猪瘟疫苗中牛病毒性腹泻病毒2型的检测

为对上海某猪场送检的一份猪瘟疫苗进行牛病毒性腹泻病毒(BVDV)检测,本研究将猪瘟疫苗样品接种于MDBK细胞,盲传15代后仍无致细胞病变效应,但间接免疫荧光试验表明接种该疫苗后的MDBK细胞能够被单克隆抗体BZ-53(BVDV-2)识别。采用BVDV-1和BVDV-2的5’-UTR的通用检测引物和针对BVDV E2的引物,对样品RNA进行RT-PCR检测,结果显示,样品能够扩增出约288 bp的BVDV特异性片段;此外,5’-UTR和E2基因片段的测序分析结果表明分离株属于BVDV-2,并且其E2基因与牛源XJ-04株(BVDV-2)的E2基因同源性最高(92.3%),而与猪源ZM-95株(BVDV-1)的E2基因同源性较低(64.5%)。由此证明,该猪瘟疫苗中的确污染有一株BVDV-2株。     

1株猪源牛病毒性腹泻病毒的分离与鉴定

从BVDV阳性仔猪病料中分离病毒,为开展猪源BVDV病原学研究奠定基础。将处理后BVDV阳性仔猪组织样品接种MDBK细胞,分离到1株猪源BVDV,命名为SD0803株。通过细胞培养、直接免疫荧光、5′-UTR与Npro PCR扩增、电镜观察、TCID50测定及对其分子进化特征加以分析。结果表明,该毒株在MDBK细胞上盲传至13代未出现细胞病变。在直接免疫荧光试验中呈阳性荧光信号。PCR扩增分别获得5′-UTR与Npro预期大小DNA片段。电镜观察,病毒粒子略呈圆形,有囊膜,直径约50nm。病毒滴度为10-6.5 TCID50.0.2 mL-1。SD0803 5′-UTR、Npro序列进化分析显示,该分离株属于BVDV-1,与已知BVDV-1各亚型之间同源性较低,单独成一分支。结果表明,成功分离鉴定1株猪源BVDV SD0803,该毒株为非致病变型BVDV-1,极有可能为BVDV-1新的亚型。     

牛病毒性腹泻病毒基因2型毒株的分离与鉴定

本研究采用特异性RT-PCR从某实验室送检MDBK细胞中分离到1株牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV),命名为BVDV-C1。通过免疫荧光、电镜观察和5'UTR序列测定及分子进化分析,结果表明其在MDBK细胞中无细胞病变产生,应用牛病毒性腹泻病毒2型特异性单克隆抗体检测,在感染细胞胞浆内呈现特异性荧光信号,而牛病毒性腹泻病毒1型特异性单克隆抗体未检测到荧光。电镜观察病毒粒子呈圆形,有囊膜,直径约为50 nm。5'UTR序列分析表明该毒株属于BVDV-2b基因亚型。BVDV-C1株的分离对进一步开展疫苗研发、流行病学调查以及致病机理等方面的研究具有重要意义。     

牛病毒性腹泻病毒基因2型代表株全基因组序列分析

为了解我国牛病毒性腹泻(BVD)的分子流行病学情况,本研究对分离的3株牛病毒性腹泻病毒基因2型(BVDV-2)代表株全基因组进行序列分析,应用RT-PCR法分段扩增3株BVDV-2(XJ-04、SD-09和QH-09)的全基因组序列,共分为18个片段:A～Q以及5'-UTR和3'-UTR的部分序列。除5'-UTR和3'-UTR部分序列外,A～Q基因片段末端相互重叠。经序列拼接获得3株全基因组序列,全长均为12 284 bp。将测序结果与GenBank登录的瘟病毒科代表毒株序列、自我裂解酶(Npro)、结构蛋白(C、Erns、E1、E2)以及标准株BVDV-1 NADL和BVDV-2 890进行核苷酸以及氨基酸序列同源性分析。结果表明:XJ-04、SD-09和QH-09的全基因组序列同源性高于99.6%,3株BVDV-2分离株与890和NewYork93株亲缘关系最近,属于BVDV-2a亚型。在致细胞病变型的XJ-04、SD-09、QH-09株的NS2/3基因上无外源基因的插入。本研究分离的BVDV-2株为国内首次鉴定国内分离株全基因组序列,为我国BVD的分子流行病调查提供依据。     

