用于ELISA的牛白血病病毒抗原的制备

人工感染牛白血病病毒(BLV)的绵羊血清IgG与溴化氰活化的Sepharose4B偶联,制成免疫吸附柱Ⅰ:用兔抗牛血清IgG与之偶联,制成免疫吸附柱Ⅱ.将BLV粗提抗原经柱Ⅰ和柱Ⅱ亲和层析后获得无色透明抗原。该抗经AGID试验表明具有gp和P抗原活性,回收率分别为38.8％和51.8％;经SDS-PAGE分析表明,含有5种蛋白组分,分子量分别为15、24、64、70和80K道尔顿;经薄层扫描,测得5种组成的百分含量之和为72.08。将提纯抗原同提纯各阶段不同纯度的抗原同时进行ELISA测定,结果以提纯抗原最理想,本底很浅,工作浓度仅为5μg/ml。     

鸡成骨髓细胞增多症病毒蛋白的提取及其抗原活性的检测

以差异离心-蔗糖密度梯度离心法浓缩和纯化鸡成骨髓细胞增多症病毒(AMV)。纯化的病毒主要存在于35％蔗糖梯度内,经琼扩反应检测,其抗原效价为1:32。纯化的AMV经酚-SDS处理后,经SDS-PAGE分离,出现四条蛋白带(分子量为12,000～40,000)。应用SR-RSV抗血清,以SDS-PAGE-琼扩协同法检测,其中三条蛋白带(分子量约为12,000,24,000和30,000)具有共同性抗原活性。     

地方流行性牛白血病患畜的色氨酸代谢

经荧光法测定,琼扩阳性牛、羊血清和牛奶中总 Trp 含量明显高于琼扩阴性对照组(p<0.001);琼扩阳性羊血清游离型 Trp 含量高于琼扩阴性对照组(p<0.05);牛血清中游离型 Trp 的含量.琼扩阳性与阴性组间无差异.     

禽呼肠病毒琼扩抗原和血清的制备

以禽呼肠病毒S1133毒株尿囊腔接种10日龄无特定病原体(SPF)鸡胚,无菌收集24 h～120 h的死胚尿囊液,加1 mL/L的甲醛灭活,浓缩制得琼扩抗原;用该抗原制成灭活苗两次免疫SPF鸡,无菌采血分离制备阳性血清;选用SPF鸡无菌采血分离制备阴性血清.经过效价测定制备16单位琼扩抗原,8单位阳性血清;取免后的SPF鸡血样4个20～2-5稀释分别与1单位～8单位琼扩抗原做琼扩试验,确定了应该用4单位或8单位琼扩抗原做工作抗原;并以血清中和试验为参照证明琼扩试验在血清抗体监测中的可行性.本研究成功制备了禽呼肠病毒琼扩抗原与血清,为用琼扩试验定量检测禽呼肠病毒感染禽和疫苗免疫禽的抗体奠定了基础.     

马传贫病毒ELISA抗原有效成份分析及免疫学活性测定的研究

对21批马传贫病毒ELISA抗原样品,以SDS-PAGE进行组分分析及分子量测定表明,虽抗原批次不同,组分数亦不完全相同,但分子量范围却均在13600～110500道尔顿之间。通过酶联免疫电传移印渍技术(EITB)确定抗原的有效成份证明,有免疫学活性的蛋白主要是28600道尔顿组分,其次是13600道尔顿的组分。而马传贫病毒ELISA抗原免疫学活性与28600道尔顿组分的相对百分含量显著相关(P<0.01)。用特异的糖蛋白染色技术分析糖蛋白的组分表明,分子量为78000～8100及57000～5900道尔顿的两个组分呈阳性反应,但在EITB中没有表现出明显的免疫学活性。     

牛白血病病毒实验感染的早期表现

以自然患淋巴白血病的病牛自细胞感染实验犊牛为材料,阐明了牛白血病病毒感染的早期表现,证明了动物体内存在分子量为24000道尔顿的牛自血病病毒主要内蛋白(P24),     

抗禽白血病病毒结构蛋白P~(27)群特异性抗体的制备

在分析禽成骨髓细胞性白血病病毒(AMV)结构蛋白成分的基础上,用电泳方法提取的分子量27kd的结构蛋白(P~(27))高免家兔,制备了兔抗AMV P~(27)群特异性抗体(琼扩效价达1:32).经蛋白印迹和酶联免疫试验证明,该抗体只对P~(27)出现反应。用澳大利亚抗P~(27)群特异性抗体做比较试验证明.我们制备的P~(27)抗体优于澳方P~(27)抗体.     

