一株鸭源H9亚型禽流感病毒的分离及鉴定

从发病雏鸭体内分离到1株具血凝活性病毒,并鉴定为H9亚型禽流感病毒。取发病鸭肺作为病毒分离病料,接种10日龄SPF鸡胚,死亡鸡胚尿囊液具血凝活性,且不能被已知鸡新城疫(ND)阳性血清、产蛋下降综合症EDS-76单克隆抗体、禽流感H5亚型阳性血清抑制,但能被禽流感H9亚型阳性血清抑制,血凝抑制价为211。该毒株经中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验室鉴定为H9N2亚型。对分离株进行的研究结果表明,该毒株为低致病力毒株,其ICPI为0.26,IVPI为0。用第三代鸡胚尿囊液原液0.5 m l静脉注射8日龄樱桃谷鸭,雏鸭死亡率达50%。     

肉鸽H9亚型禽流感的诊断与病毒分离及鉴定

通过分子PCR检测,初步证明在湖北一发病肉鸽群感染H9亚型禽流感病毒。病原分离后,盲传3代,其血凝效价达到109~1011,经生物学特性进行测定,其鸡胚半数致死量为107.5,9日龄鸡胚平均致死时间为54.3 h,1日龄雏鸡脑内接种致病指数为1.8,6周龄小鸡静脉接种致病指数为2.0,证明该H9亚型禽流感为毒力较强。将该病毒回归非免疫肉鸽,能产生典型的H9亚型禽流感症状,采集其肺、喉头、泄殖腔等病变组织进行病毒分离,均可分离到H9亚型AIV。     

一株肉鸡H9亚型禽流感病毒的分离鉴定及其对肉鸡增重的影响

从济南地区发病鸡群中分离到一株病毒,经血清中和试验和RT—PER鉴定为H9亚型禽流感病毒（命名为DJ07）,并对其ELD加、HI相关系数及HA基因序列进行了分析,将DJ07回归试验肉鸡,发现其能显著降低试验鸡的增重率,而且降低幅度比蛋鸡源性H9要大。     

鹌鹑H9亚型禽流感病毒的分离鉴定

2009年从湖北省某鹌鹑(Coturnix coturnix Linnaeus)饲养场送检的成年产蛋病死鹌鹑的肺、脑等实质器官中,分离到一株低致病力的禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV),经AIV-PCR检测、血清中和试验、AIVHA-HI试验、ND-HI试验,证明分离的AIV为H9亚型。人工感染30日龄鹌鹑做毒力测定,结果为低致病力毒株,该毒株自然感染能引起1%～3%的成年鹌鹑死亡。     

禽流感病毒H5和H9亚型RT-PCR检测方法的建立

根据H5和H9亚型的HA基因,设计合成2对特异性引物,分别建立了RT-PCR检测方法,优化了反应体系及反应条件,该方法敏感性可达10^-3,特异性好,与NFV、IBV与H5与H9相互间无交叉反应。利用所建立的RT-PCR检测了10份活禽及禽产品中存在的H5和H9亚型禽流感病毒,其检测结果与病毒的分离培养一致,比电镜和琼扩的检出率高30％,与其他NDV、IBV的病料无交叉反应,证明该方法具有很好的应用价值。     

一株鸭源H9亚型禽流感病毒分离株生物学特性研究

对分离到的1株鸭源H9N2亚型禽流感病毒(NJ01株)的生物学特性进行了研究。研究结果显示:其静脉致病指数IVPI为0,脑内致病指数ICPI为0.26,血凝解脱时间NHAT为慢,血凝热稳定时间HOT为30 m in。以108.0ELD50/羽的剂量静脉感染26日龄非免疫鸭,可使40%鸭致死,且从攻毒后存活鸭1 d+2 d喉拭子中100%分离到该病毒;而以相同剂量静脉感染1月龄SPF鸡后不出现死亡,但攻毒后4~6 d的泄殖腔拭子中,均可100%再分离到该病毒。毒株血凝素基因的RT-PCR试验结果显示,与1997年香港3个分离株的同源性为94.8%~96.0%,其HA裂解位点处氨基酸序列为-RSSRG-。研究结果表明该NJ01株为低致病性禽流感病毒,属欧亚大陆分支,在SPF鸡及非免疫鸭体内均能很好地复制。     

