三疣梭子蟹C-型凝集素的原核表达和活性检测

通过RT-PCR扩增三疣梭子蟹C-型凝集素（C-type lectin like-domain protein,CTLD）基因序列,将目的基因克隆入质粒pET32a,构建原核表达重组质粒pET32a-CTLD.将重组质粒转化入大肠杆菌BL21中,通过IPTG诱导CTLD的表达,对其表达产物进行SDS-PAGE和Western blot 检测.用His GraviTrap Ni亲和层析柱及超滤离心管纯化目的蛋白,并对其进行活性检验.结果表明,构建得到CTLD基因的原核表达载体,双酶切鉴定得到与预期片段相符的外源基因插入片段,经测序与目的序列完全一致;诱导表达出相对分子质量（M） 39 600的目的蛋白,经SDS-PAGE和Western blot检测,融合蛋白成功表达;重组C-型凝集素对兔的红细胞没有明显的凝集作用,但对小鼠红细胞的凝集效价是22,而对所选5种细菌的凝集作用存在差异,其中对大肠杆菌具有明显的凝集作用,而对溶藻弧菌、哈维氏弧菌、鳗弧菌和金黄色葡萄球菌均无凝集现象.本研究结果为进一步研究C-型凝集素在免疫防御中的作用与地位提供依据.     

盐度胁迫下三疣梭子蟹Ferritin基因的原核表达

为验证Ferritin基因是否对三疣梭子蟹的盐度胁迫具有适应性, 利用PCR扩增获得了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)第六对鳃的Ferritin基因, 将该目的基因克隆到表达载体pET28a(+)中, 转化大肠杆菌DE3(BL21), 并进行IPTG诱导表达。结果表明: 经诱导的转pET28-Ferritin重组质粒菌株有特异的表达蛋白条带出现, 与预期的理论值(19.448 kD)相符合; 高盐胁迫下, 转重组质粒的大肠杆菌比转pET28空载质粒存活率显著提高(P< 0.001), 并且随盐度升高, 两者差异越显著。这表明Ferritin基因能够提高大肠杆菌的盐度耐受力, 由此推测Ferritin基因参与了三疣梭子蟹盐度适应的生理过程。本研究旨在为生产过程中三疣梭子蟹养殖水体的盐度调控策略提供理论依据。

     

三疣梭子蟹B型清道夫受体蛋白的原核表达及细胞、组织分布

为研究B类Ⅰ型清道夫受体 (SCARB1/SR-BI)在中华绒螯蟹代谢、生长以及免疫等生物学过程中的分子功能,实验对中华绒螯蟹Scarb1的克隆及时空表达进行了分析,观察了RNA干扰该基因后的相关组织结构和类胡萝卜素含量变化,筛选了该基因的SNP标记并与生长相关性状进行关联分析。结果显示,中华绒螯蟹的Scarb1由2个外显子和1个内含子组成,开放阅读框为2 415 bp,编码805个氨基酸;系统进化分析显示中华绒螯蟹与三疣梭子蟹的氨基酸同源性高达80.51%,具有较高的物种间保守性。该基因在不同蜕壳时期的肝胰腺、肠道、血淋巴细胞、心脏、鳃和肌肉组织中均有表达,但在肝胰腺、肠道和血淋巴细胞中的表达量相对较高。RNA干扰Scarb1后,组织切片观察发现肝胰腺的肝小管管腔模糊并产生了部分空泡化结构,肠道内膜的肌肉层和黏膜下层处出现显著空洞现象;肝胰腺的颜色由黄色变成灰白色,其中的类胡萝卜素含量显著下降。在该基因的第一外显子筛选到1个SNP位点 (C432T)与蜕壳后体重和壳长增长率存在显著相关性。本研究结果为Scarb1在中华绒螯蟹的遗传研究和育种应用提供参考。     