牛白血病病毒env(gp51)基因的克隆和原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

从持续感染牛白血病病毒（BLV）的羊胎肾细胞（FLK-BLV）中提取前病毒DNA,用PCR方法扩增编码牛白血病病毒gp51蛋白的env（gp51）基因,序列测定结果表明扩增片段全长828 bp。将扩增基因插入原核表达载体pET-32a构建pET-32a-gp51重组质粒,转化BL21（DE3）进行诱导表达,SDS-PAGE电泳结果表明重组融合蛋白大小约为43 000,Western-blot结果表明重组表达蛋白具有免疫反应性。以纯化的重组蛋白gp51作为抗原,建立检测BLV抗体的间接ELISA诊断方法。结果表明,抗原gp51的最佳包被浓度为2.19μg.mL^-1,血清的最佳稀释倍数为1∶80,阳性判定标准确定为样品OD450 nm大于0.451。用该方法对12份参考血清进行检测,准确率为91.67%。     

牛白血病病毒单克隆抗体的研究 Ⅰ.牛白血病病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

用持续感染BLV的羊胎肾细胞(BLV/FLK)制备的BLV抗原免疫2月龄BALB/c小鼠,取血清抗体阳性的小鼠细胞与SP_(2/0)小鼠骨髓瘤细胞融合,以PPA-ELISA为抗体检测方法,通过有限稀释法,克隆出E_4和C_9两株分泌抗BLV-gp抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞,其核内染色体数均为97～107。杂交瘤细胞诱生BALB/C小鼠腹水的酶标抗体滴度可达20000倍,经琼扩试验,两株分泌的MAB都仅与兔抗鼠IgG_3标准血清呈现明显而均一的沉淀线,经蛋白质渍印试验和斑点试验,两株的MAB也都只与BLV-gp抗原发生特异性反应,经过连续传代和冻存,两株细胞的抗体滴度稳定。     

应用免疫转印技术分析副结核分枝杆菌胞浆蛋白的抗原性

应用免疫转印技术,着重对副结核菌P_(18)株胞浆蛋白抗原性进行了分析,并比较了不同菌株P_(18)、P_(10)Tcps、316F、2E、Ⅱ(国际标准株)、P_3、(吉林地方株)和8302(延边地区分离株)胞浆蛋白以及P_(18)、P_(10)株培养滤液中蛋白成份的抗原性;另外,对不同感染牛对副结核菌胞浆蛋白各组分的抗体应答反应性进行了比较。结果表明,P18株胞浆蛋白中的66.2～92.5、60.3、53.7、51.3、25.9～40.7、25.4和24.6Kd的蛋白质分子对S_6号副结核阳性血清发生反应,其中以24.6Kd蛋白质分子的抗原性最强。不同菌株的胞浆蛋白和培养滤液蛋白具有相同的抗原性。不同感染牛对副结核菌胞浆蛋白抗原各组分的抗体应答反应不同。     

新城疫病毒F蛋白抗原表位串联基因的构建及其原核表达

用自行设计的3对引物,通过RT-PCR从接毒的SPF鸡胚的尿囊液中克隆了新城疫病毒F基因3段抗原表位区段,大小分别为81、108、105bp。应用添加互补性酶切位点的基因工程方法,将3段抗原表位基因片段拼接成多表位串联基因,大小为306bp。将此基因片段插入含组氨酸(His)基因的质粒pET-32-a中,构建了重组质粒pET-32-a-F306。经诱导表达,获得相对分子质量约为31000的融合蛋白,其中F蛋白抗原表位串联基因片段表达产物约为11000。经亲和层析,获得纯化His-F306融合蛋白,进一步用该蛋白免疫小鼠,制备了鼠源抗新城疫病毒F蛋白抗体。经过琼扩、ELISA及Western-blot检测,表明该融合蛋白中的抗原表位串联基因所表达的蛋白具有良好的抗原性。     

