黄体期和卵泡期小尾寒羊KiSS-1与RFRP-3组织表达研究

为分析KiSS-1和RFRP-3基因在小尾寒羊不同繁殖时期(黄体期和卵泡期)下丘脑、垂体、性腺轴各组织中的表达差异,阐明这2个基因在绵羊发情转换中的表达模式,以常年发情的小尾寒羊为研究对象,采用实时荧光定量PCR技术,对比分析了KiSS-1和RFRP-3基因在黄体期和卵泡期的小尾寒羊下丘脑—垂体—性腺轴各组织中的表达差异。结果表明:1)KiSS-1和RFRP-3基因在下丘脑、垂体、卵巢等10种组织中均有表达;2)黄体期和卵泡期下丘脑中KiSS-1基因表达量均显著高于其他组织(P0.05),卵泡期下丘脑和松果体中KiSS-1基因表达量均显著高于黄体期(P0.05);3)黄体期和卵泡期下丘脑和卵巢中RFRP-3基因的表达量均显著高于其他组织(P0.05),且卵巢中RFRP-3基因在黄体期的表达量显著高于卵泡期(P0.05)。综上,研究发现KiSS-1和RFRP-3基因在绵羊发情调控中均发挥重要作用,KiSS-1促进发情而RFRP-3抑制发情。     

ZmDREB2.7正调控玉米耐旱性的功能分析

为评价 ZmDREB2.7优异等位基因型对玉米耐旱性的作用，选择携带优异等位基因型的玉米自交系CIMBL70、CIMBL92做父本及敏感基因型的玉米自交系SHEN5003做母本，用于构建近等基因系群体。结果表明，NIL- ZmDREB2.7CIMBL70和NIL- ZmDREB2.7CIMBL92恢复率分别为 94.96%和95.11%；苗期存活率分别是81.34%和83.33%，显著高于轮回亲本（SHEN5003，37.3%）。为更加明确 ZmDREB2.7的耐旱效应，构建了 ZmDREB2.7pro: ZmDREB2.7转基因玉米植株。转基因玉米材料 ZmDREB2.7pro: ZmDREB2.7-1和 ZmDREB2.7pro: ZmDREB2.7-10相对表达量更高，苗期存活率分别是68.05%和 70.83%，显著高于野生型（A188，58.33%）。在新疆大田干旱条件下， ZmDREB2.7pro: ZmDREB2.7-1和 ZmDREB2.7pro: ZmDREB2.7-10两个株系均比野生型小区少减产20%以上。因此，研究结果可能为玉米耐旱新品种的培育提供有价值基因资源和可行的实践方案。     

红麻线粒体基因NAD3和COB的RNA编辑与表达分析

以红麻细胞质线粒体近等基因系UG93A(不育系)、UG93B(保持系)及UG93A×福红992(恢复系)的F1代为材料,研究花药线粒体基因NAD3和COB的转录与表达。结果发现,在3种供试材料中,基因NAD3的CDS区在DNA水平和RNA编辑水平上均无差异;不育系与保持系的COB基因DNA编码序列无差异,但在RNA水平上发生了编辑,8个位点的编辑均发生于密码子的第一或第二位碱基,且导致氨基酸种类变化,主要为亲水性氨基酸转变为疏水性氨基酸;COB基因在UG93A中的RNA编辑频率低于UG93B;NAD3和COB基因在3种材料中的转录本大小基本相同,但在表达水平上表现为不育系显著低于保持系和F1代。由此推测NAD3和COB基因在红麻花药发育过程中有着重要的作用。     