盐度胁迫下三疣梭子蟹热休克蛋白HSP90a的原核表达

为证明三疣梭子蟹HSP90a蛋白与盐度胁迫的相关性,实验根据GenBank上提供的三疣梭子蟹HSP90a基因蛋白编码区序列,构建pET28-HSP90a原核表达重组质粒在大肠杆菌DE3(BL21)中进行的盐度胁迫表达。结果显示,转重组质粒的大肠杆菌生存率明显高于转空载体的大肠杆菌,越接近大肠杆菌盐度耐受极限值,两者差异越显著,在盐度胁迫最高值(1 050 mmol/L)下,两者差异达到10.7倍,说明在盐度胁迫下三疣梭子蟹HSP90a对大肠杆菌有保护作用,能显著提高大肠杆菌对盐度胁迫的耐受力。由此推测,HSP90a蛋白可能参与了三疣梭子蟹盐度适应的生理过程。     

三疣梭子蟹蜕皮激素受体EcR基因的cDNA克隆及表达分析

通过简并引物扩增及Smart TM Race技术,首次克隆了三疣梭子蟹Portunus trituberculatus蜕皮激素受体EcR基因cDNA全长序列。该基因全长2 996bp,编码一个由503个氨基酸组成的多肽,预测理论等电点pI为7.33,分子量大小为55.69kDa。同源性及系统进化分析表明,三疣梭子蟹EcR基因与青蟹、拟穴青蟹、大西洋招潮蟹、陆地蟹、美洲螯虾、褐虾、日本对虾的同源性分别为94%、90%、88%、84%、82%、73%、66%。荧光定量RT-PCR结果表明,EcR在肝胰腺、卵巢、肌肉、眼柄、鳃和心脏中均有分布,在肝胰腺中表达量最高,在心脏中最低。高盐(45)胁迫下,EcR基因的表达量在24h后显著低于对照组(P0.05),总体呈下降趋势;低盐(11)胁迫条件下,EcR转录组的表达量呈现先降低后上升的趋势,在12h达到最低,之后逐渐上升,在48h之后显著高于对照组(P0.05)。     

三疣梭子蟹卵巢发育期间孕激素受体的免疫识别与分布

为探讨三疣梭子蟹卵巢发育过程中孕激素受体（Progestin receptor, PR）的调控作用,采用免疫印迹和免疫组化方法,首次对三疣梭子蟹卵巢、肝胰腺、大颚器、Y器官、视神经节和胸神经团中的PR进行免疫识别和定位, 并系统研究了卵巢发育期间PR在这些器官中的分布和变化。结果表明：(1) 三疣梭子蟹视神经节中存在PR阳性条带,分子量约100kDa;(2) PR仅在早期(Ⅰ-Ⅲ期)生殖细胞胞质和后期(Ⅲ-Ⅴ期)细胞核呈强阳性, 但在各期滤泡细胞中始终呈强阳性; (3) PR阳性主要存在于Ⅰ-Ⅴ期肝胰腺F细胞和Ⅲ期R细胞核中, 其余肝胰腺细胞中均无PR阳性; (4) 大颚器腺细胞中的PR阳性仅发现于Ⅳ期腺细胞胞质中, 各期Y器官腺细胞中均呈PR阴性; (5) 就视神经节而言, PR主要存在于Ⅲ-Ⅴ期的神经细胞。就胸神经团而言, Ⅰ-Ⅴ期神经细胞中的PR阳性呈增强趋势, 而Ⅰ-Ⅴ期神经髓质中PR始终呈PR强阳性。以上结果暗示, 孕酮不仅可以通过与卵巢和肝胰腺中PR结合直接调控三疣梭子蟹的卵黄发生和卵巢发育, 还可能通过影响其它内分泌激素的合成和分泌来间接调控其卵巢发育。     

三疣梭子蟹雌性化育苗技术的研究

采用热休克法和冷休克法分别对胚胎处于第1极体、第2极体外排期、膜内无节幼体期及膜内蚤状幼体期的三疣梭子蟹亲蟹处理后进行室外水泥池育苗,幼体发育至Ⅲ期仔蟹(CⅢ)时每池随机取样3次,每次取样200只,在解剖镜下辨别雌、雄生殖孔的位置来确定雌性比例.结果显示,膜内无节幼体期热、冷休克处理和膜内蚤状幼体期热、冷休克处理的亲蟹成活率分别为80%、60%、80%和100%,幼体雌性比例分别为(57±0.5)%、(64±0.5)%、(56.5±0.5)%和(65±0.5)%.     