2株牛病毒性腹泻病毒基因2型的分离鉴定

为了对疑似污染牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)的牛肾细胞系(MDBK)进行检测并分离鉴定病毒,采用RTPCR、间接免疫荧光、电镜观察、病毒序列的分子进化分析等方法对细胞中污染的BVDV进行鉴定。结果显示:从2株不同来源的污染细胞中检测到2株BVDV(C201602和C201704),RT-PCR均可扩增得到288 bp的5'-UTR片段,进化分析表明其均为BVDV-2a型;2株病毒接种MDBK细胞传代,均无细胞病变产生,测得第3代病毒效价分别为105和104.5TCID50/m L,电镜观察病毒为50~60 nm的圆形有囊膜颗粒。研究表明,BVDV-2具有潜在的流行风险,为试验材料中BVDV-2污染的风险控制提出了警示。     

ISG15蛋白促进猪源牛病毒性腹泻病毒2型对Ⅰ型IFN表达抑制的研究

为研究ISG15蛋白与猪源牛病毒性腹泻病毒2型(BVDV-2)相互作用关系,本研究通过RT-PCR扩增ISG15基因并克隆于真核表达载体p EC129中,转染于MDBK细胞,经G418筛选获得稳定表达ISG15蛋白的细胞系E53。将猪源BVDV-2分别感染E53细胞和MDBK细胞,收集不同时间点的细胞培养液并测定病毒的TCID50。结果显示ISG15蛋白对猪源BVDV-2复制具有明显抑制作用。利用荧光定量PCR检测猪源BVDV-2感染E53细胞内ISG15基因表达的变化,结果表明,病毒感染的E53细胞内ISG15基因的表达量明显高于对照组,表明猪源BVDV-2感染能够显著提高ISG15基因的表达。此外,利用荧光定量PCR检测经poly I:C处理后感染SH-28株的MDBK和E53细胞内IFN-α和IFN-β表达情况。结果表明MDBK细胞内IFN-α和IFN-β表达量分别下降约2.49倍和3.31倍,而在E53细胞中,IFN-α和IFN-β的表达量分别下降约6.29倍和9.71倍,表明过量表达ISG15蛋白能够促进猪源BVDV-2对Ⅰ型IFN的抑制作用。本实验为进一步研究猪源BVDV-2逃逸细胞先天免疫机制奠定了基础。     

基因2型牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立和初步应用

根据已发表的牛病毒性腹泻病毒基因1型(BVDV-1)和2型(BVDV-2)5非编码区(5-UTR)的序列,分别设计了针对BVDV-1型、BVDV-2型以及针对BVDV-1和BVDV-2两型的特异性引物和通用引物,以标准参考株BVDV-1 NADL株和BVDV-2890 株为对照,建立了分别能检测BVDV-1、BVDV-2和BVDV-1/BVDV-2的RT-PCR 检测方法.在此基础上,进一步对疑似BVDV-2感染牛的临床病料组织(脾、淋巴结、心肌、血液等)检测结果表明,在所检测的18份样品中,BVDV-2阳性8份(44%).经RT-PCR鉴定为阳性的组织病料,进一步通过MDBK 细胞进行病毒分离,病毒分离率为100%;结合感染细胞病变观察,间接免疫荧光试验RT-PCR和序列测定鉴定,所分离的病毒均为BVDV-2.上述研究表明,该RT-PCR检测方法敏感、特异;并证实我国牛群已存在BVDV-2的污染或感染.     

牛病毒性腹泻病毒XC株的分离与鉴定

将BVDV阳性血清样品接种MDBK细胞,结果分离出1株BVDV。采用MDBK细胞培养法、直接免疫荧光、RT-PCR与TCID_(50)等方法对分离毒株进行鉴定分析。结果表明,分离株在MDBK细胞上盲传至10代均未出现细胞病变;在直接免疫荧光试验中呈阳性;RT-PCR扩增均获得5'-UTR、Npro预期大小DNA片段;分离株滴度为10~(-5.9)TCID_(50)/0.2 mL。进化分析显示,该分离株属于BVDV-1m。以上结果推断,成功分离鉴定1株BVDV,该分离株为非致细胞病变型BVDV-1m,命名为BVDV-1 XC株,为研究致病机理奠定基础。     

一株源于商品胎牛血清的BVDV-2型的分离鉴定及基因组序列分析

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是引起牛病毒性腹泻/黏膜病的重要病原,也是牛血清及其制品污染中的常见病原体。本研究从商品化胎牛血清中分离到一株致细胞病变(CP)型BVDV(GS2018株),利用电镜观察、免疫荧光检测、分子鉴定、基因组测序及遗传进化分析对其进行鉴定。结果表明,GS2018株接种MDBK细胞后可见明显的细胞病变(CPE),培养第4天病毒滴度达1×10~(6.2)·0.1 mL~(-1)。病毒粒子呈圆形,直径为50～60 nm,间接免疫荧光检测为阳性;其5′UTR扩增片段与BVDV-2相应序列高度相似,病毒基因组包含12 235个核苷酸(nt)。5′UTR、N~(pro)及E2基因系统进化分析发现,GS2018株与美国BVDV-2 USMARC-60764分离株核苷酸一致性达98%,证明其属于CP型BVDV-2a亚型。但GS2018株在NS2/3区无核酸片段插入,这与大多数CP型BVDV-2明显不同,说明BVDV致细胞病变可能涉及更复杂的机制。     

