TaqMan-LNA探针荧光定量PCR快速检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒

[目的]建立快速、特异、灵敏检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)的TaqMan-LNA探针荧光定量PCR方法,为IHHNV的临床诊断和疫情监测提供更简便的检测技术.[方法]根据GenBank已发表的IHHNV毒株序列,在IHHNV保守区序列设计特异性引物和TaqMan-LNA探针;对荧光定量PCR反应条件进行优化以缩短检测时间,提高特异性和灵敏度;应用TaqMan-LNA探针荧光定量PCR对广西地区的300份凡纳滨对虾样品进行检测,验证方法的实用性.[结果]TaqMan-LNA探针荧光定量PCR检测IHHNV的灵敏度高,约为10个病毒粒子/反应,定量范围宽,在1.6×101~1.6×108拷贝/μL的范围内具良好的线性关系;与SPF凡纳滨对虾组织、WSSV、副溶血弧菌的DNA和TSV的RNA均无反应,特异性好;组内变异系数为0.53%~1.75%,组间变异系数为0.81%~1.14%,重复性和重现性均较好,结果稳定可靠;临床应用结果表明,300份凡纳滨对虾样品检出193份阳性,阳性率为64.3%,表明广西沿海地区养殖的凡纳滨对虾IHHNV感染率较高.[结论]利用TaqMan-LNA探针建立检测IHHNV的荧光定量PCR方法具有快速、特异、灵敏、重复性好、能定量等优点,可用于对虾IHHNV的检测.     

IHHNV PCR检测方法改进及广西流行株基因型分析

【目的】建立并优化传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)检测及其基因分型的套式PCR,并确定IHHNV在广西流行的基因型,为有效防控广西对虾传染性皮下及造血组织坏死病(IHHN)提供参考依据。【方法】在以PCR检测IHHNV现有标准的基础上,于389F/R和309F/R两对引物扩增片段之外的绝对保守区域设计外引物IHHNVWF/WR,优化退火温度和引物浓度后建立IHHNV检测及基因分型的套式PCR,并通过与一步法PCR对比以验证其优越性;采用建立的套式PCR对546株2010—2018年收集的IHHNV广西流行株进行基因型分析,确定IHHNV在广西流行的基因型。【结果】优化后的第一轮PCR反应体系20.0μL:2×F8 FastLong PCR MasterMix 10.0μL,上、下游引物(20μmol/L)各0.8μL,DNA模板2.0μL,无核菌酶灭菌水补足至20.0μL。扩增程序:94.0℃预变性3 min;94.0℃10 s,59.0℃15 s,72.0℃15 s,进行35个循环;72.0℃延伸5 min。套式PCR检测IHHNV的灵敏度较一步法PCR提高100倍;对100份IHHNV阳性临床样品的检测结果与一步法PCR的检测结果一致,符合率达100%。从546株IHHNV广西流行株中均能扩增获得309 bp的目的条带,全部为感染型(基因1型和基因2型)。【结论】在PCR检测IHHNV现有标准基础上建立的IHHNV检测及基因分型套式PCR,其灵敏度较一步法PCR提高100倍,尤其适用于检测IHHNV含量低的样品,可为疫病监测及进出口检疫提供更敏感的技术手段。当前广西流行的IHHNV均为感染型(基因1型和基因2型)。     

凡纳滨对虾病毒性疾病概述及其防治措施

凡纳滨对虾早期因其具有生长快、病害少、经济效益高等优点，在全球大部分国家均有养殖，并且成为世界上养殖量最高、产量最高的对虾。随着凡纳滨对虾集约化养殖程度的不断提高，养殖过程中所发生的病害也日趋增多和日益严重，其中尤其是以病毒性疾病所造成的损失最为严重，也最难以治理。每年对虾养殖业因疾病而造成的损失中有60%是由病毒性疾病所引起的，故而本文选取了凡纳滨对虾养殖过程中三种常见且危害较大的病毒，对其基本情况进行了简要的概述，为对虾养殖从业者提供一个科学的认识，并提出了相应的防控措施。     

对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒实时荧光LAMP检测方法的建立及应用

笔者研究构建了一种基于ESE-Quant tube scanner设备的新型实时荧光环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)IHHNV检测方法,评价其敏感性、特异性、反应速度和实际检测结果。结果表明,IHHNV实时LAMP检测方法在63℃条件下,30 min内检测到106稀释的基因组DNA,可检测到24个质粒拷贝;与27种包括多种水生动物以及对虾常见病原DNA均无交叉反应。通过对152份实际样品的检测,实时荧光LAMP检测方法的检出阳性率为59.87%,与real-time PCR方法相当,高于其他检测方法。本研究建立的IHHNV实时LAMP检测方法对现场诊断具有较大的应用潜力。     