三疣梭子蟹幼体消化酶活力及氨基酸组成的研究

在三疣梭子蟹幼体发育过程中，五种消化酶活力表现出三种变化模式，其中胃蛋白酶和类胰蛋白酶活力呈上升趋势，而且在蚤状幼体Ⅰ期时就较高，淀粉酶活力逐渐减小，纤维素酶和脂肪酶活力极微。氨基酸含量随幼体发育逐渐增加。必需氨基酸中以亮氨酸含量最高，色氨酸含量最低；非必需所基酸中含量最高者为谷氨酸，最低者为胱氨酸。同时单个必需氨基酸含量与必需氨基酸总量的比值（Ａ／Ｅ）在幼体不同发展阶段略有差异，但基本趋于一致。     

三疣梭子蟹EcR基因的克隆及表达分析

为研究蜕皮激素受体(EcR)在甲壳动物生长和生殖过程中的作用,采用反转录PCR(RT-PCR)和cDNA 末端快速扩增(RACE)技术,克隆了三疣梭子蟹蜕皮激素受体 (PtEcR)基因全长cDNA序列(GenBank登录号:KC354381),运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法,分析该基因在不同组织、蜕皮时期和二次卵巢发育阶段的表达特 征。结果表明,PtEcR cDNA全长2 231 bp,包含1 269 bp ORF,编码422个氨基酸;推导的PtEcR氨基酸序列与已公布的其他甲壳动物EcR进行比对,发现一致性 达67%～97%;系统进化树分析PtEcR与其它甲壳动物EcR聚为一支,而昆虫EcR聚为另一支。PtEcR在检测的三疣梭子蟹10个组织中均有表达,其中在Y-器(YO)表达量最高。在蜕皮周期中,自蜕皮后期至蜕皮前期D2亚期PtEcR在YO中的表达量一直较低;至D3亚期和D4亚期,PtEcR表达量显著升高,这与血 淋巴中20-羟基蜕皮酮(20E)浓度在D3/D4亚期显著升高相协同,表明PtEcR在三疣梭子蟹蜕皮过程中起着重要的作用。二次卵巢发育阶段,PtEcR在YO和肝胰 腺(Hp)中的表达量自Ⅱ期逐渐升高至Ⅳ期达到最高;卵巢(Ov)中,则在Ⅰ、Ⅲ期较低,Ⅱ、Ⅳ期较高,表明PtEcR可能参与卵巢发育和卵黄发生。     

三疣梭子蟹核受体基因HR38的克隆及其在蜕皮中的表达分析

采用RACE技术,克隆出三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)核受体基因HR38的c DNA全长,命名为PTHR38。该基因c DNA序列全长为2950 bp,5′和3′非编码区(UTR)长分别为101 bp和551 bp,开放阅读框(ORF)长2298 bp。推测编码765个氨基酸,预测分子量为84.2 k D,理论等电点为6.3。生物学分析预测,PTHR38基因编码的蛋白属于不稳定蛋白,不具有跨膜结构域。同源性分析表明,PTHR38基因编码的氨基酸序列与大型溞(Daphnia magna)的同源性最高。实时荧光定量分析表明,PTHR38基因在蜕皮周期的各个组织中均有差异表达,在眼柄中表达差异最大。去除单侧眼柄后,PTHR38的表达量在整体上呈现不同程度的上升趋势。     

近缘新对虾cyclin B基因的克隆与原核表达

采用RACE技术,克隆了近缘新对虾cyclinB基因,该序列全长1 667 bp,编码区1 209bp共编码402个氨基酸,所推导的氨基酸序列N端不存在信号肽.BLAST比对后发现,其氨基酸序列与刀额新对虾的同源性达90％.经RT-PCR检测,cyclin B基因在近缘新对虾的卵巢和肌肉中表达水平最高,胸神经节和心脏次之,鳃、眼柄神经节、肝胰腺几乎没有表达.推测主要与cyclin B在细胞周期中调控细胞分裂的功能有关.原核表达结果显示,pET32a表达载体在0.2 mmol/L IPTG、25℃诱导4h条件下可得到纯度较高的分子量约67 ku的蛋白.     

