牦牛线粒体DNA D-loop区序列测定及其在牛亚科中分类地位的研究

根据普通牛线粒体DNA序列设计引物,获得了九龙牦牛线粒体D-loop区全序列,并以羊亚科绵羊属绵羊作为外类群利用D-loop区序列对牛亚科代表性物种（牦牛、野牦牛、普通牛、瘤牛、美洲野牛、欧洲野牛和亚洲水牛）进行了系统发育分析。结果发现：牦牛线粒体DNA D-loop区序列全长893 bp,与普通牛源序列的同源性为87.4%,其中有17个碱基的缺失;在牛亚科内,牦牛、野牦牛与美洲野牛（美洲野牛属）间的序列差异百分比最小,为6.2%～6.8%,而与牛属中普通牛、瘤牛间的序列差异百分比较大,为10.0%～11.3%;系统发育分析发现：牦牛、野牦牛首先与美洲野牛聚为一类,说明牦牛、野牦牛与美洲野牛属间的遗传相似性较高、亲缘关系较近,而与牛属间的遗传相似性较低、亲缘关系较远;结合古生物学、形态学、分子生物学的证据,支持将牦牛、野牦牛划分为牛亚科中一个独立属即牦牛属的观点。     

牦牛线粒体DNA细胞色素b基因序列测定及其起源、分类地位研究

牦牛在牛亚科中的分类地位仍存在较大的分歧。根据普通牛线粒体基因组序列设计引物对家牦牛基因组进行PCR扩增和克隆测序，获得了家牦牛细胞色素6（Cytochromeb）基因的全长序列，并以羊亚科绵羊（Ovisaries）为外类群，对牛亚科代表性物种进行了系统发育分析。结果显示：牛亚科不同物种间线粒体细胞色素b基因的转换／颠换比值为4．9，突变未达到饱和状态；牦牛与牛属间的序列差异百分比为8．0％～8．6％，大于牦牛与美洲野牛间的序列差异百分比；系统发育分析发现家牦牛与野牦牛首先聚为一类，再与美洲野牛聚为一类；说明牦牛与美洲牦牛属间的遗传相似性较高，而与牛属间的遗传相似性较低，结果支持现在的家牦牛和野牦牛都是同一祖先原始牦牛的后代，推测两者分化时间大约为0．55百万年前；支持将牦牛划分为牛亚科牦牛属的观点，牦牛属包括家牦牛和野牦牛两个种。     

野牦牛mtDNA Cytb基因全序列测定及系统进化关系

为从分子水平探究牦牛的分类地位和遗传多样性,试验测定了野牦牛细胞色素b基因全序列,并以绵羊为外群,构建野牦牛、家牦牛、大额牛、普通牛、瘤牛、水牛、非洲野牛、欧洲野牛、美洲野牛、非洲水牛等牛亚科种间系统进化树.结果表明:野牦牛细胞色素b基因全序列长1 140bp,序列间共有13个SNP多态位点,核苷酸变异类型包括转换和颠换,无插入和缺失,表明野牦牛具有较丰富的遗传多样性.研究结果支持将牦牛划分为牛亚科中一个独立属(即牦牛属)的观点.     

生物技术在牦牛科学研究中的应用

结合在牦牛杂交改良( 利用黑白花牛冻精冷配家牦牛) 、野牦牛驯化及人工采精、野牦牛改良复壮家牦牛、牦牛体外受精技术的研究,阐述了动物生物技术在牦牛的人工授精、诱导发情、同期发情、超数排卵、胚胎移植、体外受精等方面的应用与发展,这些技术的深入应用将使牦牛的生产性能大为提高,产生显著的经济和社会效益。     

甘南牦牛不同杂交组合生产性能分析

为提高牦牛生产的社会、经济和生态效益,满足人们对无污染的牦牛奶、肉等绿色食品日益增长的需要,本研究利用娟姗牛、安格斯牛和野牦牛的冻精杂交改良甘南牦牛,筛选最佳杂交组合。结果发现,与当地牦牛相比,娟姗牛、安格斯牛和野牦牛与本地牦牛杂交的F1代公母犊牛的初生重、3月龄体重和6月龄体重均显著高于本地牦牛犊(P<0.05),其中娟姗牛、安格斯、野牦牛的杂交F1代的公犊牛初生重分别提高了30.12%、18.21%和13.21%;3月龄体重分别提高了7.89%、3.70%和1.94%;6月龄体重分别达到了81.26±1.23kg、79.26±1.04kg和78.42±1.13kg,而母犊牛6月龄体重分别为77.78±2.26kg、78.07±1.97kg和75.85±1.32kg。因此,利用娟姗牛、安格斯牛与牦牛种间杂交育种可显著改善犏牛生产性能,这将为提高甘南牦牛生产性能、生产优质牛肉提供依据。     

