转TPSP融合基因小麦植株的获得及抗旱性初步鉴定

为了培育抗旱小麦新材料,在构建舍大肠杆茵海藻糖-6-磷酸合成酶基因(otsA)和海藻糖-6磷酸磷酸酯酶基因(otsB)融合基因TPSP的表达栽体pBS-ATPSP的基础上.利用花粉管通道法对小麦品种豫麦34和豫麦18进行了遗传转化.两个品种共处理2 495朵小花,获得T0代种子1 611粒.两个品种分别获得T1代小麦植株857和659株,经PCR鉴定转基因植株分别为11株和7株.通过半定量RT-PCR技术对4个T2代转基因株系中融合基因TPSP的表达分析显示,3个株系中TPSP基因受水分胁迫而诱导表达,其中2个株系在温室进行的干旱胁迫鉴定中表现出较强的抗旱能力.     

转即SP融合基因小麦植株的获得及抗旱性初步鉴定

为了培育抗旱小麦新材料,在构建含大肠杆菌海藻糖-6-磷酸合成酶基因（otsA）和海藻糖-6磷酸磷酸酯酶基因（otsB）融合基因TPSP的表达载体pBS-ATPSP的基础上,利用花粉管通道法对小麦品种豫麦34和豫麦18进行了遗传转化。两个品种共处理2495朵小花,获得T0代种子1611粒。两个品种分别获得T1代小麦植株857和659株,经PCR鉴定转基因植株分别为11株和7株。通过半定量RT—PCR技术对4个T2代转基因株系中融合基因TPSP的表达分析显示,3个株系中TPSP基因受水分胁迫而诱导表达,其中2个株系在温室进行的干旱胁迫鉴定中表现出较强的抗旱能力。     

转RD29A:DREB1A融合基因小麦的获得及其抗旱性研究

为了提高小麦的抗旱能力,通过转基因将拟南芥 RD29A:DREB1A转入到小麦品种陇春30中,成功获得三个单拷贝本底DREB1A蛋白低表达水平的纯合转基因家系,并在干旱胁迫下测定了其生理指标及产量相关农艺性状。结果表明,与陇春30相比,转基因小麦的脯氨酸和可溶性糖含量以及SOD、CAT和POD活性都显著提高,H₂O₂含量、MDA含量和相对导电率均显著降低,株高、穗长、穗粒数、千粒重、地上生物量显著增加,说明 RD29A:DREB1A外源基因的导入能够显著增强陇春30的抗旱性。     

基因枪法介导转人工合成Rs-AFP2基因小麦的获得和检测

萝卜（Raphanus sativus）抗菌肽Rs—AFP2在体外强烈抑制小麦赤霉病菌（Fusarium graminenrum）、黄色镰孢菌（Fusarium culmorum）、烟草赤星病（Alternaria longipes）的菌丝生长。为了研究Rs-AFP2在小麦抗病育种上的应用潜力,人工合成了Rs-AFP2基因。通过基因重组技术（包括限制性内切酶酶切和连接）,将人工合成的R以FP2基因替代单子叶高效组成型表达栽体pAHC25中的GUS基因,构建了R￡AFP2基因的单子叶高效表达栽体pUAFP2。该栽体除携带受Ubiquitin启动子控制的Rs-AFP2基因表达盒外,还具有1个受Ubiqutin启动子控制的Bar基因表达盒,后者可为后续利用除草剂Bialaphos筛选转化再生植株提供抗性;采用基因枪法轰击小麦品种扬麦12、济麦19、晋麦47和豫麦34幼胚共4042个,经过2～3次Bialaphos筛选,最终获得扬麦12再生植株316株;利用高效表达栽体pUAFP2的Bar和Rs-AFP2基因的特异引物对上述成活的转化植株进行PCR检测,获得Bar和Rs-AFP2基因均为阳性的植株58株,转化率为1．43％。     

