水稻白叶枯病黄单胞菌编码顺乌头酸酶的rpfA基因的鉴定

通过生化功能分析，证实了水稻白叶枯病黄单胞菌野生型菌株Ｔ３０００产生两种顺乌头酸酶（分别命名为ＸｏｏＡｃａｎＡ和ＸｏｏＡｃａｎＢ）。通过三亲本接合的方法，将获得的含水稻白叶枯病黄单胞菌ｒｐｆ基因簇的重组质粒ｐＧＸＮ３０００导入甘蓝黑腐病黄单胞菌ｒｐｆＡ基因突变体８４７６中。经生化功能分析证实，８４７６／ｐＧＸＮ３０００中含有水稻白叶枯病黄单胞菌的顺乌头酸酶ＸｏｏＡｃａｎＡ；同时还证实了ＰＧＸＮ３０００能互补８４７６，恢复其合成胞外酶和胞外多糖的能力及致病性．这表明在ＰＧＸＮ３０００中含有一个完整的水稻白叶枯病黄单胞菌的顺乌头酸酶基因，该基因具有类似甘蓝黑腐病黄单胞菌ｒｐｆＡ基因的功能．因此将该基因命名为水稻白叶枯病黄单胞菌ｒｐｆＡ基因。     

水稻白叶枯病黄单胞菌中与甘蓝黑腐病黄单胞菌致病因子调控基因(rpf 基因)同源基因的分子克隆

DNA-DNA 杂交结果表明,水稻白叶枯病黄单胞菌总 DNA 中存在着与甘蓝黑腐病黄单胞菌致病因子调控基因(rpf 基因)具有同源性的 DNA 外段.应用广谱性寄主载体pLAFRI,在大肠杆菌中建立了水稻白叶枯病黄单胞菌野生型菌株 T3000的基因文库.从文库中筛选到与 rpf 基因具有同源性的克隆 pGXN3000,将重组质粒 pGXN3000通过三亲本接合转入甘蓝黑腐病黄单胞菌 rpf 基因突变体,发现 pGXN3000能互补甘蓝黑腐病黄单胞菌 rpf突变体,恢复其致病性胞外酶和胞外多糖的产生及致病性.转座子 Tn5诱变,缺失分析及DNA-DNA 杂交实验结果表明,重组质粒 pGXN3000中确实含有与甘蓝黑腐病黄单胞菌编码。双组份调控系统”蛋白的 rpfC 基因功能相同的基因,此基因被定位于 pGXN3000中的3kb BamHl 片段中。     

FR—008聚酮合成酶基因的DNA序列分析

多烯类抗生素ＦＲ－００８基因簇中邻近于ｐａｂＡＢ基因的３．８ｋｂ片段的ＤＮＡ序列分析显示出３８０１ｂｐ的ＤＮＡ上存在着一个较大的不完整的２６７１ｂｐＯＲＦ，由这一ＯＲＦ推导出的蛋白质与Ｉ型聚酮合成酶及Ｉ型脂肪酸合成酶具有较强的同源性；推导出的蛋白氨基酸序列与夹竹桃霉素、红霉素聚酮合成酶中的β－酮合成酶及乙酰转移酶结构域中的保守氨基酸的排列非常一致。这一结果表明，３．８ｋｂ片段中不完整的ＯＲＦ编码     

水稻白叶枯病黄单胞菌rpfF基因的定位及其在致病调控中的作用

检测到水稻白叶枯病菌能产生一种“跨菌调控因子”，在固体平板上，这种因子由白叶枯病菌分泌到细胞外后可以扩散并进入甘蓝黑腐病菌，调控甘蓝黑腐病菌致病因子的表达．本研究从水稻白叶枯病菌中克隆鉴定了一个与这种“跨菌”调控因子合成有关的基因ｒｐｆＦ，通过转座子诱变和标记置换（ｍａｒｋｅｒｅｘｃｈａｎｇｅ）技术，构建了ｒＰｆＦ突变体，突变体丧失了产生这种“跨菌”调控因子的能力，在水稻植株上的致病能力明显减弱，ＤＮＡ序列分析得知ｒｐｆＦ基因编码的产物和大肠杆菌的３－酮脂酰－ＣＯＡ硫解酶（３－ｋｅｔｏａｃｙｌ－ＣＯＡｔｈｉｏｌａｓｅ）同源。     

固氮粪产碱菌nifH基因的亚克隆及其启动子的核苷酸序列分析

采用＾３２Ｐ标记的巴西固氮螺菌Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ Ｓｐ７ ｎｉｆＨ ＤＮＡ探针，对不同限制性内切酶完全酶解的粪产碱菌Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ Ａ１５０１总ＤＮＡ进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析，证明在粪产碱菌中存在与ｎｉｆＨ同源的ＤＮＡ序列。在不同ＮＨ４＾＋浓度下测定ｎｉｆＨ－ｌａｃＺ融合基因在粪产碱菌结合子中的β－半乳糖苷酶活性，结果证明该融合基因的表达受     