浙江省主要养殖区凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）红体病病原研究

对2012—2013年浙江省凡纳滨对虾( L itopenaeus vannamei)主要养殖区的红体病虾进行病原鉴定及其分子特征与耐药性研究,并与2011年的结果进行比较分析.结果表明：通过 Vitek 、16S rRNA 序列分析与病毒特异性聚合酶链反应,2012—2013年在红体病虾中同时检测出副溶血弧菌( V ibrio parahaemolyticus)与传染性皮下和造血组织坏死病毒( infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus , IHHNV ),而2011年在红体病虾中仅检测出副溶血弧菌,未检测出 IHHNV ;3年均未检测出桃拉综合征病毒( Taura syndrome virus , TSV)和白斑综合征病毒( white spot syndrome virus , WSSV ).基于 dnaE‐gyrB‐recA‐dtdS‐pntA‐pyrC‐tnaA 的多位点序列分型结果表明,副溶血弧菌分离株具有较高水平的分子多样性：2011—2013年各年的分离株均分属多个序列型( sequence type ,ST ),来自位于进化树不同亚枝、亲缘关系较远的不同克隆;2012—2013年的分离株经历了较高水平的分子变异,其中 ST918与 ST919为首次报道的副溶血弧菌新 ST ;2011年分离株与2012—2013年分离株的等位基因和序列型特征具有较大差异,ST414与 ST114分别代表2011年与2012—2013年红体病的优势 ST .2011—2013年的副溶血弧菌分离株均属于大流行群,并具有相同的毒力基因谱( tlh＋ tdh－ trh－ T3SS1＋ T3SS2－),tdh与 trh的缺失并未影响细菌的致病力.分离株对抗菌药物尤其是氨基糖苷类的耐药性呈现加重趋势.说明本次凡纳滨对虾红体病可能是多种致病因子共同作用的结果,亟须建立红体病病原监测体系,并探明细菌性病原与病毒性病原混合感染对致病性的影响及其互作机制,以提出综合防控方案.     

应用Taqman荧光定量PCR快速检测宠物食品中的沙门氏菌

[目的]建立快速检测宠物食品中沙门氏菌(Salmonella)的荧光定量PCR方法。[方法]根据Genbank中登录的沙门氏菌吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白invA基因序列设计合成引物和探针,检测该方法的特异性和敏感性。[结果]该方法具有良好的特异性,对沙门氏菌的检测灵敏度可达到17 CFU/反应(25μl/反应)。应用该方法检测人工污染宠物食品,样品经18 h增菌后,结果均为阳性。[结论]该研究建立的Taqman荧光定量PCR方法可以快速、准确地检测宠物食品中的沙门氏菌。     

凡纳滨对虾3种主要病毒和虾肝肠胞虫在辽宁地区的流行情况分析

为解决近年来辽宁地区凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei病害频发的问题,于2015年8月从辽宁省盘锦、营口地区26个发病的凡纳滨对虾养殖池塘中随机采集病虾样本,采用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、对虾白斑综合征病毒(WSSV)和对虾桃拉综合征病毒(TSV),并用环介导等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplication,LAMP)技术检测虾肝肠胞虫Enterocytozoon hepatopenaei(EHP)的感染情况。结果表明:IHHNV和EHP的检出率较高,分别为65.4%和34.6%,WSSV和TSV的检出率分别为19.2%和7.7%;EHP的检出率与对虾体型大小密切相关,在小虾样本中检出的阳性率高达100%,而大虾样本中均未检出;26份对虾样本中有7份样本同时携带EHP和IHHNV。研究表明,IHHNV和EHP是2015年8月辽宁地区凡纳滨对虾的主要流行病原,发病率可能与对虾生长缓慢、个体大小差异明显相关。     