一株源于商品胎牛血清的BVDV-2型的分离鉴定及基因组序列分析

牛病毒性腹泻病毒（BVDV）是引起牛病毒性腹泻/黏膜病的重要病原,也是牛血清及其制品污染中的常见病原体。本研究从商品化胎牛血清中分离到一株致细胞病变（CP）型BVDV（GS2018株）,利用电镜观察、免疫荧光检测、分子鉴定、基因组测序及遗传进化分析对其进行鉴定。结果表明,GS2018株接种MDBK细胞后可见明显的细胞病变（CPE）,培养第4天病毒滴度达1×10^6.2·0.1 mL^-1。病毒粒子呈圆形,直径为50~60 nm,间接免疫荧光检测为阳性;其5'UTR扩增片段与BVDV-2相应序列高度相似,病毒基因组包含12 235个核苷酸（nt）。5'UTR、N^pro及E2基因系统进化分析发现,GS2018株与美国BVDV-2 USMARC-60764分离株核苷酸一致性达98%,证明其属于CP型BVDV-2a亚型。但GS2018株在NS2/3区无核酸片段插入,这与大多数CP型BVDV-2明显不同,说明BVDV致细胞病变可能涉及更复杂的机制。     

捕食线虫性真菌的分离鉴定

本文报道首次从我国内蒙古土壤中分离出一株捕食线虫性真菌,该菌株适宜在２０℃,ｐＨ６,玉米粉浓度０．４ｇ／Ｌ的玉米粉琼脂（ＣＭＡ）培养基中生长。通过对其菌丝、孢子及捕食性结构的形态学观察,鉴定其为节丛孢属的少孢节丛孢菌ＣＩＭＨＩ株（Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓｏｌｉｇｏｓｐｏｒａ,ｓｔｒａｉｎＣＩＭＨＩ）。     

工程量清单计价模式实施探析

实行工程量清单计价是一种既符合我国市场竞争规则，又符合与国际惯例接轨的造价模式，是我国建设市场发展需要的必然结果。阐述了在我国实行工程量清单计价的重大意义，探讨了现阶段实施工程量清单计价中遇到的问题，并提出了完善措施。     

广西水牛类圆线虫病的病原体形态

类圆线虫病是广西水牛的常见寄生虫病之一,本文作者通过光镜观察,我们确认广西水牛类圆线虫病的病原体即为乳突类圆线虫。本文首次记述该虫种第四期幼虫的形态。在扫描电镜下,虫卵表面光滑,近似椭圆形。丝状蚴头端钝圆,口孔裂隙状,左右为2唇片,每唇片似分3小叶;体表两侧自劲部开始,各有2条纵嵴,延续至尾端,称为双翼膜(double alae),这是该期虫体独有的构造;丝状蚴尾端分叉。自由生活成虫具6片唇,各唇上有1个唇乳突;口孔内沿有一排锥状齿,共9枚;头端两侧各具1个半球形的头感器;头端背腹面的两侧各具1个头乳突,共4个,锥形。自由生活雄虫的泄殖腔处明显地突出于虫体表面,其周围有7对性乳突。自由生活雌虫的阴门横裂,肛门呈半月形。寄生生活雌虫头端截平,4个唇片由口缘伸向口孔,唇片近口孔中央向上翻卷,唇片上各有1个唇乳突;口孔呈倾斜(45°)的马耳他“十”字形;头感器1对,头乳突4个;阴门横裂,阴门部有1对阴侧感觉窝和1对阴后乳突;肛门横裂,突起;尾部自肛门后突然收缩,呈指状。在宿主体内未见到寄生生活雄虫。     

《证券法》的修改与上市公司信息披露的规范

上市公司信息披露关系到市场的健康发展，但目前上市公司信息披露存在着许多问题，如信息披露制度不完善，信息披露质量难言满意等。根据证券法修订草案中对上市公司信息披露的相应修改内容，应用XBRL技术加速上市公司信息披露规范，多管齐下改善披露质量：引入做空机制是一个优选；加重违反信息披露法律法规上市公司的法律责任；加大信息披露监管力度。