烟草乙烯反应突变体的抗冷性及机理分析

为了深入研究乙烯在植物抵抗逆境胁迫中的作用,以烟草为模式植物,利用幼苗对外源乙烯的"三重反应",筛选得到了40多个乙烯不敏感突变体,其中多数突变体具有较强的抗冷性;从中选取4个突变体株系,对它们耐受低温胁迫的生理基础和作用机理进行了分析。结果表明,低温(0℃)胁迫下,烟草乙烯不敏感突变体的电解质渗透率显著低于野生型,而抗氧化酶活性(POD、SOD)以及过氧化氢酶(CAT)活性都高于野生型,说明突变体具有抵抗低温胁迫的优势生理基础。进一步研究发现,低温(0℃)胁迫下,烟草突变体中冷诱导基因Nt CBFs和Nt COR47呈现高水平表达,乙烯信号传导途径中下游基因ERFs的表达也发生显著变化。这些研究为烟草乙烯不敏感突变体株系具有较强的抗冷性提供了直接的分子证据。     

不同基因型玉米对乙烯利调控反应敏感性的差异

倒伏是玉米高产栽培中导致产量严重下降的关键性限制因素之一,应用植物生长调节剂乙烯利或复配剂改善玉米茎秆质量、提高抗倒能力,是解决玉米倒伏的有效途径。本研究以玉米杂交种农大108、鲁单981及其相应亲本许178、黄C、齐319和lx9801为材料,在拔节期叶面喷施200 mg L^-1乙烯利药液,研究了乙烯利对不同基因型玉米株型及其生理生化特征的影响。结果表明,乙烯利处理显著降低了农大108、鲁单981的株高和穗位高,特别是显著抑制了基部第1至6节间伸长;乙烯利处理显著提高了基部伸长节间中的苯丙氨酸解氨酶(PAL)和吲哚乙酸氧化酶(IAAO)活性,降低了基部伸长节间中生长素(IAA)和赤霉素(GA₄)含量,增加了脱落酸(ABA)的积累。乙烯利处理显著降低了亲本许178、黄C、齐319和lx9801的株高和穗位高,显著缩短了基部节间长度;乙烯利处理后显著提高了基部伸长节间PAL和IAAO活性,显著降低了节间IAA和GA₄含量,提高了脱落酸含量,降低了GA₄/ABA比值。结合植株性状和生理生化特征分析,杂交种对乙烯利调控反应敏感性差异是由其双亲对乙烯利反应差异造成的,表现在乙烯利处理父母本间株高、穗位高、PAL和IAAO活性以及内源激素含量变化上存在显著差异。     

编码荔枝乙烯受体(LcERS1)的cDNA基因的克隆与分析

利用RT -PCR和RACE方法获得了编码荔枝乙烯受体的cDNA序列 ,长度为 2 ,193bp ,该序列中包含一个ORF全长 1,84 8bp ,编码 6 15个氨基酸 ,推测的分子量为 6 8kD。由该序列推定的蛋白质氨基末端存在疏水区 ,羧基端存在组氨酸激酶区和GAF区。与拟南芥的五个乙烯受体比较 ,推定的荔枝乙烯受体的激酶区有乙烯受体所具有的 5个基序 (H ,N ,G1,F ,G2 )中的H和N基序 (motif) ,分别位于第4 2 3- 4 32和 5 32 - 5 4 3氨基酸 ,其保守序列H为 :MNHEMRTPM ;N为 :LMQTILNIMGNA。结构分析和功能预测表明 ,本研究获得的荔枝乙烯受体编码序列推定的氨基酸序列具有乙烯受体的典型特征 ,初步分析表明获得的荔枝cDNA序列包含了编码荔枝乙烯受体 ,LcERS1,的全长cDNA基因 (lcers1) ,GenBank登录号为AY311484。     