三疣梭子蟹LGBP基因的重组表达及微生物结合实验

将扩增得到的三疣梭子蟹LGBP基因开放阅读框与表达载体pET-22b(+)连接,转化E.coil BL21(DE3)plysE后IPTG诱导表达。经SDS-PAGE检测,发现诱导组比空载体和未诱导组多出一条分子量约为41 ku的表达产物,与预测的重组蛋白分子量大小基本一致。重组质粒在不同IPTG浓度和不同温度条件下诱导表达产物的SDS-PAGE分析结果显示,低浓度0.4 mmol/L IPTG和30 ℃诱导能有效减少菌体蛋白的本底表达。用纯化的重组蛋白连续免疫小鼠,4周后得到抗血清,经Western-blotting检测,其具有很好的特异性。微生物结合实验表明,重组表达的pET-LGBP具有较强的生物活性,其与丹麦啤酒酵母、巨大芽孢杆菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、大肠杆菌等均有结合能力。     

梭子蟹肌孢虫的组织分布与形式特点

利用透射电镜技术研究了梭子蟹肌孢虫在三疣梭子蟹体内的组织分布和形式特点,结果显示,梭子蟹肌孢虫主要寄生在骨骼肌、血淋巴、鳃、胃和肠,而在心脏、肝胰腺、性腺和神经等部位未发现。在胃和肠的结缔组织以及骨骼肌中发现梭子蟹肌孢虫的分裂体,表明其可以在这些组织的细胞中增殖,尤其是在骨骼肌细胞中,大量不同发育时期的虫体显示了该虫对骨骼肌的亲嗜性。梭子蟹肌孢虫的分裂体以及其他增殖期的细胞仅寄生于宿主细胞内,而成熟的孢子可存在于宿主细胞内和细胞外基质中。梭子蟹肌孢虫的孢子有6种存在形式,在宿主细胞内和宿主细胞外基质中各有3种。孢子在宿主细胞内的存在形式:1孢子直接寄生于宿主细胞质中,自由游离,无膜包围;2孢子被单层膜包围,类微绒毛样突起物部分溶解,这种情况见于专业性吞噬细胞——无颗粒细胞内;3孢子被层状环形膜结构包围,类微绒毛样突起物清晰,这种情况见于非专业性吞噬细胞内。孢子在宿主细胞外基质中的存在形式:1孢子自由游离,无膜包围,类微绒毛样突起物清晰;2多个孢子被体液性被囊包围,类微绒毛样突起物清晰;3孢子无膜包围,孢外壁与类微绒毛样突起物消失。本研究阐明了梭子蟹肌孢虫在三疣梭子蟹体内的组织分布和孢子的存在形式,为进一步研究微孢子虫在宿主蟹体内的迁移规律提供了重要的基础数据。     

三疣梭子蟹钙调蛋白基因的克隆及在蜕皮中的功能分析

基于转录组数据库信息,采用RACE技术克隆获得三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)钙调蛋白基因(PTCaM)。该基因cDNA全长1981 bp,包含450 bp的开放阅读框,编码149个氨基酸,预测分子量16.8 k D,理论等电点为4.09。对序列进行生物信息学分析发现,PTCaM是一个高度保守的序列,具有EF家族典型的EF-hand钙离子结合域。同源性分析结果表明,PTCaM基因编码的氨基酸与果蝇和中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)的Ca M氨基酸序列覆盖率高达100%,与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)、克氏原螯虾(Procambarus clarkia)和仿刺参(Apostichopus japonicus)覆盖率高达99%。系统进化表明,PTCaM基因氨基酸序列与凡纳滨对虾、中华绒螯蟹和克氏原螯虾聚为一支。通过分析不同蜕皮时期各个组织中PTCaM的表达情况得知,该基因在蜕皮时期的各个组织中均出现差异性表达,并且差异显著,说明该基因参与蜕皮调控过程。     