转WYMV-Nib8基因抗黄花叶病小麦的鉴定及优良株系的选育

小麦黄花叶病是我国冬麦区亟待解决的重要病害之一。为了给应用病毒复制酶基因介导的转基因抗病小麦新品种（系）选育提供依据,对利用基因枪法将WYMV-Nib8基因和bar基因共转化扬麦158获得的15个T2代株系进行了黄花叶病抗性鉴定,筛选出4个高抗病株系和1个剔除bar基因的高抗病株系;连续多年抗病性鉴定结果表明,通过转基因技术获得的5个株系不但抗病性优良而且可以稳定遗传。以转基因材料为亲本之一,通过常规杂交、回交获得1个兼抗小麦黄花叶病和白粉病且农艺性状优良的新品系BR1014。     

披碱草(Elymus dahuricus)焦磷酸化酶基因EdHP1的克隆及功能鉴定

为了从抗逆性优良的牧草中挖掘新的耐盐、抗旱基因,进而为作物分子育种提供优良的基因资源,采用RACE(Rapid-Amplification of cDNA Ends)方法,克隆了披碱草的焦磷酸化酶基因EdHP1,其全长序列包含2310bp,编码770个氨基酸,含有14个跨膜区,是一个典型的膜蛋白,同时包舍三个保守区(CS1、CS2和CS3).氨基酸同源性比较发现,EdHP1与来自大麦等10种高等植物的焦磷酸化酶基因的同源性大于86%.EdHP1基因的表达受干旱、高盐和低温等非生物胁迫的诱导.功能分析证明,EdHP1基因能够显著提高转基因烟草对干旱、高盐胁迫的抗性,可用于作物的抗逆遗传改良.     

小麦5 10亚基基因转化研究

为了获得具有优质亚基基因的小麦转化植株，以豫麦18号和豫麦21号两个基因型的小麦幼胚为受体，利用基因枪法将重组质粒pCAMBIA1301-Sub5 10导入小麦幼胚，分别获得18株和20株再生植株，经PCR检测分别有7株和10株同时扩增到5亚基和10亚基的目标片段，初步表明外源目标基因已整合到小麦的基因组中。     

转EPSPS基因大豆植株中蛋白的表达

采用ELISA定量测定法研究了转EPSPs基因大豆不同生长时期不同器官中CP4 EPSPS蛋白含量的变化.结果表明:转EPSPS基因大豆不同器官在不同牛育期CP4 EPSPS蛋白含量表现出较大的差异,R8期籽粒中的CP4EPSPS蛋白含量在所有时期和所有组织中蛋门含世最高;上位叶和下位叶中CP4 EPSPS蛋白除V3～V5期和R8期外的表达趋势一致,茎上部和茎下部中CP4 EPSPS蛋白在不同时期表达动态趋势基本一致,根中CP4 EPSPS蛋白含量存V3～V5期下降,然后逐渐升高,R1～R8期有一个大幅度的下降过程.从V1期至R8期,随着植株的不断生长,各组织中CP4 EPSPS蛋白的含量有明显的变化.     

转植酸酶基因玉米的获得及其后代的初步鉴定

构建了仅含有启动子序列、植酸酶基因和终止子序列的线性基因转化元件(UPN)及其两端分别带有T-DNA边界序列(T-UPN)和一段载体序列(V-UPN)的不同线性转化元件,不含选择性标记基因和载体骨架序列,采用花粉管通道法对选定的玉米自交系进行转化,对728株T1代转化玉米PCR检测。结果表明,UPN、T-UPN、V-UPN 3个转化元件的阳性率分别为0.44%、2.2%和1.8%,平均转化率为1.5%。检测时,以种子在果穗上的不同位置分别播种、检测。结果表明,PCR阳性株都是来源于第5～9圈的种子,这个部位的阳性率达到3.57%,说明花粉管通道法转化玉米的成功率与种子结实的位置有关。植酸酶比活结果说明外源基因在转化玉米植株内实现了蛋白质水平的表达。     

转抗除草剂基因小麦植株的筛选方法研究

为了降低小麦转bar基因时产生较高比例的假阳性植株,采用测定T0代转基因植株叶片释放NH4 浓度和对T1代植株喷施Basta除草剂等辅助筛选方法,建立了简便有效的转bar基因小麦筛选体系。研究结果表明,2叶期和5叶期叶片释放的NH4 浓度与bar基因PCR检测结果呈极显著相关,相关系数分别为0.86和0.75。对391株T0代再生植株进行叶片释放NH4 浓度测定,筛选到34株转基因植株,其中27株为bar基因的PCR检测所证实。用100 mg/L Basta除草剂对381株T0代植株的后代(3 800余株)进行喷施筛选,根据后代抗性分离筛选到13株T0代阳性植株,与PCR检测结果吻合度达到100%。这两种方法可用于以bar基因为选择标记基因的转基因植株的筛选。     