H9亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体制备及鉴定

[目的]制备H9亚型禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)单克隆抗体,为检测诊断AIV提供技术支持.[方法]以灭活H9亚型AIV广西分离株为免疫原,免疫6~8周BALB/c雌性小鼠,然后取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,经血凝抑制试验(HI)及间接免疫荧光试验(IFA)筛选H9亚型AIV血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞.[结果]经过4次亚克隆,获得3株稳定的H9单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为8A4、1B11和7F1细胞株,其细胞株培养上清液HI效价为27~210,腹水HI效价为216~219;单克隆抗体亚类鉴定结果表明,3株H9单克隆抗体均属于IgG1亚类,其轻链均为K链.3株H9单克隆抗体只与H9亚型AIV发生特异性HI反应,而与其他HA亚型AIV及新城疫病毒(NDV)、减蛋综合症病毒(EDS)、传染性支气管炎病毒(IBV)无交叉反应.3株H9单克隆抗体细胞株的抗体分泌能力稳定性良好.[结论]用灭活H9亚型AIV为免疫原能成功制备针对H9亚型AIV血凝素的单克隆抗体,且具有良好的亚型广谱性和特异性.     

禽流感病毒H9亚型感染发病的初报

通过流行病学调查、临床观察、病理剖检、血清学试验、病毒分离与鉴定，首次确诊了我区发生的Ｈ９亚型禽流感病毒引起的感染发病。此次疫情的死亡率较低（０．２２％～５．０８％），不属高致病性禽流感，但其所引起的以产蛋量下降为主的经济损失不容忽视。     

H9亚型禽流感病毒免疫磁珠分离方法初步建立

禽流感病毒(AIV)严重危害世界养禽业,是举世瞩目的重大人畜共患病原,环境中微量病原是潜在的重要传染源,很难进行监测。为了提高畜禽环境中微量病原的监测效率,样品的必要预处理非常重要。制备了粒径约30~100 nm的Fe_3O_4纳米粒子,并利用戊二醛二步法偶联H9-HA单抗和磁珠,偶联效率约为130 mg/g;200μL免疫磁珠(5.6 mg/m L)可分离纯化100μL血凝价为28的AIV-H9。制备的免疫磁珠可以为纯化和富集畜禽生活环境中的微量病原提供便利,结合其他病原检测手段将有助于提高环境中病原的监测效率。     

禽流感H11N9亚型病毒东方白鹳分离株的基因特征

根据已知禽流感病毒(AIV)的8个基因序列设计合成12对特异引物,通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,分别成功扩增出分离于东方白鹳(Ciconia boyciana)的1株H11N9亚型禽流感病毒的全基因序列,将其分别克隆到pMD18-T载体后进行序列测定。同时将8个基因片段与GenBank发表的相应序列进行比较,绘制各基因的进化树。结果表明:所克隆到的8个片段均包含相应病毒基因的完整开放阅读框架,长度分别为2280、2274、2151、1692、1497、1413、759、838bp核苷酸,分别编码759、757、716、563、498、470、252/97、230/121个氨基酸。该毒株HA有7个潜在糖基化位点;在HA裂解位点序列为PAIASR↓GLFG,无连续的多个碱性氨基酸插入,具有典型的低致病性禽流感病毒特征。根据该毒株与参考毒株的序列比较分析结果推测,该分离株可能是不同亚型禽流感病毒通过互相基因交换所形成的基因重组体。     