烟草烟碱转化株早期诱导鉴定的有效性研究

以白肋烟为材料研究了采用乙烯利处理对烟碱转化株进行早期鉴定的有效性以及取样时间和部位对鉴定效果的影响。结果表明,乙烯利处理早期鉴定的转化株包括了所有调制后自然形成的转化株,还可以鉴别出一些在正常晾制条件下不能有效鉴别的低转化株;早期测定的烟碱转化率一般高于烟叶自然晾制后的烟碱转化率,有利于提高鉴定的准确性和有效性。根据鉴定结果将非转化株、低转化株和高转化株分别自交留种,后代群体分别有8.6%,59.8%和100%的转化株,表明鉴定方法是有效的,且通过转化株的鉴别和清除可以对品种进行有效改良。对转化株的鉴定从苗期到开花前都可以进行,移栽后4~6周取样测定更利于大批量处理和检测。不同部位叶片都可用于早期诱导和鉴定,但下部叶诱导时间短,便于操作。     

mRNA差异显示技术在分离水稻基因中的应用

mRNA差异显示技术是分子生物学中分离克隆基因的有效技术。笔者叙述了mRNA差异显示技术的基本原理、存在的问题以及技术改进, 并主要阐述了该技术在分离水稻基因中的应用情况。     

mNRA差异显示技术在分离水稻基因中的应用

mNRA差异显示技术是分子生物学中分离g隆基因的有效技术.笔者叙述了mNRA差异显示技术的基本原理、存在的问题以及技术改进,并主要阐述了该技术在分离水稻基因中的应用情况.     

低钾胁迫下烟草根系差异表达基因的cDNA-AFLP分析

烟叶含钾量是评价优质烟叶重要品质指标,大量研究认为钾元素的吸收和积累是由植物基因型所控制,而在烟草转录水平上的低钾胁迫的应答机制方面,尚未见报道.本实验为鉴定烟草低钾胁迫响应基因,应用,cDNA-AFLP技术,对低钾胁迫下烟草NC89根系基因表达进行了mRNA指纹分析,通过240对引物组合的筛选,共得到324个差异表达转录衍生片段.对其中9个TDF进行了克隆、测序和序列分析.结果表明:其中7个TDF涉及逆境响应,氨基酸的转运与代谢,转录调控及钾吸收,2个TDF为功能未知.     

渗透胁迫下烟草叶片基因的差异表达研究

为了解干旱胁迫下烟草的抗旱机制,采用拟南芥基因芯片检测了PEG渗透胁迫（－1.2 MPa）48 h后烟草叶片中基因表达的变化。在31 182个基因微矩阵点中,有效差异表达（ratio值≥2或≤0.5）的基因为135个,上调50个,下调85个。其中包括一些具有防御功能的上调表达基因如两个普遍胁迫蛋白（USP）和与渗透调节物质海藻糖合成有关的基因ATTPS11及多个参与复制、转录和翻译等过程的基因MAPKK、bZIP、锌指蛋白、组蛋白His1-3、脱水响应DREB转录因子、WRKY转录因子家族、分子伴侣等,MAPKK具最大上调幅度,为3.94倍（序列号为At1g51660）。而参与光合作用的6个PSⅠ的光捕获复合体中lhca3和PSⅡ的光捕获复合体中核编码基因的lcb1、lcb2、lcb5、lcb6、lcb4.2的基因表达下调。还检测到38个未知基因,它们的差异表达可能跟渗透胁迫诱导有关,是我们下一步研究的重点。通过分析这些特异表达基因,揭示出一些潜在的生物学规律,为研究烟草逆境生理学提供了有价值的信息。     

灵发素(LFS)诱导烟草叶片愈伤组织的研究

[目的]研究LFS诱导烟草叶片愈伤组织的生物活性和使用浓度;[方法]以MS为基本培养基,添加不同浓度LFS配制成诱导培养基,以烟草幼叶切片作外植体,进行愈伤组织诱导;[结果]1)LFS 0.05～2.00 mg/L皆表现出诱导烟草叶片愈伤组织的生物活性;2)最适浓度为1.50 mg/L,1o d出愈率48％,20 d达100％.愈伤组织的褐化与板结程度轻微,每瓶平均鲜重产量为8.3g,而ck组只有1.7 g;[结论]LFS作为单一诱导剂添加于MS可以快速、优质、高效地获得烟草叶片愈伤组织.     