Cloning and Comparative Studies of Seaweed Trehalose-6-Phosphate Synthase Genes

The full-length cDNA sequence (3219 base pairs) of the trehalose-6-phosphate synthase gene of Porphyra yezoensis (PyTPS) was isolated by RACE-PCR and deposited in GenBank (NCBI) with the accession number {"type":"entrez-nucleotide","attrs":{"text":"AY729671","term_id":"56718401","term_text":"AY729671"}}AY729671. PyTPS encodes a protein of 908 amino acids before a stop codon, and has a calculated molecular mass of 101,591 Daltons. The PyTPS protein consists of a TPS domain in the N-terminus and a putative TPP domain at the C-terminus. Homology alignment for PyTPS and the TPS proteins from bacteria, yeast and higher plants indicated that the most closely related sequences to PyTPS were those from higher plants (OsTPS and AtTPS5), whereas the most distant sequence to PyTPS was from bacteria (EcOtsAB). Based on the identified sequence of the PyTPS gene, PCR primers were designed and used to amplify the TPS genes from nine other seaweed species. Sequences of the nine obtained TPS genes were deposited in GenBank (NCBI). All 10 TPS genes encoded peptides of 908 amino acids and the sequences were highly conserved both in nucleotide composition (>94%) and in amino acid composition (>96%). Unlike the TPS genes from some other plants, there was no intron in any of the 10 isolated seaweed TPS genes.     

香蕉MaTPS4基因序列及表达特性分析

通过随机克隆测序法从香蕉根系c DNA文库中获得海藻糖合成酶基因,命名为MaTPS4,全长c DNA序列为2 930 bp,含一个完整的开放阅读框2 574 bp,编码857个氨基酸。生物学信息分析表明,MaTPS4蛋白属于不稳定、疏水性蛋白,pI5.59,结构域TPS和TPP。序列预测分析表明,MaTPS4蛋白定位于细胞质中,具有3个跨膜区域,不存在信号肽。与其他已知植物TPS氨基酸序列同源比对,同源性达到84.90%;进化关系分析表明,香蕉MaTPS4氨基酸与银杏TPS氨基酸序列(AAX16014.1)聚为一类,二者亲缘关系较近,同源性为99%。器官特异性分析表明,MaTPS4在香蕉根系、球茎、假茎、叶、花、果实各器官中均有表达,其中球茎、假茎、叶片和花中表达量较大,根及果实中表达量极少。q RT-PCR分析表明,MaTPS4在根系中的表达经干旱、盐胁迫后均增强,其中盐胁迫24 h时MaTPS4表达量较0 h时高5倍;冷胁迫下,MaTPS4表达量增加,并随时间延长下降,在6 h达到最大;ABA胁迫下,MaTPS4表达量增加,为0 h的5倍;在ACC和Foc TR4胁迫下,MaTPS4表达无变化。因此,MaTPS4可能通过依赖ABA途径调控抗逆胁迫相关基因表达,提高植株对非生物胁迫的抗逆性。     

粗厚山羊草细胞质对普通小麦耐盐性的遗传效应

以具有粗厚山羊草(Aegilops crassa 6x)细胞质的异源细胞质小麦为材料，采用加盐培养基进行幼穗愈伤组织诱导(生长)、盐溶液种子发芽、盐溶液幼苗培养和戍株模拟盐池生长等方法研究了粗厚山羊草细胞质对小麦耐盐性的遗传效应，旨在为小麦耐盐育种提供理论依据和种质资源材料。结果表明：粗厚山羊草细胞质对小麦的耐盐性具有明显的遗传效应，其效应值的性质、大小与核亲本品种的基因型有关，在特定的核质组合中粗厚山羊草细胞质可明显提高小麦的耐盐性。异质系Ae.crassa 6x-鉴26和Ae.crassa 6x-SMH1694在幼穗愈伤组织诱导、种子发芽阶段和三叶期的耐盐性比相应核亲本明显增强。返青期和成熟期的鉴定结果表明，一些经核基因型改良的粗厚山羊草细胞质小麦的耐盐性超过或接近抗盐对照品种科遗26。进一步研究粗厚山羊草细胞质提高小麦耐盐性的遗传机制，必将拓宽小麦耐盐育种途径。     