野家牦牛若干生化组分的比较研究

文章以家牦牛和野牦牛为对象,对比分析其血清蛋白质组分含量及若干血清酶(GOT、GPT、AKP、LDH)的活力.结果表明家牦牛与野牦牛的血清蛋白电泳行为基本相似,但清蛋白、β-、γ-球蛋白的相对含量有显著的差异,各血清酶的较大活性差异提示其相关经济性状的不同.这些结果反映二牛血缘关系和种质差异,对导入野牦牛血以复壮培育家牦牛有一定参考价值.     

高原型和环湖型牦牛、斗血野牦牛肉质牧性研究

测定了环湖型牦牛、高原型牦牛、半血野牦牛肉质中氨基酸、矿物质、重金属残留和药物残留含量.结果表明,胱氨酸含量在高原型与环湖型牦牛之间,高原型与半血野牦牛之间差异极显著,但环湖型与半血野牦牛之间差异不显著;牦牛(包括高原、环湖型)与半血野牦牛之间差异极显著.组氨酸含量在高原型与环湖型牦牛之间差异显著,但两类型与半血野牦牛差异均不显著.高原型与环湖型牦牛镁差异显著,牦牛与半血野牦牛之间差异极显著.高原型牦牛铜、锌、铁含量与环湖型牦牛、半血野牦牛差异显著,牦牛锌含量与半血野牦牛有极其显著的差异,牦牛铁含量与半血野牦牛有显著差异.牦牛钠含量与半血野牦牛有显著差异.高原型牦牛硫含量与环湖型牦牛、半血野牦牛有显著差异;牦牛与半血野牦牛之间有极显著的差异.各项重金属含量均低于无环境污染产品标准.所有样品均未检出农药和药'物残留.结果表明,导入野牦牛血液未引起家牦牛后代肉质成分的显著变化,青藏高原生产的牦牛肉具有无污染、氨基酸丰富、矿物质齐全等特点.     

高原型和环湖型牦牛、半血野牦牛肉质特性研究

测定了环湖型牦牛、高原型牦牛、半血野牦牛肉质中氨基酸、矿物质、重金属残留和药物残留含量。结果表明，胱氨酸含量在高原型与环湖型牦牛之间，高原型与半血野牦牛之间差异极显著，但环湖型与半血野牦牛之间差异不显著：牦牛（包括高原、环湖型）与半血野牦牛之间差异极显著。组氨酸含量在高原型与环湖型牦牛之间差异显著，但两类型与半血野牦牛差异均不显著。高原型与环湖型牦牛镁差异显著，牦牛与半血野牦牛之间差异极显著。高原型牦牛铜、锌、铁含量与环湖型牦牛、半血野牦牛差异显著，牦牛锌含量与半血野牦牛有极其显著的差异，牦牛铁含量与半血野牦牛有显著差异。牦牛钠含量与半血野牦牛有显著差异。高原型牦牛硫含量与环湖型牦牛、半血野牦牛有显著差异；牦牛与半血野牦牛之间有极显著的差异。各项重金属含量均低于无环境污染产品标准。所有样品均未检出农药和药物残留。结果表明，导入野牦牛血液未引起家牦牛后代肉质成分的显著变化，青藏高原生产的牦牛肉具有无污染、氨基酸丰富、矿物质齐全等特点。     

野牦牛LDH同工酶特性研究

文中应用聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦电泳方法分离中国家牦牛和野牦牛的血清LDH同工酶,测定其LDH总活力及各同工酶的相对百分含量,研究其作用pH区限、热稳定性和对尿素变性剂的抗力.实验结果发现2牛LDH同工酶对变性因子都有较强的抗性;野牦牛血清LDH活性比家牦牛高得多,各同工酶在单位时间内的活力表现各不相同,差异极显著.可以认为牦牛LDH同工酶的独有特性是其对恶劣生境之非凡适应力的一个内在生化因子,引进野牦牛血缘无疑是家牦牛复壮的有效途径.     