乙烯利诱导甘蔗ACC合成酶基因家族3成员在茎中表达与乙烯释放量和糖分积累的关系

ACC合酶(ACS)是高等植物乙烯生物合成途径中的限速酶。为了弄清楚ACS基因在甘蔗茎中的表达与乙烯释放量、蔗糖积累的关系,在克隆到甘蔗ACS基因3个成员(Sc-ACS1、Sc-ACS2和Sc-ACS3)的基础上,分别以它们作为探针,Northern杂交检验他们在茎中的时空表达。结果表明,甘蔗生长后期,ACS基因三个成员在茎中不同品种和节间持续表达,Sc-ACS1和Sc-ACS2表达维持较低水平,Sc-ACS3维持较高水平。乙烯利处理明显提高3个基因在茎的未成熟和正在成熟节间的表达,且Sc-ACS1和Sc-ACS2在未成熟节间的表达持续时间长达一个月,而Sc-ACS3在未成熟节间的较高水平表达可持续45 d。该结果与甘蔗节间尤其是未成熟和正在成熟节间的乙烯释放量增加以及糖分积累的效应基本一致。相关分析表明,GT17品种乙烯释放量与蔗糖分在处理后14 d和28 d分别极显著和显著负相关,但B1品种未达显著水平。     

两个棉纤维发育相关基因的克隆与特征分析

棉纤维发育突变体是克隆棉纤维发育关键基因和阐明其发育分子机理的优异资源。陆地棉李氏超短纤维突变体(Li₁li₁)是显性单基因突变体,表现为显性纯合体(Li₁Li₁)致死,显性杂合时(Li₁li₁)表型为茎秆扭曲、叶片卷曲和纤维短至6 mm,而隐性纯合体(li₁li₁)则表现为株型和纤维发育都正常。本文对开花后10 d的李氏纤维发育正常材料(li₁li₁)和超短纤维突变体(Li₁li₁)胚珠纤维混合体进行mRNA差异显示反转录PCR(DDRT-PCR)分析,获得2条在李氏纤维发育正常材料中上调表达的差异片段。测序及DNA序列的生物信息学分析表明该差异片段分别与编码谷氨酸脱羧酶和质子焦磷酸酶的基因有较高同源性。通过电子拼接,5¢RACE和全长cDNA序列验证,克隆了棉花的谷氨酸脱羧酶(GhGAD)和质子焦磷酸酶(GhVP1)基因全长cDNA, 进一步对其功能和染色体定位进行了初步分析。转录水平分析表明,这两个基因在棉花根、茎、叶和纤维中组成性表达,在棉纤维中优势表达。利用本实验室陆地棉遗传标准系TM-1和海岛棉海7124培育的含140个单株的BC₁作图群体,将GhGAD和 GhVP1分别定位在第12条染色体和第8条染色体。     

小麦TaVIP1家族基因克隆、分子特性及功能分析

植物VIP1蛋白(Vir E2 interacting protein 1)与农杆菌侵染植物后T-DNA在细胞内的转运有关,影响植物转化效率,但还未见有关小麦中VIP1基因研究的报道。本研究利用in silico技术从普通小麦中克隆了TaVIP1家族基因,该家族基因全部由4个外显子构成,编码产物相似性高,与拟南芥AtVIP1蛋白质序列相似性仅为50.7%~51.4%。Southern杂交结果表明,TaVIP1基因在小麦基因组中存在3个拷贝。根据小麦3个TaVIP1基因的差异序列设计特异引物,以四倍体小麦Langdon与中国春D组染色体代换系为材料进行PCR检测,结合生物信息学分析,将小麦3个TaVIP1基因分别定位在4AL、4BS和4DS染色体上。亚细胞定位分析表明,TaVIP1蛋白分布于细胞膜、细胞质和细胞核中。农杆菌转化烟草,过表达TaVIP1基因降低了烟草转化效率。小麦TaVIP1基因编码的氨基酸序列与拟南芥AtVIP1基因及烟草NtVIP1基因编码的氨基酸序列相似性很低,这可能是小麦农杆菌转化效率低的原因之一。     

TMV侵染烟草基因差异表达的cDNA-AFLP分析

以烤烟品种龙江925 [高抗烟草普通花叶病(TMV)]接种TMV的叶片为材料,选用240对引物组合的扩增, 获得约 9 500个转录基因片段, 经过克隆测序最终获得了12个诱导表达片段, 它们与核酸代谢、蛋白质合成与修饰、能量代谢、胁迫响应、细胞内运输、糖代谢等相关, 并利用荧光定量PCR分析一个诱导表达片段TIF2在0~72 h之间5个时间点(0、12、24、48和72 h)的基因差异表达, 证实了所获得的基因序列为真实诱导的表达序列。对此序列进行RACE, 最终获得全长cDNA序列, 全序列857 bp, 预测的编码区在101~613 bp之间, 共编码170个氨基酸。经Blastn、Blastp比对分析, 在烟草中没有获得其同源序列, 确定该基因是在烟草中发现的与抗TMV相关的新基因。     