干旱胁迫下小麦葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因TaG6PDH1的表达特征及启动子分析

为进一步揭示小麦抗旱性的生物学机理,通过电子克隆和RT-PCR方法,在水源11小麦叶片中分离得到1个新的小麦葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因TaG6PDH1后进行基因序列特征和启动子元件组成分析,并利用实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技术对其在PEG模拟干旱胁迫下的表达特征进行分析。结果表明,TaG6PDH1基因的cDNA全长1 338 bp,编码445个氨基酸。TaG6PDH1蛋白具有典型的G6DPH结构,即C-端葡萄糖-6-磷酸结合激活序列、N-端NAD（P）结合位点和C-端保守的Cys位点。系统进化分析表明,TaG6PDH1蛋白与质体型G6PDH中的P2型相似性较高,其与OsG6PDH5有极高的同源性。启动子区域分析表明,所选区域包含核心启动子和上游应答元件,该区域为TaG6PDH1基因转录的启动子区域,在该区域存在的顺式作用元件有ERF1与HMG-I/Y等,在调控植物防卫反应中有重要的生物学意义。qRT-PCR分析表明,TaG6PDH1基因在PEG模拟干旱胁迫下从6 h开始被上调,48 h被上调最大,说明TaG6PDH1基因参与了小麦干旱应答防卫反应,其可能作为一种正调控因子参与到小麦的防卫反应信号途径中。     

玉米C_4型全长pepc基因导入普通小麦的研究

为了获得具有类似C4光合途径的转pepc(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶)基因小麦材料,采用基因枪法将玉米C4型全长pepc基因导入小麦材料01H186-20-24,经在含4 mg.L-1L-PPT(L-phosphinothricin,草丁膦)的培养基上筛选,获得抗性再生植株,经PCR检测获得118株T0代阳性植株;进一步利用PCR对T1代植株进行筛选,T2代在隔离条件下种植于大田,Southern blot、SDS-PAGE检测表明,外源pepc基因在小麦基因组中得以整合和表达。测定了40个转基因T2代植株和受体对照的净光合速率(Pn)、PEPC活性,结果表明,在大田自然条件下,82.5%的转基因小麦的Pn增加,最大提高18.57%,达到了28.1μmol CO2.m-2.s-1,转基因植株中PEPC活性为对照的1.5~1.98倍。     

冬小麦不同抗旱品种抽穗期干旱诱导蛋白差异与抗旱性的研究

为了确定抗旱小麦新品种的分子鉴定指标,选用5个不同小麦生态类型区共18个新品种,采取盆栽与人工干旱胁迫及SDS-PAGE等方法,研究了抽穗期干旱胁迫诱导蛋白差异与抗旱性的关系。结果表明,根据抗旱指数和反复干旱存活率可将参试品种(系)分为高抗、中抗和低抗3种抗旱类型。提取旗叶蛋白质进行SDS-PAGE分析,发现在水分胁迫条件下一些高分子量的蛋白降解成一些小分子量的蛋白和多肽,其中分子量为66．2kD左右的D-差异蛋白在高抗、中抗旱品种(系)中均有出现,故D-差异蛋白可以作为抗旱小麦新品种筛选和鉴定的分子指标。     