鸡白血病病毒群特异性抗原的抗体固相放射免疫分析及应用

固相放射免疫分析(SPRIA)试验的各成分的适宜条件是:固相载体抗体浓度为40μg/ml;~(125)Ⅰ-兔抗 AMVgs 的 IgG 为200万 cpm/ml;被检样品1:5稀释;对照 gs抗原为0.2μg/ml。可检出的最小抗原量为0.05μg/ml.检查了 SPF 雏鸡、NDV 等抗原以及 gs 抗原和 AMV 血浆毒等样品,证明 SPRIA 是特异的.SPRIA 与琼扩方法检查现地雏鸡的符合率为84.6%.     

11种牛分枝杆菌抗原在牛结核病诊断中的初步评价

为筛选及评价用于牛结核病诊断的抗原,本试验将CFP-10、ESAT-6、TB10.4、TB27.4、MPT51、MPT63、MPT64、MPB70、MPB83、Rv3872和Ag85B共11种牛分枝杆菌抗原分别作为包被抗原建立间接ELISA方法,比较其对牛结核病的检出率;同时利用豚鼠和牛的皮试试验评价重组蛋白作为皮试试验刺激原的潜力。此外,将重组蛋白分别刺激结核病阳性牛和阴性牛的抗凝血24h,检测血浆中的IFN-γ水平,评价各重组蛋白作为IFN-γ释放试验刺激原的潜力。结果显示,不同重组蛋白对结核病阳性血清的反应活性不一,MPB70总检出率最高,为59.7%;其次是Ag85B、ESAT-6和MPB83,检出率均在45%以上;MPT51的检出率最低,仅为2.2%。豚鼠和牛皮试试验均显示,单个重组蛋白作为刺激原难以产生令人满意的迟发型过敏反应(delayed type hypersensitivity,DTH),而TB10.4、TB27.4、MPT64、MPT63或Rv3872作为补充抗原,分别与CFP-10或ESAT-6混合,均可特异性地刺激结核病阳性牛产生较强的DTH反应,且与PPD-B无显著差异(P0.05)。重组蛋白CFP-10、ESAT-6、TB10.4和MPT51均能刺激结核病牛全血释放一定的IFN-γ,其中CFP-10、CFP-10-ESAT-6串联蛋白和MPT51刺激结核病阳性牛全血释放的IFN-γ显著高于阴性牛(P0.05)。因此,这11种牛分枝杆菌抗原并不适合单独用于牛结核病的血清学诊断、皮试试验或IFN-γ释放试验,但以CFP-10和ESAT-6为核心,TB10.4、TB27.4、MPT64、MPT63、Rv3872或MPT51作为其补充抗原,均能提高检测敏感性,有作为皮试试验和IFN-γ释放试验特异性刺激原用于牛结核病诊断的潜力。     

家兔葡葡球菌病血清诊断的研究 Ⅱ.免疫扩散抗原活性组分的测定

乙醇抽提抗原经 SDS-PAGE 测定,分子量约为12kd;扫描图与 SDS-PAGE 蛋白区带位置一致;该组分具有抗原活性.     

牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白表位鉴定

为鉴定牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)g D蛋白抗原表位,本研究利用p ET-30a原核表达系统表达、纯化了重组g D蛋白,采用超速离心纯化的IBRV免疫BALB/c小鼠,取脾淋巴细胞与SP2/0细胞进行融合,以重组g D蛋白作为包被抗原,通过间接ELISA筛选出一株稳定分泌抗g D蛋白的MAb杂交瘤细胞株(1G3)。间接免疫荧光结果表明:MAb与IBRV呈阳性反应,中和试验测定其腹水中和效价为1∶32。利用肽扫描技术原核表达GST融合短肽对MAb 1G3识别的抗原表位进行筛选鉴定,结果表明:该MAb识别的抗原表位为259EESKGYE265。蛋白序列分析表明该抗原表位在IBRV各分离株及牛疱疹病毒5型(Bo HV-5)中均保守。本研究为IBRV的糖蛋白g D的结构和免疫学特性及IBRV致病性的深入研究奠定了基础。     