斑马鱼ddx27基因对tp53基因的调控作用

为探究斑马鱼ddx27基因对tp53基因表达的影响,根据NCBI网站在线数据库中分析得到的ddx27基因编码序列（coding sequence,CDS）,利用同源重组技术构建斑马鱼ddx27真核表达载体pCMV-3×Flag-ddx27。通过亚细胞定位试验和蛋白质免疫印迹技术验证ddx27基因的表达,并利用双荧光素酶试验验证ddx27基因的过表达对tp53基因转录活性的影响。结果显示,ddx27 CDS区及阳性克隆的电泳片段大小以及测序比对均与预期结果一致。蛋白质免疫印迹显示Ddx27重组质粒可正常表达,且蛋白大小与预测结果一致。亚细胞定位显示Ddx27蛋白表达于HEK293T细胞的细胞核中。而且,过表达pCMV-3×Flag-ddx27真核表达载体能够显著增强 tp53启动子报告基因载体pGL3-tp53-Luc的活性,为对照组的1.8倍（P<0.05）。以上结果表明,斑马鱼pCMV-3×Flag-ddx27真核表达载体构建成功,能够在哺乳动物的细胞核中表达,且ddx27基因可以促进tp53基因的表达。     

GhCDPK4基因的克隆和功能分析

为了研究棉花中GhCDPK4基因在响应非生物胁迫中所起的作用,通过PCR的方法克隆GhCDPK4基因,利用基因重组技术,构建植物过表达载体,采用农杆菌介导的叶盘法转化模式植物烟草,分析干旱和盐胁迫处理对转基因烟草表型和生理生化指标的影响。本研究成功克隆了属于棉花CDPK家族的基因GhCDPK4,构建了植物过表达载体pCAMBIA2300-GhCDPK4。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测发现转基因烟草中GhCDPK4基因高水平表达,并且转基因烟草相比于野生型烟草表现出较强的耐旱和耐盐性,其中SOD、POD和CAT活性显著升高,而相对电导率和MDA含量降低。研究结果表明GhCDPK4基因可正向参与应答干旱和盐胁迫。     

外源C4-PEPC对水稻粒形和稻米品质及成分的影响

【目的】磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC）参与植物碳代谢,并且在碳氮耦合代谢调节过程中扮演着重要角色。分析导入外源C₄-PEPC对水稻稻谷粒形和稻米品质及成分变化的影响,进一步阐明C₄-PEPC在C₃植物水稻中的作用。【方法】以航2号（对照）和转C₄-PEPC水稻为材料,采用万深SC-G型自动考种及千粒重分析仪分析稻谷的粒形,采用电镜扫描观察稻米内部淀粉粒结构,参照标准米质测定方法测定稻米品质(直链淀粉含量、胶稠度、碱消值);同时,测定稻米中支链淀粉、蔗糖、可溶性总糖及碳氮的含量,并采用高效液相色谱法测定稻米中的氨基酸含量。【结果】粒形分析表明,与对照航2号相比,转C₄-PEPC水稻的谷粒明显较短较窄,其长、宽、周长及千粒质量也明显较小。电镜扫描显示,航2号淀粉粒排列紧密,而转C₄-PEPC稻米淀粉粒排列明显比较松散。转C₄-PEPC株系稻米中直链淀粉含量明显较低,而支链淀粉含量明显较高,胶稠度和碱消值与对照无明显差别,垩白率和垩白度降低,蔗糖和可溶性糖含量极显著降低。转C₄-PEPC稻米的总氮含量明显较低,其中天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、胱氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸等14种氨基酸含量明显较低,而其余3种氨基酸,即脯氨酸、异亮氨酸、色氨酸含量与对照无明显差别。【结论】导入外源C₄-PEPC后,水稻谷粒变小,淀粉粒排列松散,稻米中直链淀粉、蔗糖、可溶性糖、总氮及大部分氨基酸含量降低,而支链淀粉含量升高。     

等位基因特异扩增检测水稻抗稻瘟病基因Pi ta

为明确陕西省主要水稻种质资源中抗稻瘟病基因Pi ta的存在状况,为稻瘟病抗性育种提供依据。利用在抗稻瘟病基因Pi ta区域设计的四引物扩增受阻突变体系PCR方法,对陕西省2010-2012年水稻区域试验的327份材料进行Pi ta基因位点检测。结果表明,4份材料为抗性基因纯合体,40份材料为抗性基因杂合体,276份材料在Pi ta位点为感性基因纯合体,7份材料未检出条带。检测结果真实可靠,可以作为检测水稻Pi ta基因位点的有效方法。     