119份春小麦种质萌发期抗旱性鉴定及抗旱相关基因表达特性分析

为了解不同小麦种质萌发期抗旱性强弱,以20% PEG6000溶液模拟干旱胁迫,对119份春小麦萌发期种子发芽势、种子发芽率、根鲜重、根干重、苗鲜重、苗干重、叶鲜重、叶干重、根长和苗长进行测定分析,并综合评价其抗旱性。结果表明,种子发芽势、种子发芽率、苗鲜重、苗干重、叶鲜重和苗长可以作为评价春小麦萌发期抗旱能力的主要指标,并筛选出了1份抗旱型材料、36份较抗旱型材料、43份较敏感型材料和39份敏感型材料。为进一步研究抗旱相关基因在抗旱型与干旱敏感型材料萌发期响应干旱胁迫的表达特性,从而验证抗旱材料鉴定的准确性,以筛选出的2份抗旱性最好的种质（蒙茬1号、黑穗）和2份干旱敏感型种质（09594、K250）为材料,利用qRT-PCR对其在不同时长（0 h、1 h、6 h、12 h、24 h）的20% PEG6000胁迫下 TaNAC29、 TaC2DP1、 TaDLEA3、 TaCP 、 Taα-AMY 和 TaGPX 的表达特性进行分析表明,随着胁迫时间的增加,以上6种基因在小麦叶片和根系中均上调表达,表达量均在胁迫24 h时达到峰值,且 TaNAC29、 TaDLEA3、 TaCP 和 TaGPX 在根系中的表达量均明显高于叶片,而 TaC2DP1和 Taα-AMY 在叶片中的表达量更高;此外,抗旱材料蒙茬1号和黑穗中6种基因的表达量均高于敏感材料09594和K250。     

茶树中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因（CsG6PDHs）的克隆与表达分析

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（Glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PDH,EC1.1.1.49）是戊糖磷酸途径中的关键限速酶,在植物逆境胁迫响应和生长发育中具有重要作用。然而,目前有关G6PDH在茶树中的研究尚处空白。在茶树中克隆到3个CsG6PDHs基因,分别命名为CsG6PDH1（MW025829）、CsG6PDH2（MW025830）、CsG6PDH4（MW025831）。聚合进化树结果显示,CsG6PDH1和CsG6PDH4均为质体型蛋白,而CsG6PDH2为胞质型蛋白。表达分析发现,CsG6PDHs在不同组织中均有表达;低温或炭疽菌侵染条件下,CsG6PDH1和CsG6PDH4均被抑制表达;冷驯化期间,CsG6PDH2和CsG6PDH4在不同品种中均上调表达;此外,CsG6PDHs在茶芽休眠和萌发过程中均不同程度上调表达。以上结果表明,CsG6PDHs在茶树生长发育和逆境胁迫响应过程中发挥着重要作用,这为后续深入研究G6PDH在茶树中的功能奠定了理论基础。     

宁夏小麦TaNrx-B1和TaFer-A1基因组成及其与相对发芽率的关系

为给抗旱小麦品种选育和评价提供依据,以117份宁夏小麦品种(系)为材料,鉴定种子萌发期相对发芽率,并利用抗旱相关分子标记检测TaNrx-B1和TaFer-A1基因组成,分析两基因组成分布特点,通过表型与基因型比较分析评价2个基因分子标记的有效性,同时筛选抗旱相关基因组成。结果表明,宁夏地区小麦种子萌发期总体平均相对发芽率为73.3%,变异范围为25.8%~98.2%;中等及以上抗旱性等级品种(系)占75.2%,达到供试材料的四分之三。宁夏小麦品种(系)中TaNrx-B1基因存在2种单倍型TaNrx-B1a和TaNrx-B1b,分别占供试材料总数的65.0%和35.0%,平均相对发芽率分别为71.4%和62.6%;TaFer-A1基因也存在两种单倍型TaFer-A1a和TaFer-A1b,分别占总数的74.4%和25.6%,平均相对发芽率分别为67.3%和62.2%。在两个基因的4种单倍型组合中,TaNrx-B1a/TaFer-A1a、TaNrx-B1a/TaFer-A1b、TaNrx-B1b/TaFer-A1a和TaNrx-B1b/TaFer-A1b依次占46.2%、8.5%、15.4%和29.9%,其种子的平均相对发芽率依次为70.7%、68.3%、65.1%和61.8%;相关分析发现,TaNrx-B1a/TaFer-A1a单倍型组合是抗旱类型组合,TaNrx-B1b/TaFer-A1b单倍型组合是非抗旱类型组合。综上所述,宁夏小麦种子萌发期总体抗旱性较强,以TaNrx-B1a/TaFer-A1a组合类型品种(系)的平均相对发芽率最高,所占比例也最多,两个基因的抗旱相关分子标记可用于小麦抗旱性初步鉴定和筛选。