凡纳滨对虾3种主要病毒和虾肝肠胞虫在辽宁地区的流行情况分析

为解决近年来辽宁地区凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei病害频发的问题,于2015年8月从辽宁省盘锦、营口地区26个发病的凡纳滨对虾养殖池塘中随机采集病虾样本,采用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、对虾白斑综合征病毒(WSSV)和对虾桃拉综合征病毒(TSV),并用环介导等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplication,LAMP)技术检测虾肝肠胞虫Enterocytozoon hepatopenaei(EHP)的感染情况。结果表明:IHHNV和EHP的检出率较高,分别为65.4%和34.6%,WSSV和TSV的检出率分别为19.2%和7.7%;EHP的检出率与对虾体型大小密切相关,在小虾样本中检出的阳性率高达100%,而大虾样本中均未检出;26份对虾样本中有7份样本同时携带EHP和IHHNV。研究表明,IHHNV和EHP是2015年8月辽宁地区凡纳滨对虾的主要流行病原,发病率可能与对虾生长缓慢、个体大小差异明显相关。     

TaqMan探针实时荧光定量PCR检测番茄黄化曲叶病毒

根据番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)外壳蛋白(CP)基因序列上的保守序列,设计特异性的引物和Taqman探针,建立荧光定量PCR方法。结果表明,试验建立的标准曲线循环阈值(Ct值)与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.9941;能检测到1 000个病毒拷贝,灵敏度比普通PCR高100倍;与番茄花叶病毒和黄瓜花叶病毒无交叉反应,特异性强、重复性佳,为TYLCV检测提供了一种特异、灵敏、快速的定量检测方法。     

TaqMan–MGB探针荧光定量PCR检测致对虾急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌

根据pir AVp基因保守序列设计特异性引物和TaqMan–MGB探针,经优化反应体系及条件,建立检测致对虾急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)的TaqMan–MGB探针荧光定量PCR方法;以重组质粒为标准品制作标准曲线,并进行特异性、敏感性、重复性及临床应用试验。结果表明:该方法定量范围宽,起始模板浓度范围为1×101～1×109拷贝/反应时,标准曲线具良好的线性关系;最低检测限约为10拷贝/反应,与对虾其他病原菌及病毒无交叉反应,重复试验变异系数为0.37%～0.47%,可在1 h内完成单个样品检测;对临床对虾样品及水样的检测结果表明,与世界动物卫生组织(OIE)推荐的套式PCR法相比,可提高VpAHPND的阳性检出率,且检测为阳性的样品包含全部套式PCR法检测为阳性的样品。可见,应用TaqMan–MGB探针建立的检测VpAHPND的荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好、能快速定量等优点,可用于临床对虾样品及水样的VpAHPND检测。     

高效荧光定量PCR探针的筛选及HBV-DNA检测方法的建立

目的:筛选一套灵敏度高、特异性强的引物探针,用于建立检测HBV病毒载量的荧光定量PCR方法.方法:通过PCR方法扩增HBV基因组片段,与T载体连接,制备工作标准品,并运用设计的荧光定量PCR对HBV DNA国家标准品进行检测.结果:以pMD18-T-HBc作为标准品,HBcF和HBcR为上下游引物,HBcP为探针所建立的荧光定量PCR检测HBV病毒载量方法的线性范围为109copies/mL到103copies/mL,批内重复性变异系数为0.20％一1.44％,批间重复性变异系数为3.08％～5.63％,检测国家阴阳性标准品的特异性灵敏度为100％,国家线性标准品的检测值与理论值的线性相关系数R为0.998.结论:成功筛选出一套荧光定量PCR检测HBV DNA的引物探针,并已建立了一种特异性灵敏性均非常高的荧光定量PCR检测HBV DNA的方法.     

实时定量PCR快速检测对虾白斑综合症病毒

根据对虾白斑综合症病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)的保守序列,利用Primer Express2.0软件设计引物和Taqman探针,建立了WSSV的实时定量PCR检测体系.构建含有WSSV目的扩增片段的质粒为标准品,进行定量PCR扩增,结果表明标准品浓度在1.5×107～1.5×101个拷贝之间有S型扩增曲线,检测限为15个拷贝.标准曲线中模板浓度(X)与Ct值的关系为:Ct=-3.77 lgX+43.73,相关系数R2=0.9967.该检测方法特异性强,对传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)、斑节对虾杆状病毒(MBV)、肝胰腺细小病毒(HPV)以及对虾基因组DNA没有扩增反应.运用该方法对100尾对虾样品进行检测,14个对虾样品为阳性.而运用巢式PCR检测只有4个对虾样品为阳性.实时定量PCR方法检测WSSV,快速、特异、灵敏,在虾病的临床检测上具有重要意义.     