牦牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因的克隆及序列分析

为了解牦牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因的特点,根据GenBank已公布的牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因序列设计4对引物,每个基因分两段扩增,测序并拼接,首次克隆牦牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因。序列分析表明,扩增到的牦牛应激型 HSPA1A基因全长2 134 bp,开放阅读框全长1 926 bp,编码641个氨基酸,分子质量为70.26 ku; HSPA2基因全长1 911 bp,开放阅读框全长1 911 bp,编码636个氨基酸,分子质量为69.85 ku。将 HSPA1A和 HSPA2基因开放阅读框编码的氨基酸序列进行ScanProsite分析,均得到3个HSP70蛋白家族标记。核苷酸序列同源性分析表明, HSPA1A和 HSPA2基因具有较高的保守性,牦牛与牛的 HSPA1A和 HSPA2基因核苷酸序列同源性最高,分别为99.8%和99.1%。遗传进化关系分析表明,牦牛与牛的应激型 HSPA1A和 HSPA2基因亲缘关系最近。     

西伯利亚白刺 NsMYB5调控果实花青素生物合成

基于西伯利亚白刺红果、黑果果皮转录组数据,本研究筛选并克隆获得一个与西伯利亚白刺果实花青素和原花青素合成代谢相关的R2R3-MYB转录因子,命名为 NsMYB5。该基因ORF为840 bp,编码279个氨基酸, NsMYB5具有完整的SANT、MYB domain及HLH-MYB domain结构域,属于R2R3-MYB转录因子,与调控花青素和原花青素合成相关的香雪兰 FhMYB5同源性较高。过表达 NsMYB5烟草花瓣和雄蕊积累大量花青素,呈现深紫色,而叶片和茎仅有少量花青素积累,局部呈现淡紫色。转基因株系中花的花青素和原花青素含量均显著高于野生型（P<0.05）。结果表明, NsMYB5可以正向调控花青素和原花青素的合成,这为西伯利亚白刺果实果皮呈色的分子遗传机理提供了理论依据。     

结球甘蓝类钙调蛋白基因 CML48和 CML50在不同胁迫下的表达分析

为探究结球甘蓝类钙调蛋白（CMLs）响应不同胁迫时的功能,丰富CMLs参与钙信号网络调控,为CMLs参与植物逆境途径及其功能的研究提供依据。以结球甘蓝ZG为材料,克隆得到 CML48和 CML50基因,序列分析表明 CML48开放阅读框（ORF）为672 bp,含4个内含子,编码223 aa,分子量为25.28 ku; CML50开放阅读框ORF为1 095 bp,编码364 aa,分子量为38.06 ku,含3个内含子;均为亲水蛋白,均含有2个EF-hand结构域;系统发育树表明 CML48和 CML50均与甘蓝处于同一进化枝,与白菜、油菜的亲缘关系最近。qPCR表明 CML48和 CML50在干旱(PEG6000)、盐胁迫(NaCl)、低温(4 ℃)、高温(37 ℃)、H₂O₂、脱落酸（ABA）、水杨酸（SA）和茉莉酸甲酯（MeJA）等不同胁迫处理下,在叶和根中的表达均有上调,且 CML50的表达量均显著高于 CML48, CML48在茎尖中高度响应高温胁迫,而在根中不响应高温和H₂O₂胁迫。初步说明 CML48和 CML50在根和叶中均可响应上述8种非生物胁迫。     