应用gfp对盐单胞菌C6可能转座酶A基因启动区的鉴定

盐单胞菌（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）Ｃ６与耐盐有关的可能转座酶Ａ基因长１７０７ｂｐ,编码５６８个氨基酸,其上游１￣１７１ｂｐ ＤＮＡ区域内含有核糖体结合位点ＧＡＧＧ和类似于大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐｒｏＵ、ｐｒｏＰ和ｇａｌｐＩ、枯草牙胞杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）白基因ｇｆｐ为报告基因,启动子探针载体ｐＨＮ１２７为载体质粒,通过亚克隆,在ｐＨＮ１２７无启动子的ｇｆｐ基因上游插入了包     

番茄中反义ACC合成酶基因的导入与乙烯生物合成的控制

利用农杆菌ＬＢＡ４４０４携带反义ＡＣＣ合成酶基因和卡那霉素抗性基因，采用叶盘法转化番茄栽培品种“丽春”子叶，通过组织培养获得了能在卡那霉素培养基上生长的再生植株并进一步培养获得了延缓成熟和衰老的番茄果实。经过ＤＮＡ杂交和ＲＮＡ杂交检测，证明反义ＡＣＣ合成酶基因已插入番茄基因组中，并顺利地表达。     

蜂毒溶血肽（melittin）的cDNA克隆

本项研究从处于活跃表达蜂毒溶血肽时期的蜜蜂蜂王毒腺中提取了总ＲＮＡ，经生物素标记的多层纤维素亲和层析，分离出蜂毒溶血肽的ｍＲＮＡ，再经ｍＲＮＡ－ｃＤＮＡ反转录，合成了蜂毒溶血肽的ｃＤＮＡ，并将其克隆到了表达载体λｇｔ１１上，建立了ｃＤＮＡ文库；经对重组噬菌斑显以筛选和对蜂毒溶血太基因的ＰＣＲ检测及对产物的免疫检测，证明蜂毒溶血肽的ｃＤＮＡ克隆成功，得到十二个了性反应的克隆。     

转座子诱变甘蓝黑腐病黄单胞菌所获胞外多糖突变体的验证

利用转座子Ｔｎ５ｇｕｓＡ５上的抗性基因,通过“鸟枪法”克隆到用这种转座子诱变甘蓝黑腐病黄单胞菌所获得的三个胞外多糖突变体菌株Ｔ１０６、Ｔ１１３和Ｔ１１７中的转座子及其相邻序列的ＤＮＡ片段,并利用含有这些片段的重组质粒,通过标记置换构建了突变体。通过检测标记置换突变体的胞外多糖产量及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交,证实了胞外多糖突变株Ｔ１０６、Ｔ１１３和Ｔ１１７不仅确系转座子插入所致,而且转座子插入的位点分布在染色体的不同区域。从而证实了我们所报道的诱变体系是可行的     

DNA芯片技术应用研究进展

DNA芯片技术是近年迅速发展的一门生物高新技术 ,其突出特点在于高度并行性、多样性 ,即能一次性对生物遗传信息进行大规模的快速、同步分析。DNA芯片技术目前已用于基因重复测序、基因表达分析、新基因的发现、基因单核苷酸多态性 ( SNPs)研究、基因诊断、药物筛选等领域 ,而且其应用范围还在不断扩展。本室运用这一新技术 ,检测水稻在受水稻黄单胞菌水稻致病变种及该菌株的 rpf C基因缺失突变体感染时基因表达的差异 ,发现一些基因可能与水稻抗白叶枯病相关     

水稻白叶枯病菌rpfC基因DNA序列的测定分析

ｒｐｆＣ是甘蓝黑腐病菌中全局性调控胞外酶和胞外多糖合成以及致病性的一个基因簇中的一个基因。已从水稻白叶枯病菌中鉴定和克隆到一个在功能上能互补甘蓝黑腐病菌的ｒｐｆＣ突变体的基因，并通过构建突变体证实了这一基因在水稻白叶枯病菌致病性中起重要作用。本研究对水稻白叶枯病菌的这一基因的ＤＮＡ序列进行了测定分析，结果表明，它与甘蓝黑腐病菌的ｒｐｆＣ基因具有高度的同源性。因此，将水稻白叶枯病菌的这一基因也称为ｒｐｆＣ基因     

水稻白叶枯病菌GX1329基因组文库的构建及含编码TAL效应物基因的克隆的分离

由革兰氏阴性细菌水稻白叶枯病菌引起的水稻白叶枯病是亚洲、北美以及非洲部分地区最严重的水稻病害之一,水稻白叶枯病可使水稻减产高达50％以上。研究表明水稻白叶枯病菌的毒力主要依靠三型分泌系统所分泌的效应物。为了解水稻白叶枯病菌广西菌株GX1329中含有avrBs3／pthA家族基因的情况,本研究应用Alu I部分酶切其基因组DNA,构建了含有736个克隆的菌株GX1329的基因组文库。BamHI酶切分析随机挑取的15个文库克隆表明,克隆的外源DNA随机性良好,克隆的最小片段为27．7kb,最大为58．5kb,平均大小为39．9kb,文库克隆容量约为2．8×10^3Mb,该文库中包含基因组中任一个基因的概率为99．4％。利用来自水稻白叶枯病菌菲律宾菌株PX086的无毒基因avrXa10的第252位～第486位核苷酸序列作为探针,通过菌落原位杂交从GX1329基因组文库中筛选到37个含avrBs3／pthA家族基因的克隆。再通过Southern杂交分析,得到了17个独立克隆。这17个克隆中至少含有13个不同的avrBs3／pthA家族基因。这些基因在GX1329基因组中有的单独存在,有的两个或两个以上串联存在。本工作基本上明确了菌株GX1329基因组中avrBs3／pthA家族基因的数量,为进一步研究菌株GX1329中avrBs3／pthA家族基因的功能奠定了基础。     