山羊胎肺细胞增殖山羊关节炎：脑炎病毒制备琼扩抗原的试验

试图用山羊胎肺细胞增殖山羊关节炎－脑炎病毒获得成功，将含毒培养液用ＰＥＧ沉淀制成琼扩抗原，经与羔羊滑膜细胞增残ＣＡＥＶ制备的抗原比较，主要蛋白成分和性能一致，具有特异性强，稳定性好等特点。结果表明，用山羊胎肺细胞增殖ＣＡＥＶ制备琼扩抗原是一种可供选择的有效方法。     

牛白血病病毒反转录酶的纯化及结构的研究

将FLK/BLV培养上清经差速和梯度离心提纯的牛白血病病毒(BLV).经NP-40裂解后.分别采用Poly(A)·oligo(dT)_(12_18_)纤维素.Poly(G)-DEAE-纤维素和Poly(G)-磷酸纤维素等亲和层析法纯化了BLV反转录酶(RT)及前体.酶活性回收率分别为16.6％、3.34％和38.6％。经Cs-930凝胶扫描分析,酶制剂中RT的相对百分含量分别为53.9％、67.5％.实验表明,Poly(G)-磷酸纤维素层析是提纯BLV-RT的有效方法;用DEAE-纤维素和肝素-琼脂糖层析法不能提纯BLV-RT.提纯的酶制剂经SDS-PAGE分析,测得RT分子量为69.6kd(P69.6).发现了酶的前体蛋白.其分子量为95kd(P95)同时还发现有一条分子置为15kd(P15)的多肽区带,推测为BLV该酸内切酶结构的一部分。     

副鸡禽杆菌荚膜多糖的提取及HPLC分析

为了研究副鸡禽杆菌的荚膜多糖的构成及生物学活性,本试验提取了B型副鸡禽杆菌的荚膜多糖,测定其含量,并分析单糖组分及分子量大小。用乙醇沉淀法在细菌培养液上清中提取了荚膜多糖,利用25%乙醇去核酸、苯酚抽提去蛋白,最后以苯酚-硫酸法测定其含量,高效液相色谱(HPLC)分析其组分及分子量大小。结果显示,每升菌液可以抽提得到荚膜多糖85mg,含量为59.6%,该多糖主要由L-鼠李糖、D-木糖、D-葡萄糖等单糖组成,总分子量约209Ku。     

大通县役用马血清总蛋白及蛋白组分含量的测定

对大通县青林乡32匹健康役用马的血清总蛋白及蛋白组分含量进行了测定。结果为:血清总蛋白69.30±3.41 g/L,白蛋白34.26±5.73 g/L,球蛋白35.04±4.92 g/L,白/球比值(A/G)0.98±0.47;血清蛋白质组分(%):A 39.85±0.15,a—球蛋白13.44±0.13,β—球蛋白24.63±0.14,γ—球蛋白22.08±0.41。均处于正常值范围内,公(骟)、母马组之间无显著的差异(P0.05)。     

以番鸭呼肠孤病毒σC表达蛋白为抗原的ELISA方法的建立

将鸭呼肠孤病毒小外壳σC蛋白编码基因克隆于原核表达载体pET32a上,经EcoRⅠ和SacⅠ双酶切鉴定及序列分析,得到重组质粒pET32a-σC,转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,经SDS-PAGE和westem-blotting分析,融合蛋白能够与番鸭呼肠孤病毒感染康复鸭血清发生特异反应;以0.15m mol/LIPTG诱导,5h后融合蛋白δC表达量可达高峰,分子量为50ku;融合蛋白纯化后作为包被抗原,建立了检测鸭血清中的呼肠孤病毒抗体的间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测方法,最佳包被浓度为51μg/ml;标准阳性血清的最适稀释倍数为1：40;用该方法对50份鸭血清样品进行检测,并与琼扩抗体检测法相比较,证明该ELISA方法具有良好的特异性和敏感性,该研究为今后鸭呼肠孤病毒的诊断试剂盒的研制奠定了基础。