虾虹彩病毒TaqMan-MGB探针荧光定量PCR检测方法的建立

[目的]建立检测虾虹彩病毒(SIV)的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR,为实现虾虹彩病毒病(SIVD)快速诊断及疫情监测提供一种新的技术手段.[方法]根据SIV的MCP基因保守序列设计特异性引物和TaqMan-MGB探针,将目的片段克隆至pMD18-T载体制备重组质粒pMD18-T-MCPSIV;优化反应体系及扩增条件后建立检测SIV的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR,以pMD18-T-MCPSIV为标准品绘制标准曲线,并通过特异性、敏感性、重复性试验及临床应用验证其实用性.[结果]制备的重组质粒(pMD18-T-MCPSIV)DNA稳定性好,满足作为标准品的要求;标准品起始模板范围为2.0×101~2.0×109拷贝/反应时,建立的标准曲线具有良好线性关系.优化后的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR灵敏度高,对重组质粒的检测灵敏度可达20拷贝/反应,对虾组织SIV的检测灵敏度约10拷贝/mg,其临床检测的敏感性与套式PCR相当;与虾类其他常见病原无交叉反应,组内和组间变异系数分别为0.27%~0.54%和0.61%~0.95%,且扩增与产物分析同步完成,整个检测过程仅需1 h左右.采用建立的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR与目前农业农村部推荐的套式PCR同时对276份临床虾样品进行SIV检测,结果显示,两种方法的大部分检测结果一致,符合率为98.6%,但检测低拷贝数样品时前者具有更高的灵敏度.2018和2019年广西虾样品的SIV阳性检出率分别为19.7%和7.5%,且养殖凡纳滨对虾、罗氏沼虾和红螯螯虾均检测到SIV阳性.[结论]基于SIV MCP基因保守序列建立的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好、定量范围宽及简单快速等优点,适用于虾类样品SIV检测,可为SIVD快速诊断及疫情监测提供一种新的技术手段.     

凡纳滨对虾COPE基因序列及低温表达分析

通过对已知耐寒候选基因-COPE基因的克隆和研究,为凡纳滨对虾耐寒性状的分子机理研究提供依据。运用同源克隆和RACE-PCR技术获得凡纳滨对虾COPE基因(LvCOPE)全长cDNA序列,对其进行了生物信息学分析,采用荧光定量PCR研究了LvCOPE基因的组织表达谱及其在低温胁迫下表达量的变化。结果显示,LvCOPE cDNA全长1217 bp,包含888 bp开放阅读框,编码296个氨基酸残基,具有保守的TPR结构域。各物种COPE蛋白序列构建的系统进化树能准确反映各物种间的进化关系。Lv-COPE mRNA在各组织中呈遍在表达,在肌肉组织中表达量最高。低温表达谱分析显示,LvCOPE mRNA在低温处理对虾的肝胰腺、心、鳃、肌肉等组织中均呈下调表达,随着处理温度由15℃降至11℃度,其在肝胰腺中表达量逐渐降到最低。因此,LvCOPE在结构和进化上保守,在低温胁迫时呈下调表达,可能在寒冷耐受过程中发挥负调控功能。     

TaqMan实时荧光PCR快速检测斑点叉尾鮰病毒

根据GenBank登录的斑点叉尾鮰病毒株ORF8基因序列,设计引物和Taqman荧光探针,建立了用于检测斑点叉尾鮰(Ictalurus Punctatus)病毒的实时荧光定量PCR方法;对实时荧光定量PCR反应条件进行了优化,评估了该方法的特异性、灵敏度和重复性,并建立了绝对定量方法。特异性试验证实,该方法只能检测到斑点叉尾鮰病毒,与真鲷虹彩病毒、蛙虹彩病毒、锦鲤疱疹病毒、鳜鱼传染性脾肾坏死病毒等多种常见的水生动物病毒没有交叉反应,具有高度的特异性。标准曲线表明,在3.3×10~3.3×107拷贝数之间有较好的线性关系(r=0.998 3),最少可检测到33个拷贝的阳性质粒,敏感度很高。同一样品于试验内及试验间的重复性试验发现,变异系数分别为0.7%和1.2%,重复性较好。该方法的检测时间从核酸抽提到出具结果仅需3h。试验结果表明,采用实时荧光PCR检测斑点叉尾鮰病毒方法具有特异性好、灵敏度高、检测耗时短的特点,并且能对病毒进行准确的定量分析,不仅适合口岸进出口检验检疫的需求,而且可以作为研究该病毒感染过程的有力工具。     