中甸牦牛mtDNA Cytb基因遗传多样性及系统进化分析

为从分子水平上探究中甸牦牛的遗传多样性和起源进化关系,本研究通过测定和分析中甸牦牛15个个体细胞色素b基因(Cytb)全序列,分析多态性及构建系统进化树。结果表明,中甸牦牛Cytb基因全序列长度为1 140bp,T、A、G和C含量分别为26.3%、31.8%、13.1%和28.8%;在15个个体中鉴定出3种单倍型,3个变异位点,其中2个转换、1个颠换,单倍型多样性(Hd)为0.2571,核苷酸多样性(Pi)为0.00035。系统进化树中,中甸牦牛首先与野牦牛聚为一类,之后与美洲野牛聚为一类,说明中甸牦牛与野牦牛和美洲野牛的亲缘关系较近、遗传相似性高,而与其他牛属的遗传相似性相对较低。遗传距离分析结果发现,中甸牦牛和野牦牛的遗传距离最近,结合分子生物学、古生物学等学科知识进一步支持了牦牛和野牦牛划为牛亚科牦牛属的观点。     

公野牦牛的繁殖特性

研究首次对野牦牛的精液品质、精子超微结构、精液精子酶活力等项指标进行了测定,发现具有以下特点精子密度大,每毫升精液含精子21.3亿;精子存活时间长,0～4℃存活57小时,解冻后37℃条件下存活12小时;抗力系数144 000;解冻后精子畸形率和顶体完整率分别为9.17%、87.53%;精液运动粘度为1.69 cP;总氮量为1437.7 mg/100 ml;精子头短尾长,与家牦牛及黄牛差异显著或极显著;精子透明质酸酶活力极显著高于家牦牛,LDH活力比家牦牛高48%.因此,公野牦牛具有高繁殖力,与家牦牛冻配受胎率达88.9%;与普通牛种(黄牛)反杂交冻配受胎率达71.58%.家畜繁殖力的研究侧重于母畜,公畜繁殖力除奶牛之外重视不足,特别是对于培养程度很低的原始育种--牦牛,至于初步驯化的公野牦牛的繁殖力研究在国内外尚属空白.公畜繁殖力主要表现于精液品质和受胎率,许多学者从精子的生理生化特性和超微结构的改变测定与受胎率的相关性.野牦牛(Bos mutns)是家牦牛(Bos grannies)最近的祖先,在分类上是同属同种的不同亚种,野牦牛是"优势型"的"原生亚种",家牦牛是退化了的"驯化亚种".从1984年开始在青海省大通牛场驯化了两头公野牦牛,采用假阴道采精并试制了颗粒冻精.1984～1998年14年野牦牛冻配家牦牛近40 000头,受胎率88.9%,繁殖成活率85.97%.公野牦牛不但与同属同种的家牦牛冻精配种中表现出了很高的繁殖力,而且和普通牛种黄牛杂交也表现出了较高的受胎率.甘肃省礼县畜牧中心1987年开始连续3年购进野牦牛冻精授配黄牛771头,杂交生产野血牦犏牛554头,繁殖率高这71.85%,犊牛生活力强,产生了明显的经济效益.     

野牦牛、家牦牛及其杂交种的生物学特性和遗传多样性研究

为深入研究野、家牦牛及其杂交种的生物学特性和遗传多样性,对青海大通牛场野牦牛(1岁)、大通牦牛(1～2岁)及甘肃天祝县天祝黑牦牛(1～2岁)的生长及部分血液生理指标,做了为期一年(分三期)的跟踪测定.同时,亦对三种群牦牛从血红蛋白、转铁蛋白、白蛋白及淀粉酶4个血液生化位点和9个微卫星DNA位点进行了对比分析.测试结果表明,在生长性状方面,野牦牛头形与天祝黑牦牛差异极显著(P＜0.01),野牦牛角基间宽、最大额宽与头长的比值接近欧洲原牛;三种群牦牛体重和体尺在采样期间差异极显著(P＜0.0),生长表现出明显的季节不均衡性,暖季(5月到10月)增重较快,冷季(10月到翌年5月)生长缓慢;但在冷季,三种群牦牛生长变化趋势不同,野牦牛和大通牦牛体重略有增加,而天祝黑牦牛体重普遍下降,说明野牦牛和大通牦牛更能适应高寒少氧及缺草的生态环境,家野牦牛间的杂交是目前提高牦牛生产性能的有效繁育措施之一.野牦牛及大通牦牛红细胞直径大于天祝黑牦牛;红细胞数(RBC)及红细胞压积(PCV)在种群和采样期之间均差异显著(P＜0.05),血红蛋白差异不显著;野牦牛、大通牦牛RBC在采样期间差异显著,至暖季末期(此时牧场海拔较高)达最大,而天祝黑牦牛在采样期间差异不显著,表明RBC的季节变化是野牦牛和大通牦牛能更有效地进行生理调节的标志之一.4个血液蛋白和等位酶(血红蛋白,Hb;转铁蛋白,Tf;白蛋白,Alb;淀粉酶,Amy)位点中,只有大通牦牛和天祝黑牦牛在淀粉酶位点具有多态,且其平均预期基因杂合度分别0.0531和0.0746,表明三种群牦牛在血液蛋白及等位酶水平遗传多样性贫乏;在9个微卫星DNA位点,三种群牦牛有较高的基因杂合度,野牦牛、大通牦牛和天祝黑牦牛平均预期基因杂合度分别为0.47、0.71和0.67,说明在微卫星位点有丰富的遗传多样性,用微卫星DNA标记能充分揭示牦牛群体的遗传变异.     

