地区景观生态风险评价及其驱动因子分析

[目的]对鄂尔多斯—榆林地区(简称“鄂榆地区”)景观生态风险评价及驱动因子进行分析,为该区生态环境治理、修复以及生态安全格局的构建提供科学依据。[方法]以2000,2010和2020年的鄂榆地区土地利用数据为基础,运用ArcGIS 10.2和Fragstats 4.2等软件,基于景观干扰度和景观脆弱度构建景观生态风险评价模型,从时间和空间上对鄂榆地区景观生态风险进行动态分析,并利用地理探测器方法探测其变化的驱动因素。[结果](1)草地、耕地和未利用地为鄂榆地区主要的土地利用类型,其中在2010—2020年土地利用变化强度和速度最为活跃,草地为主要的转入、转出类型;(2)在2000—2010年,中生态风险、较高生态风险和高生态风险地区面积呈现扩张趋势,低生态风险、较低生态风险呈现收缩趋势。在2010—2020年,中生态风险、较高生态风险和高生态风险低面积呈现收缩趋势,而低生态风险和较低生态风险地区呈现扩张趋势;(3)2000,2010和2020年的全局自相关分析Moran’s I指数均大于0.8,在空间分布上呈显著正相关,绝大多数生态风险单元呈现高—高和低—低分布,少数的生态风险单元在高...     

转Bt cry1Ah基因抗虫玉米的获得及其遗传稳定性分析

Btcry1Ah基因是从国内苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）分离株BT8中克隆鉴定的新型杀虫蛋白基因。研究利用该基因构建了植物表达载体pHUAh,用基因枪法转化玉米杂交组合Q31×Z31的胚性愈伤组织,得到13株阳性转基因玉米（Zea mays L.）植株。通过生物活性分析筛选得到了2个高抗转基因事件B1-1和B1-7,对其T1～T5代转基因植株进行了5代跟踪检测,结果表明,外源基因在玉米植株可以稳定表达,并且可以逐代稳定遗传。利用ELISA对不同转化事件以及同一转化事件不同组织部位的Cry1Ah蛋白的表达量进行分析,发现该基因在不同转化事件之间以及同一转化事件不同组织部位表达量都存在差异。对T2～T5代转基因植株田间虫测结果显示,转基因玉米对亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）具有显著的抗性,且逐代稳定遗传。B1-1和B1-7有望成为Bt抗虫玉米育种工作的备选材料。     

转柽柳金属硫蛋白基因（MT1）烟草的获得及对重金属镉的抗性分析

将柽柳（Tamarix. sp）金属硫蛋白基因（MT1）插入到植物表达载体pBI121，利用农杆菌（Agrobactrium tumefaciens）介导法将MT1导入烟草基因组。对转基因T1植株的卡那霉素抗性分析表明，多数转基因植株后代表现为3:1的分离比例，只有少数转基因植株的抗性分离表现为15:1或不符合孟德尔遗传的分离比例。说明整合到烟草基因组的外源基因多为单拷贝基因，也有少数为多拷贝基因。对具有卡那霉素抗性的转基因植株进行PCR-Southern检测和Northern杂交分析表明，外源MT1基因已整合到烟草基因组，并且得到了正确表达。转基因植株对重金属镉的抗性比对照显著提高，表现为转基因植株的株高和鲜重均明显优于非转基因株系。     

组成型表达转植酸酶基因(phyA2)玉米的获得

本研究将黑曲霉（Aspergullus nige）来源的植酸酶基因（phyA2）,通过基因枪法转化玉米（Zea maysL.）幼胚,获得再生苗。RT-PCR和Western blot检测证明,植酸酶基因已经整合到玉米基因组中并在玉米中稳定表达和遗传。转基因植株根组织的酶活性测定及利用植酸作为唯一磷源的培养基生长实验证明,植酸酶基因在植株根组织表达并能够分泌到根围高效利用植酸磷。