黄瓜花叶病毒荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立检测香蕉中黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic virus(CMV)的实时荧光定量方法.【方法】根据CMV外壳蛋白(CP)保守序列设计了TaqMan实时荧光定量PCR特异性探针及引物,优化反应体系检测TaqMan探针实时荧光定量方法的灵敏度、特异性和重复性.【结果和结论】该方法检测灵敏度为4.2×102μL-1,比普通PCR高100倍,且与香蕉束顶病毒Banana bunchy top virus(BBTV)、香蕉线条病毒Banana streak virus(BSV)无交叉反应,特异性和重复性都较好.用实时荧光定量PCR检测14份田间香蕉样品有5份样品为阳性,进一步证明建立的实时荧光定量方法可用于香蕉CMV的检测.     

猪瘟病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中5′端非编码区的靶序列设计了用于TaqMan荧光定量PCR的1对引物及TaqMan探针,以猪瘟活疫苗病毒为模板,在常规PCR的基础上优化了TaqMan荧光定量PCR反应条件,建立了猪瘟病毒（CSFV）TaqMan荧光定量PCR检测方法。其敏感性和特异性试验结果表明,所建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法对CSFV具有很高的特异性,其检测灵敏度可达5.03×10-2μg/μL。说明TaqMan荧光定量PCR适用于CSFV的快速检测。     

对虾病毒 DNA／RNA 的实时荧光定量RT PCR 同步检测方法研究

为建立同步检测对虾DNA/RNA病毒的实时荧光定量反转录PCR（RTPCR）方法,提高检验检疫工作效率,探索了一种新的实时荧光定量PCR扩增反应程序。结果显示,应用优化的实时荧光定量RTPCR检测4种对虾病毒（白斑综合症病毒、传染性皮下及造血器官坏死病毒,桃拉综合征病毒、黄头病毒）DNA/RNA,扩增曲线形态典型,扩增效率理想（E值分别为1.06、1.07、0.92、0.92）,标准曲线线性良好（r＝1）,重复性一致（标准差0.05～0.46,变异系数0.26％～1.62％）,灵敏度高,且与实时荧光定量PCR相比差异不显著（平均Ct值误差0.04～0.40,t值0.53～2.50,P＞0.05）,检测时间约1h。优化的荧光定量RTPCR可以用于4种对虾病毒DNA/RNA的快速定量检测。     

烟草花叶病毒实时荧光定量PCR检测体系的构建

[目的]防止隐症携带烟草花叶病毒(TMV)的烟苗移栽到大田造成产量损失。[方法]根据TMV的外壳蛋白(coat protein, CP)基因保守序列设计引物及探针,通过绘制标准曲线、重复性、特异性及灵敏性分析,建立了一种TMV的TaqMan-qPCR检测方法。[结果]该方法特异性好,与其他常见的烟草病毒无交叉反应;灵敏度高,检测下限可达到4.53×10¹ copies/μL,比常规RT-PCR检测灵敏度提高了10倍;建立的标准曲线斜率为-3.299,决定系数(R²)为0.993 3,扩增效率为100.97%,且循环阈值(Ct)与质粒标准品浓度之间线性关系良好,重复性试验结果可靠。[结论]利用建立的TaqMan-qPCR检测方法与常规RT-PCR检测方法同时检测烟苗样品,检测结果一致,进一步验证了荧光定量PCR方法的可靠性。     

凡纳滨对虾肌球蛋白轻链基因MLC的克隆及表达分析

以生长性状分离凡纳滨对虾家系的肌肉组织,构建凡纳滨对虾生长性状差减cDNA文库,斑点杂交筛选获得MLC基因,克隆获得全长编码区序列.序列分析表明序列包含462 bp的开放阅读框,推测编码的蛋白质为153氨基酸,预测的分子量为17.5ku,等电点为4..67.通过荧光定量PCR的方法研究了MLC基因在凡纳滨对虾不同组织和不同生长期的肌肉组织中表达情况,显示MLC基因在凡纳滨对虾的心脏、肝胰腺、肌肉、胃、肠、眼柄、鳃和血等组织或器官中都有表达,在肌肉组织中表达量最高,在肝胰腺中表达量最低;在日龄为45d的对虾肌肉组织中表达量最高,在日龄为10 d的对虾肌肉组织中表达量最低.