茉莉酸甲酯对中国红豆杉细胞基因表达的mRNA差异显示研究

茉莉酸甲酯是一种环戊烷衍生物型植物激素,在植物次生代谢物质生物合成中起着重要作用。我们以中国红豆杉悬浮培养细胞为材料,设两组平行实验,一组为阴性对照组,一组以茉莉酸甲酯进行诱导,所得细胞利用mRNA差异显示技术进行分析,研究了茉莉酸甲酯对红豆杉细胞mRNA表达的差异,最终共获得34个差异表达片段。经二次扩增和单引物阴性对照实验及序列测定,共获得9个阳性差异表达片段。与GenBank数据库比对,结果表明其中2个片段与已知基因有较高的同源性,与欧洲赤松（Pinus sylvestris）cDNA克隆的同源性为88％,与南方红豆杉（Taxus mairei）18SrRNA基因的同源性为93％,其余7个差异表达片段与GenBank中所有基因的同源性都非常低,可能代表了红豆杉细胞中的受茉莉酸甲酯诱导的未知基因序列。     

Methods for Plant Differential Expressed Gene Cloning and Progress

The research of plant genome has been transferred from the structural genomics focusing on determining the complete sequences of the genome to the functional genomics focusing on elucidating the biological function of genes. Now cloning differential expressed genes is of prime interest in molecular biology. In the past ten years, some methods used for studying changes of gene expression in plants have been developed. The authors review the developments of techniques and studies for the plants related gene cloning in RNA level and expound their principles, technical routes, improved methods, advantages and defects. Moreover, their applications and prospects in plants related studies are discussed.     

表油菜素内酯对提高烟草种子活力机理的研究

本研究表明,用表油菜素内酯(24—Epibrassinolide,简称BR)0.05ppm或0.01ppm浸泡烟草种子24小时后,种子的电导率和渗出液紫外光OD值降低,吸氧量增加,乙烯释放速度和释放量增大;烟草种子萌发时间缩短,其发芽率、萌发系数和发芽势分别高于对照10%、30%和15%以上;幼苗植株干重及根长和根干重明显地增加;幼苗生长势及其抗逆性增强.     

烟草对花叶病毒诱导抗性及其遗传传递效应的研究

采用化学诱导的方法进行烟草对花叶病毒的诱导抗性的试验研究。发现用Ｓ３０和Ｌ１两种诱抗剂均能在烤烟，白肋烟和心叶烟上诱导出对ＴＭＶ的抗性。诱抗效应达１９．１％－３５．６％。此外，诱抗后心叶烟，白肋烟还表现出枯斑反应提前和枯斑缩小等抗性增强反应。将诱抗材料子代接种ＴＭＶ，证明有诱抗性传递现象，其传递效应为２５．２％－４２．６％。经连续三代用Ｌ１诱抗剂在同一烤烟品种（Ｇ１４０）的苗期和花期分别诱导，其子     

非生物胁迫诱导的GmMYB的克隆与表达分析

本研究室根据一段抗逆的EST序列, 从栽培大豆东农42中克隆到4个开放阅读框均是外显子和内含子间隔构成的R2R3-MYB基因, 其中Gm02g01300、Gm03g38040和Gm10g01340与已公布的Willams 82基因组序列完全一致, Gm19g40650第375位的单核苷酸突变导致多肽链第125位的氨基酸发生置换(GAG³⁷⁵→GAC³⁷⁵, E¹²⁵→D¹²⁵)。以人工气候箱内模拟非生物胁迫(盐、碱、干旱和低温)处理栽培大豆东农42芽期, 选择适宜时间点, 采用荧光定量PCR技术, 检测R2R3-MYB基因的表达。结果表明, 4个基因的表达水平都存在明显波动, 呈诱导后短暂上调或下调两种表达模式, 但表达时间、强度和趋势存在明显差异; Gm02g01300受干旱诱导明显, Gm03g38040受多种胁迫条件诱导表达强烈, 推测这些基因在大豆非生物胁迫的调控中起到重要作用; 另外, 在子叶与胚间, 单个基因的表达也存在差异; 多种非生物胁迫条件下, 基因的表达不仅存在时空差异, 可能也具有调控模式的差异。