基于高密度遗传图谱的水稻穗长QTL定位与分析

【目的】深入挖掘与穗长相关的新基因，为水稻穗长调控的遗传机理研究及分子育种提供依据。【方法】以2个优良亲本‘ZP37’和‘R8605’及其杂交衍生的208个高世代重组自交系(Recombinant inbred lines,RILs)为作图群体，利用全基因组重测序高密度连锁图谱对3个不同环境下的穗长数量性状座位(Quantitative trait locus,QTL)进行定位，同时分析它们的聚合效应。【结果】共检测到11个穗长QTL，分别分布在第3、4、7、8、9和12号染色体上，其似然函数比对数值(Log of odds,LOD)介于3.07～12.87之间，贡献率在2.17%～10.94%之间，有7个QTL是新位点，其余4个QTL位点与已报道的穗长基因和QTL位置重叠或相近。在2个不同环境下重复检测到4个稳定的QTL位点；对聚合了不同数量穗长QTL株系的分析结果表明，穗长QTL表现出累加效应，QTL数量的增加能显著增加水稻穗长。【结论】本研究结果为水稻穗长QTL的克隆和功能解析奠定坚实的基础，为水稻高产育种提供理论依据和遗传资源。     

1个水稻紫叶基因pl41的遗传分析与定位

【目的】对水稻材料pl41的紫叶性状进行遗传分析和基因定位,为pl41基因的图位克隆、功能研究及其育种利用奠定基础。【方法】在紫叶籼稻品种‘Z3474’与绿叶粳稻品种‘日本晴’的杂交后代中,获得1个紫叶性状稳定遗传的材料pl41。观察pl41表型特征;配制pl41/日本晴杂交组合,利用F_1及F_2分离群体进行紫叶基因的遗传分析和基因定位研究。【结果】pl41紫色性状首先出现在苗期的叶鞘、叶尖和叶缘处,在抽穗期,pl41植株地上部分组织均呈现较深的紫色。与‘日本晴’相比,pl41叶绿素含量在苗期显著高于‘日本晴’,在抽穗期显著低于‘日本晴’,在灌浆期无显著差异;pl41花青素含量在苗期、抽穗期和灌浆期均极显著高于‘日本晴’。pl41紫叶性状受1对隐性核基因控制,定位在第12号染色体短臂289 kb范围内,对该区域5个预测基因的编码区序列进行了测序比对分析,发现其编码区序列在pl41与‘日本晴’之间无差异。【结论】初步定位了水稻pl41紫叶基因的范围,其最终确定还需要候选基因的精细定位、序列比对分析和转录水平分析。     

宁夏小麦Glu-A3与Glu-B3位点等位变异组成分析

低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)与小麦品质密切相关。为给宁夏小麦的品质改良提供参考,应用STS分子标记,对宁夏98份小麦品种Glu-A3和Glu-B3位点的等位基因变异类型组成进行检测和分析。结果表明,宁夏98份小麦品种Glu-A3位点存在Glu-A3a(4.0%)、Glu-A3b(2.0%)、Glu-A3c(55.1%)、GluA3d(10.1%)和Glu-A3e(28.5%)5种等位变异;Glu-B3位点存在Glu-B3a(2.0%)、Glu-B3b(8.1%)、Glu-B3c(5.0%)、Glu-B3d(7.1%)、Glu-B3f(21.4%)、Glu-B3g(2.0%)、Glu-B3h(15.3%)和Glu-B3i(13.3%)8种等位变异。宁夏参试品种共存在23种等位变异组合形式,其中引黄灌区存在18种组合类型,Glu-A3c/Glu-B3j(17.7%)和Glu-A3e/Glu-B3f(16.2%)组合类型较为普遍;宁南山区存在13种组合类型,以Glu-A3c/Glu-B3i(20.0%)组合类型为主。在参试的宁夏小麦品种中,对同一地区不同来源品种而言,改良品种的LMW-GS遗传多样性明显较引进品种和地方品种更丰富。     