野牦牛与家牦牛六个方面比较

牦牛是一种古老的牛种,距今200万年前就已经出现在地球上。我国是世界上家牦牛数量、品种最多的国家,有家牦牛1400多万头,约占世界家牦牛总数的95%以上。被称为"高原之舟"的牦牛,是青藏高原特有畜种,仅青海省就有牦牛490余万头,约占全世界的1/3。本文主要对青海家牦牛和野牦牛的分布及概况、外貌特征与繁殖方式、饲养管理、生产性能和抗病力等方面进行对比分析,发现野牦牛喜欢群居,善于攀高涉险;野牦牛的繁殖情况基本与家牦牛相似;野牦牛比家牦牛抗病性能好。     

第四部分大通牦牛、甘南牦牛微卫星变异的比较研究

为深入了解青藏高原高寒牧区优势畜种--牦牛的种质特性,以青海省大通种牛场为试验基点,探讨了在完全放牧条件下,大通牦牛的生长发育规律.结合实际称重,采集循环血样,分析了血液17种生理生化指标动态及其与生长发育的关系.在分子标记层次,以欧洲15个普通牛品种的有关资料为参照,比较研究了大通牦牛群体、甘南牦牛群体和3头野牦牛的13种微卫星座位的变异,揭示了大通牦牛群体遗传结构,为开发利用牦牛遗传资源提供了科学参考资料.(四)大通牦牛、甘南牦牛微卫星变异的比较研究用联合国粮农组织动物遗传学会(ISAG-FAO)推荐的13种普通牛种的微卫星标记、以已分型的15个欧洲普通牛品种的相应资料作参照,研究了大通牦牛(青海环湖型)、甘南牦牛(青藏高原型)和3头野牦牛的遗传多样性.结果表明,牦牛的全部13种微卫星座位的等位基因或多或少与普通牛相应座位的等位基因分布发生重叠,说明两牛种在上述座位的侧翼碱基序列是较为保守的.与普通牛相比,两个牦牛群体的所有座位同样显示了高度多态性.每个座位等位基因数的范围为4～8个,平均5.462个,略低于普通牛平均数6.515个,可能与对普通牛微卫星的选择有关.在两个牦牛群体间,等位基因片段范围、高频等位基因、等位基因数等非常相似.两个牦牛群体的观察基因杂合度平均值分别为0.639和0.665,与其无偏期望基因杂合度平均值0.676和0.651相近.除HEL5(2个群体类型)和BM1824(环湖型)座位外,其余座位皆处于哈德-温伯格平衡状态.两个牦牛群体的Nei's标准遗传距离Ds等于0.032 4,这一数值甚至比15个欧洲普通牛品种中最小的两个品种的标准遗传距离Ds(0.0662)还小一半.在检测的13个座位中,3头野牦牛共发现42个等位基因,野牦牛的等位基因在大通牦牛群体中平均有92.1%的分布,在甘南牦牛群体中有84.7%的分布.上述结果表明,核基因组微卫星层次的遗传变异比线粒体DNA的遗传变异更丰富.牦牛群体遗传多样性丰富、群体间遗传距离较小,反映了现在的家牦牛,依然是一个培育程度很低的"自然群体",牦牛在漫长的进化历程中产生的遗传变异较为保守,频繁的基因交流、较大的畜群规模和随机交配方式,能使群体产生遗传差异的漂变作用难以发挥,是导致牦牛群体间遗传结构较为相近,遗传距离较小的主要原因.通过对13个微卫星座位的研究分析,足以揭示出牦牛与普通牛的种间遗传差异.     

牦牛育种工作的创新发展

牦牛是分布在青藏高原及周边地区特有的家畜.长期以来托牛业管理方式粗放,生产性能低下.大通种牛场进行导入野牦牛基因改良家托牛的育种研究,培育成功了世界上第一个牦牛新品种"大通托牛",并实施一系列综合技术措施,对托牛业发展有积极的促进作用.     