龙须菜卤代烷烃脱卤酶基因的转录及原核表达

卤代烷烃脱卤酶(HLD)是一类能降解卤代脂肪化合物的酶,为今后将藻类HLD用于环境中卤素化合物的降解提供资料,本实验利用生物信息学、荧光定量PCR和pET28a表达系统对大型红藻龙须菜中HLD的酶学特性、转录表达和原核表达进行了研究。生物信息学分析结果显示,龙须菜中HLD基因(记为GlHLD)开放阅读框长969 bp,理论分子量约为36.33 ku,等电点约为5.53;该Gl HLD序列与绳状龙须菜的一条HLD序列(PXF45553.1)完全一致,与绳状龙须菜和皱波角叉菜等红藻优先聚类。荧光定量PCR结果表明,高温下底物1,2-二氯乙烷和植物激素水杨酸可促进GlHLD基因的表达,其表达量分别为常温组的3.64、2.64和2.43倍。GlHLD与pET28a质粒构建的重组载体在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达出具有脱卤酶活性的蛋白;该蛋白的最佳诱导条件为16°C、0.1 mmol/L IPTG诱导12 h,最后用镍柱对GlHLD蛋白进行了初步纯化。本研究为进一步了解藻类HLD家族及获得高纯度HLD酶奠定了基础。     

三疣梭子蟹甲基转移酶2基因克隆及在胚胎、幼体和性腺发育过程中的表达分析

本研究采用SMART RACE方法克隆了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)Dnmt2(Pt Dnmt2)基因。该基因c DNA全长为1291 bp,开放阅读框为1203 bp,编码400个氨基酸。结构域分析显示,PtDnmt2基因有典型的C5-DNA甲基化酶结构域。同源分析表明,PtDnmt2氨基酸序列与其他物种有较高的同源性。系统进化分析显示,三疣梭子蟹PtDnmt2氨基酸序列与罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)Dnmt2关系最近。qRT-PCR结果显示,PtDnmt2基因在三疣梭子蟹所有组织中均有表达,在卵巢中表达量显著高于其他组织(P0.05)。PtDnmt2基因在胚胎和幼体发育过程中的表达量随发育时期而变化,其在受精卵和多细胞时期无表达,从囊胚期开始出现,随着胚胎的发育表达量逐渐上升。在性腺发育不同时期PtDnmt2基因表达量存在显著差异,其在卵巢II期表达量最高,之后逐渐下降;在精巢中该基因的表达量随着精巢的发育逐渐上升,在IV期达到峰值。本研究结果表明,PtDnmt2基因参与了三疣梭子蟹胚胎、幼体和性腺发育调控。     