水稻lncRNA SVR及邻近SAUR基因在种子低温萌发中的表达

目的 长链非编码RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)长度大于200 nt，一般不具有编码蛋白质功能。探究低温下lncRNA对邻近SAUR基因表达的影响，以期为研究水稻种子低温萌发的能力提供理论依据。方法 lncRNA SVR由华南农业大学国家植物航天育种工程技术研究中心前期研究筛选，可以响应低温胁迫，通过生物信息学方法分析lncRNA SVR的二级结构并寻找lncRNA SVR内部的冷胁迫基序，通过qRT-PCR分析lncRNA SVR和SAUR基因的表达特性。结果 lncRNA SVR序列中存在高度相似的冷胁迫响应基序，且在茎环连接处。表达特性分析表明，在种子萌发过程中低温胁迫会持续降低lncRNA SVR的表达，邻近的多个SAUR基因在低温胁迫下的表达量明显高于在常温下的表达量，表明lncRNA SVR的邻近SAUR基因一定程度上能够和lncRNA SVR一样响应低温胁迫。表达相关性分析表明，在低温萌发中lncRNA SVR与这些SAUR基因的表达均呈负相关关系，lncRNA SVR与OsSAUR55的表达呈显著负相关关系。进一步分析种子低温萌发中SAUR基因在lncRNA SVR敲除系中的表达情况，结果表明，在敲除系中，lncRNA SVR的下降幅度低于其在野生型中的下降幅度，OsSAUR41、OsSAUR53、OsSAUR54、OsSAUR55表达量的上升幅度均显著低于其在野生型中的上升幅度。结论 lncRNA SVR可能负调控OsSAUR55的表达，进而响应低温胁迫。     

水稻籼爪交重组自交系穗部性状变异分析

为研究四川水稻高产理想株系穗部性状的遗传特性,并筛选出高产且综合农艺性状好的新材料,利用籼稻CG133R与爪哇稻22号构建的重组自交系(RIL)群体,对其单株有效穗、一次枝梗数、穗长、每穗着粒数和千粒重等9个性状的遗传变异进行考查和相关性分析;对其单株产量与各农艺性状进行逐步回归分析与通径分析;对单株产量位列前8名的优系分析其穗部性状表现,并根据单株产量高低分成2组深入进行性状间的相关分析。结果表明,RIL群体穗部性状上发生了极广泛的变异。逐步回归分析和通径分析发现,水稻单株产量的主要贡献因素为有效穗实粒数千粒重。经过对其优系分析,初步确立四川稻区高产理想株系穗部性状的指标为有效穗数7~9个、一次枝梗数18~20个、穗长27.0~30.0cm、着粒数320粒、实粒数290粒、着粒密度120粒/10cm、结实率81%~92%、千粒重20.0~27.0g。进一步对RIL群体中单株产量位列前4名的株系分析发现,其有效穗数和着粒数呈显著正相关(P0.001)。表明打破了有效穗数和着粒数间的不利连锁关系,出现了优良变异。这些优系可作为新种质进行深入分析和利用。     

汉麻Alfin-like转录因子家族鉴定及表达分析

对汉麻Alfin-like转录因子家族进行鉴定和生物信息学分析,为Alfin-like转录因子调控汉麻生长发育及抗性奠定基础。通过利用拟南芥Alfin-like转录因子蛋白序列作为模板,利用TBtools、MEGA等生物信息学工具分析汉麻全基因组数据。在汉麻基因中共鉴定出5个CsALs基因,对其进行了理化性质分析、亚细胞定位、保守基序、基因结构、染色体定位、顺式元件、共线性分析、进化分析及聚类分析等基础分析。结果表明：鉴定的5个汉麻AL转录因子均含有DUF3594结构域（PAL结构域）和PHD手指状结构域;经理化性质分析得出,CsALs蛋白质长度在239～256 aa之间,等电点在4.97～5.31之间,亲水性为-0.809～-0.623,属于酸性亲水蛋白;CsALs基因分布在4条染色体上,亚细胞定位发现AL转录因子均定位在细胞核;上游2 000 bp启动子元件分析与光响应、胁迫响应和激素相关;根据与拟南芥、大豆、水稻、玉米、烟草等系统发育分析共分为B、E、F 3个亚族;热图聚类分析表明CsALs基因在汉麻中具有较高表达。     