大通牦牛的培育——不同类型牦牛抗氧化酶活性测定及其与牦牛强抗逆性关系的研究

研究了半血野牦牛,横交一世代牦牛及家牦牛血液红细胞中铜锌超氧化物歧化酶(简称Cu Zn-SOD)、过氧化氢酶(简称CAT)二种抗氧化酶的活性.统计分析结果表明半血野牦牛、横交一世代牦牛两种酶的活性均显著或极显薯高于家牦牛,半血野牦牛和横交一世代牦牛之间、同一类型不同性别牦牛之间均无显著差异.并对抗氧化酶活性与牦牛抗逆性之间的关系作了初步探讨.     

中甸牦牛mtDNA ND6和COⅢ基因遗传多样性及系统进化分析

为了解中甸牦牛的遗传多样性,使其遗传资源能够得到合理开发利用,本研究对中甸牦牛15个个体mtDNA ND6基因和COⅢ基因全序列进行测定,使用MEGA5.0、DNASP5.0、Clustal X1.83等软件分析了核苷酸多样性、单倍型多样性等遗传多样性指标。结果表明:(1)中甸牦牛ND6基因全序列长528bp,4种核苷酸T、A、G、C的平均含量为20.8%、42.2%、7.6%、29.4%,存在一定的碱基组成偏倚性;COⅢ基因全序列长度为781bp,4种核苷酸T、A、G、C的平均比例为29.2%、26.1%、15.2%、29.5%。(2)在15个中甸牦牛个体的ND6基因序列中均未发现单倍型及变异位点,表明中甸牦牛mtDNA ND6基因的遗传多样性较为贫乏;在COⅢ基因序列中发现了3个单倍型,4个变异位点,其中2个转换,2个颠换。(3)在构建的系统进化树中,中甸牦牛首先与麦洼牦牛等家牦牛聚为一类,说明其属于家牦牛,其次与野牦牛聚为一类,说明中甸牦牛与野牦牛亲缘关系较近;由遗传距离分析可知,中甸牦牛与野牦牛距离最小,与亚洲水牛距离最大。此结果进一步支持了将牦牛和野牦牛划分为牛亚科牦牛属的观点。     

牦牛IFN-α基因的克隆表达及抗病毒活性研究

从我国地方品种环湖型牦牛和野牦牛基因组DNA中克隆了α干扰素(BoIFN-α)基因,PCR产物酶切后与载体pQE30连接,构建重组质粒pQE30/BoIFN-α,将其转化JM109E.coli并用IPTG进行诱导表达。序列分析表明,环湖型牦牛和野牦牛IFN-α成熟肽基因全长均为498个核苷酸,编码166个氨基酸,其中环湖型牦牛IFN-α与已报道的8个BoIFN-α亚型氨基酸的一致性为92.8%~95.2%,野牦牛为88.6%~92.8%,均为BoIFN-α新亚型。SDS-PAGE和Westernblot结果表明,重组蛋白约为20kD,以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的25%。经包涵体提取、尿素变性和复性后,重组牛IFN-α粗提物在MDBK/VSV和CEF/VSV细胞系上的抗病毒活性分别为1.6~1.8×106U/mg和2.3×105U/mg,而且对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)也有一定的抑制作用。     

中国牦牛瘤胃纤毛虫原生动物区系与异地饲养对它的影响

本研究调查了在中国西藏、四川的牦牛和在内蒙古异地饲养的牦牛瘤胃纤毛虫种类和组成。调查结果 :鉴定出了12属36种18型瘤胃纤毛虫。在不同的牦牛饲养地区 ,牦牛瘤胃纤毛虫种类组成略有差别 ,西藏牦牛瘤胃纤毛虫种类组成最少 ,相比之下 ,在内蒙古异地饲养的牦牛瘤胃纤毛虫种类组成最多 ,并与当地饲养的牛的瘤胃纤毛虫种类组成相似。这表明牦牛瘤胃纤毛虫组成受到是否与牛在一起或是否在邻近地区饲养牛的影响 ,西藏牦牛和野牦牛的纤毛虫组成最相似。从所检测地区的牦牛瘤胃液中都鉴别出了内毛属(Entodinium)的一个新种 ,且有高出现率 ,被命名为Entodiniummonuon.sp.。没有从与内蒙古牦牛一起饲养的牛瘤胃液中发现此新种。各地区饲养的牦牛瘤胃纤毛虫属组成彼此相似 ,内毛属是最主要的属 ,占51.9 %～61.0 %。各地区饲养的宿主动物纤毛虫平均密度约为105/ml。     

青海省大通种牛场牦牛育种工作的探讨

青海省大通种牛场科学利用野牦牛资源，通过给家牦牛导入野牦牛遗传基因，培育出了“青海大通牦牛”这一牦牛新品种，为我国牦牛杂交育种和改良工作开辟了新的途径。