水稻白叶枯病菌基因XOO2193的突变体构建及其毒力和胞外多糖分析

水稻白叶枯病菌是一种引起水稻白叶枯病的植物病原细菌,水稻白叶枯病是世界水稻生产中最严重的细菌性病害之一。本研究采用携带同源序列的自杀质粒pK18MobGⅡ整合的办法构建了水稻白叶枯病菌中国菌株13751编码6-磷酸葡糖酸内酯酶的基因XOO2193的非极性突变体GNM2193。对突变体的表型分析发现其毒力在杂交水稻品种特优63上显著减弱,突变体在非寄主植物蓖麻上不能引起过敏反应。此外,突变体胞外多糖的产量是野生型的43.4%。用一段含有XOO2193基因的DNA片段对GNM2193进行功能互补,互补菌株在水稻上的毒力、引起过敏反应的能力和胞外多糖产量恢复到野生型水平。说明XOO2193基因与病菌的毒力和胞外多糖的产生有关。     

枯草芽孢杆菌SO113分泌蛋白的抑菌作用及抗菌蛋白的分离纯化

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)SO113对水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzaepv.oryzae）有强烈的抑菌作用（表现出一透明抑菌圈）。培养液上清中加入60％饱和度的硫酸铵沉淀所得的蛋白粗提液对热稳定，对链霉蛋白酶E不敏感，对蛋白酶K部分敏感，对中国各稻区白叶枯病菌的7种致病型都有强烈的抑杀作用，蛋白粗提液100℃加热15min后脱盐，经DEAE0－Sepharose Fast Flow柱层析得3个未分开的抗菌活性峰，示吸附部分经CM－Sepharose Fast Flow柱层析，得到1个主活性峰，由于B.subtilis SO113的分泌蛋白对水稻白叶枯病菌表现出良好的广谱抗性以及丰富的抗菌活性峰，因此对其进一步的研究和设法隆编码抗菌蛋白的基因都具有重要意义。     

利用酵母双杂法鉴定水稻白叶枯病菌Ⅲ型效应物寄主靶标初探

水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo）引起的水稻白叶枯病是世界水稻生产中最严重的细菌性病害之一。前期研究发现Xoo PXO99A中一个编码Ⅲ型效应物的PXO_03420（hpaF）基因与病菌游动性、致病性和致敏性有关,为探讨hpaF基因编码产物在病菌与日本晴水稻中的互作关系,本研究采用Matchmaker酵母双杂交系统构建了日本晴水稻叶片高质量cDNA文库,文库重组率为87.6%,滴度为2.57×10^6pfu/mL。将文库与构建的Y187/pGBKT7_03420诱饵进行酵母双杂交,共得到26个阳性克隆。通过对阳性克隆测序所得结果进行结构域分析,初步鉴定HpaF与水稻叶片中具有WHY或PRK结构域的两个蛋白存在互作关系。本研究结果为进一步研究hpaF基因的功能奠定了基础。     

不同致病型水稻细条病菌的遗传多样性分析

采用引物BOX和ERIC对来自4省的35个细条病菌菌株进行Rep-PCR扩增,BOX引物扩增出14条指纹带,10种谱型,以致病型为单位计算遗传多样性值为0.63～1.00;ERIC引物扩增出19条指纹带,17种谱型,遗传多样性值为0.86～1;引物ERIC比BOX在遗传多样性方面有更好的分辨率;树状聚类图反映的遗传分簇差异,与菌株的致病型及其地理的来源之间没有相关性。     

转拟南芥NPR1基因桂99 T3代植株的抗病性及农艺性状表现

以转拟南芥AtNPR1基因的恢复系品种桂99T3代纯合株系为材料,考查其农艺性状及其抗病性,并比较转基因植株与桂99侵染水稻白叶枯病菌后的农艺性状。结果表明：转基因植株表现出对水稻白叶枯病的抗性显著增强77%以上;穗长、剑叶长、有效穗数、一次枝梗数、每穗实粒数、单株产量和谷粒宽等农艺性状与未转基因桂99无显著差别。在受到水稻白叶枯病菌侵染后,转基因植株的一次枝梗数、每穗粒数、每穗实粒数和单株产量等方面均比对照桂99高出13%～78%。说明AtNPR1基因增强了水稻的抗病能力,从而降低了病害引起的产量损失。转基因植株的恢复力不受影响,稻米品质比桂99更加优良。本工作为转基因水稻抗病育种的研究奠定了基础。