海豚链球菌兼职蛋白FBA的克隆表达、抗原性检测及免疫效果评价

为检测斑点叉尾鮰源海豚链球菌兼职蛋白(fructose-1,6-bisphosphate aldolases,FBA)的抗原性和潜在的疫苗价值,本实验克隆得到斑点叉尾鮰源海豚链球菌DX09(基因组登陆号LXQF01)的fba基因序列(基因登录号A7N10_RS06935),对克隆序列进行生物信息学分析,并通过原核表达得到重组FBA蛋白(r FBA),制备了兔抗r FBA血清用于FBA蛋白抗原性检测,同时通过免疫保护实验评估重组蛋白的免疫保护效果。结果显示,海豚链球菌DX09 fba基因有1个882 bp的开放阅读框(ORF),编码293个氨基酸。生物信息学分析显示,其分子式为C_(1378)H_(2172)N_(368)O_(422)S_8,分子质量为30.9 ku,理论等电点为5.01,不具有信号肽和跨膜区域;具有保守的裂解酶结构域,且与其他来源的FBA蛋白同源性达100%;具有较高的抗原指数,表明其可形成多个抗原表位。SDS-PAGE检测发现,诱导表达的重组蛋白以包涵体的形式出现在沉淀中,大小约为47 ku。Western blot分析表明,兔抗r FBA血清能特异性结合菌体蛋白。同时免疫保护实验显示,重组蛋白对斑点叉尾鮰的相对保护率可达55%,免疫后鱼体抗体水平相对对照组显著升高。本研究表明,原核表达的斑点叉尾鮰源海豚链球菌DX09 rFBA具备较好的抗原性和免疫保护作用,具有研发斑点叉尾鮰海豚链球菌亚单位疫苗的潜在价值。     

刀鲚MOR-2AK2的克隆、序列分析及组织表达

嗅觉是鱼类感知周围环境的重要工具,可能参与生殖洄游的过程。嗅觉由嗅觉受体(olfactory receptor)基因所编码的受体蛋白识别气味分子所引发,主嗅觉受体(MOR)基因是数量最大的一类嗅觉基因,可识别水溶性气味分子。为了弄清刀鲚定居型与洄游型种群的主嗅觉基因差异,本研究通过RACE技术获得了洄游型刀鲚MOR-2AK2基因,其开放阅读框长度972 bp,为单外显子结构,可编码323个氨基酸残基。预测表明,MOR-2AK2基因所编码的蛋白为7个疏水性的α-螺旋跨膜结构,属于G-蛋白偶联受体。对10种组织所作的定量分析表明,MOR–2AK2基因在嗅囊和性腺中的表达量远远高于其他组织器官,并且嗅囊中的表达量还高于性腺中的7~25倍。MOR–2AK2基因的表达量也存在性别差异,其中雌性嗅囊中的表达量约为雄性中的2倍,但精巢中的表达量却约是卵巢中的2倍。序列分析显示,MOR–2AK2基因的5′-UTR区域存在着一段微卫星序列(GT)5,其中定居型多出洄游型14个碱基(GTGTGTGTGTGTTT),这导致了二者所编码的氨基酸序列的相似度仅为84%。这些结果表明,MOR–2AK2基因不但与嗅觉功能有关,也可能参与了刀鲚的性腺发育或生殖洄游过程,同时也可能与定居型种群的形成相关。     

罗非鱼湖病毒核蛋白的克隆表达、抗体制备及其组织分布

近年来罗非鱼湖病毒(TiLV)在多个国家流行,对世界罗非鱼养殖业造成严重威胁。中国是罗非鱼第一养殖大国,尽管我国大陆还没有TiLV的正式报道,鉴于吉富罗非鱼是我国重要的罗非鱼养殖品种,其对TiLV的感染特性研究具有重要意义。本实验采用TiLV对吉富罗非鱼进行人工感染,随后在肝脏组织中克隆和测定了TiLV第6片段基因。罗非鱼湖病毒第6片段基因cDNA全长1 044 bp,开放读码框(ORF)为954 bp,编码317个氨基酸,预测分子量为36.38 ku;5′非编码区(NCR)为19 bp,3′非编码区(NCR)为972 bp。系统进化树分析表明该蛋白属于TiLV核蛋白(NP)。随后在大肠杆菌中表达和提纯了GST融合NP蛋白,在新西兰大白兔上制备了多克隆抗体。通过酶联免疫吸附实验(ELISA)检测抗体效价为1∶51 200,且抗体可特异性识别感染组织中的病毒NP蛋白。对吉富罗非鱼不同组织进行苏木精—伊红(H.E)染色观察,发现肝脏组织坏死并形成合胞体,脾脏部分细胞出现空泡、坏死,含铁血黄素增多,头肾细胞坏死,鳃丝上皮细胞明显解离脱落,鳃小片黏连,脑组织细胞肿大。通过蛋白印迹法(WB)和免...