北京3株H9N2亚型禽流感病毒HA基因的序列分析

[目的]为了解2000年北京地区H9N2分离毒株的遗传特点。[方法]采用RT-PCR技术扩增了3株H9N2亚型禽流感病毒北京地区分离株的HA基因片段,并对所得序列进行分析比较。[结果]遗传演化分析表明,所分离的3个毒株的HA基因与其他中国内地和香港毒株的同源性分别为XU株84.8%（Dk/HK/Y439/97）～98%（Ck/GX17/00）,LIU株85.1%（Dk/HK/Y439/97）～99.1%（Ck/GX17/00）,BEI株90.7%（Ck/BJ/3/01）～99.1%（Ck/GX17/00）。氨基酸序列分析发现,3株病毒均为禽源低致病力毒株,226位氨基酸均为L（Leu）,更易于与人类细胞结合;HA蛋白存在7个糖基化位点。[结论]从分子水平分析,A/Chicken/Beijing/xu/00、A/Chicken/Beijing/bei/00和A/Chicken/Beijing/liu/00株属于低致病力的H9N2亚型禽源毒株。     

SPF种蛋重量对H9亚型禽流感病毒分离培养的影响

[目的]探索SPF种蛋重量对病毒分离培养的影响。[方法]以蛋形正常稍重(62～72 g)的SPF种蛋为试验组,适宜重量(50～60g)SPF种蛋为对照组,进行H9亚型禽流感病毒的分离培养试验。[结果]试验组和对照组SPF种蛋的受精率无明显差异,而且尿囊液的HA和HI效价无明显差异。[结论]在实验室可选用稍重的SPF种蛋进行病毒分离培养,既可充分利用SPF种蛋资源,又可节省试验经费。     

禽多杀性巴氏杆菌、H9亚型禽流感二联灭活疫苗研制及免疫效力试验

采用鸡胚共同增殖禽多杀性巴氏杆菌和H9亚型禽流感病毒的方法制备的抗原中含巴氏杆菌数≥4×1010CFU/mL、H9亚型禽流感病毒含量≥109.38EID50/mL,经灭活后制备3批二联灭活疫苗并进行了相关检验。结果表明,所研制的3批二联疫苗的物理性状、无菌检验以及安全检验均符合相关质量标准;用3批疫苗分别免疫试验鸡和试验鸭,21 d后对禽多杀性巴氏杆菌免疫保护率均为90%以上,对H9亚型禽流感免疫保护率均为85%以上。     

鸭H9亚型禽流感油乳剂灭活疫苗的免疫原性

对从发病雏鸭体内分离到的H9亚型禽流感病毒NJ01株[A/Duck/Nan jing/01/1999(H9N2)]进行了免疫原性研究。以含有108.0ELD50和108.5ELD50的NJ01进行静脉注射攻击无H9亚型禽流感抗体的26日龄、44日龄和140日龄鸭,结果显示,对小于44日龄和大于44日龄鸭分别以108.0ELD50和108.5ELD50病毒含量的NJ01株静脉攻击,攻毒后1~2 d的喉拭子病毒分离率均为80%以上。将病毒含量为107.9ELD50的NJ01株油乳剂灭活苗,肌肉途径免疫8日龄和28日龄鸭,在免疫后的第7 d、14 d和21 d用含108.0ELD50和108.5ELD50的NJ01静脉注射攻击,攻毒后取1~2 d喉拭子进行病毒重分离,结果表明,免疫后7 d产生抗体,14 d产生坚强免疫力,21 d相对保护率达100%。     