Ghd7和DTH8协同调控水稻抽穗期和部分农艺性状

【目的】抽穗期是水稻重要的农艺性状,决定品种适宜的栽培地区和季节。Ghd7与DTH8是水稻的关键抽穗基因,全面揭示Ghd7、DTH8在不同背景中的遗传互作规律、表达调控和对农艺性状的作用,对指导水稻品选育、提高水稻适应性和产量具有重要的应用价值。【方法】本研究通过分子标记辅助选择从杂交稻‘宁优1179’后代中鉴定培育了1个hd1和prr37无功能的背景下Ghd7和DTH8的双基因分离群体,对其进行了抽穗期调查、下游基因(Ehd1、Hd3a、RFTI)表达检测和部分农艺性状分析。【结果】在自然长日和自然短日下,Ghd7或DTH8单基因均可抑制Ehd1、Hd3a和RFTI的表达,延迟抽穗,Ghd7或DTH8单基因可以显著增加水稻株高、一级枝梗数、二级枝梗数、主穗粒数和千粒质量;Ghd7和DTH8双基因组合强烈抑制Ehd1-Hd3a/RFT1通路的表达,延迟抽穗,并且能够显著增加水稻株高、一级枝梗数、二级枝梗数、主穗粒数和千粒质量等农艺性状。【结论】长、短日下,Ghd7和DTH8能协同抑制成花素基因表达,延长水稻抽穗期,正向调控多个产量相关性状,在水稻高产育种和遗传改良中具有重要的应用价值。     

高氯酸钾浸种对水稻种子萌发及幼苗生理特性的影响

以水稻为实验材料,在水培及控制条件下,探讨不同浓度（0、20、50、100和300 mg·L^-1）的高氯酸钾浸种胁迫对水稻种子萌发及幼苗生长生理的影响。结果表明,低浓度胁迫（20 mg·L^-1）对种子萌发有一定的刺激作用,萌发率、根长和根数均大于对照,随着胁迫浓度和时间的增加,种子萌发及幼苗生长受抑制程度逐渐增大,并且茎的生长比根受影响程度更大。与对照相比,幼苗叶片叶绿素、蛋白质和MDA含量均随胁迫浓度的增高而下降,而SOD活性呈先升后降的趋势,POD活性持续增强,CAT则明显下降。综合各指标的变化及相关性分析结果表明,高氯酸钾抑制水稻种子萌发及导致的幼苗生理伤害与活性氧代谢失调有关,其伤害机制尚待进一步探讨。     

铁皮石斛SEP3基因的生物信息学分析及敲除载体的构建

SEP3(SEPALLATA3)基因是MADS-box家族中的一员,在花器官的形成和发育过程中具有重要作用.为了解SEP3基因在铁皮石斛(Dendrobium officinale)中的成花转变机理,从铁皮石斛转录组序列中获得一个SEP3基因序列,并命名为DoSEP3.预测其编码区长度为354 bp,预测编码117个氨基酸.DoSEP3蛋白相对分子质量13457.87 Da.其不稳定系数为60.53,亲水性的平均值为-0.121,是不稳定的亲水性蛋白,主要在内质网和细胞核中起作用.二级结构主要以α-螺旋为蛋白质最大量的结构元件,跨膜区分析推测DoSEP3蛋白质具有一个跨膜区.进一步的氨基酸比对显示,铁皮石斛DoSEP3蛋白与金钗石斛SEP3蛋白亲缘关系最近,可能具有类似的功能.基于生物信息学分析,利用CRISPR/cas9技术构建铁皮石斛基因敲除载体,并使用农杆菌介导法进行遗传转化,且已获得阳性原球茎,可为后续的SEP3基因表达研究奠定基础.