H7N9亚型禽流感病毒RT-PCR检测方法建立

【目的】2013年3月,中国国家卫生和计划生育委员会宣布在上海、安徽地区发现了人感染H7N9亚型流感病毒事件,由于这种新型重组H7N9流感病毒未曾有过感染人或者动物的报道,因此出现了一系列亟待解决的问题,引起了全世界范围的广泛关注。根据H7N9亚型禽流感病毒 HA和NA核苷酸序列,设计并合成靶基因为HA和NA的2对引物,建立快速检测H7N9亚型禽流感病毒的一步法RT-PCR检测方法。【方法】根据测序结果,用DNAStar生物软件进行同源性分析比较,选出H7和N9基因中高度保守且特异的核苷酸区域,用oligo6.0软件设计针对H7和N9基因的引物。用Trizol LS提取RNA,采用一步法Access RT-PCR扩增反应液,建立了一步法检测H7N9亚型禽流感病毒RT-PCR 方法。以H7N9亚型流感病毒为阳性对照,其他亚型流感病毒以及新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊等其他禽病病原作为阴性对照,按所建立的反应体系和反应程序进行RT-PCR反应,验证所建立方法的特异性。对病毒含量为 10^6.5 EID₅₀·mL^-1 的 H7N9 亚型禽流感病毒尿囊液依次进行 10 倍倍比稀释,提取RNA用RT-PCR 方法检测,评价其敏感性。另外,采取双盲试验用荧光定量RT-PCR对该方法进行了比对验证。【结果】用H7亚型特异性引物检测 H1-H15 亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他禽病病原,除H7亚型流感病毒外,其他样品均为阴性;用N9亚型特异性引物检测N1-N9 亚型禽流感病毒和其他禽病病原,仅当前流行的H7N9 亚型 AIV 样品有特异性目的条带,与其他N1-N9 亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他禽病病原均无交叉反应。通过对 H7N9亚型禽流感病毒尿囊液进行10倍倍比稀释检测,证实该方法最低检出量为 1.4×10^2.5 EID₅₀·mL^-1,并可以从阳性棉拭子浸出液中扩增出目的基因片段。【结论】该RT-PCR 方法具有特异性强和准确率高的特点,可以作为H7N9亚型AIV核酸检测的一种有效候选方法。     

左旋咪唑影响流感灭活疫苗（H9N2）抗体滴度

为了研究不同剂量的左旋咪唑对鸡流感病疫苗免疫效果的影响,将20只17日龄雏鸡,随机分成A、B、C、D四组,每组5只.分别皮下注射H9N2灭活疫苗0.5ml/羽,同时给试验组A(0.6mg)、B(0.3 mg)、C(0.15 mg)剂量的左旋咪唑,D组注射生理盐水作为对照.免疫后0、7、14、21和28天,翅下静脉采血检测抗H9N2亚型禽流感病毒抗体滴度.结果表明,给药组的抗体水平都明显高于对照组;不同给药剂量的组别的抗体水平也存在差别,0.6 mg、0.3 mg剂量组鸡只平均抗体水平基本一致,却明显低于0.15 mg的低剂量组.这表明左旋咪唑影响H9N2流感病毒疫苗抗体滴度,低剂量(0.15 mg)添加左旋咪唑,可提高疫苗的抗体水平.     

两种免疫增强剂对肉鸡H9N2禽流感病毒感染的保护试验

[目的]研究囊素肽和中草药添加剂——抗感康对肉鸡预防H9N2禽流感病毒感染的保护效果。[方法]选择120羽1日龄AA鸡,随机分为3组,即中草药组、囊素肽组和对照组,40只/组。中草药组从1日龄起饲喂添加有0.1%抗感康的混合饲料;囊素组在13日龄时颈部皮下注射囊素肽0.4ml;对照组在13日龄颈部皮下注射0.85%灭菌生理盐水0.4ml,并观察鸡的临床表现。在1、7、18、27、35和45日龄时,记录采食量和体重,计算试验各阶段和全期平均日增重、采食量和料重比。[结果]囊素肽和抗感康能阻止H9N2禽流感病毒的水平传播,提高肉鸡抵抗力,并显著提高鸡的生产性能（P〈0.05）。[结论]囊素肽和抗感康能明显增强鸡的免疫力并提高鸡的生产性能。     

检测H9亚型AIV的压电免疫传感器研究(英文)

[目的]研制检测H9亚型禽流感病毒的压电免疫传感器。[方法]用巯基丙酸在镀银电极石英晶体自组装巯基丙酸单分子膜再通过N-乙基-N'-(3-二甲氨基)丙基碳化二亚胺盐酸(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)偶联抗H9亚型禽流感病毒的特异性单抗构建传感器芯片,建立可以检测H9N2亚型禽流感病毒的免疫传感器。[结果]该方法具有较好的特异性,不与H5亚型流感病毒和新城疫病毒(NDV)反应,检测灵敏度达到20～100个EID50。[结论]该结果为检测禽流感病毒免疫传感器的进一步深入研究奠定了基础,这为其他相关病毒的监测提供了一种新途径。