人颗粒细胞共培养对牛卵母细胞体外成熟及孤雌激活的影响

为了探讨人颗粒细胞共培养对牛卵母细胞体外成熟及孤雌激活的影响,将穿刺获得的牛卵母细胞随机分为试验组和对照组,试验组以人颗粒细胞作为滋养层与牛卵母细胞在体外成熟液中共培养,对照组仅使用与试验组相同的体外成熟液培养,观察并比较两组的极体排出率、孤雌激活囊胚形成率。结果发现,试验组的极体排出率（72.35％）显著高于对照组的极体排出率（52.86％）（P＜0.01）;经过孤雌激活后,试验组的囊胚形成率为12.82％,对照组为4.76％,两组之间无显著性差异（P＞0.05）。说明人颗粒细胞可以作为牛卵母细胞体外成熟时的滋养层,两者共培养可以提高牛卵母细胞体外培养的核成熟率。     

水牛卵丘颗粒细胞凋亡与卵母细胞体外发育潜能的研究

为了探讨水牛卵母细胞体外发育潜能与卵丘颗粒细胞凋亡之间的关系,本研究将水牛卵母细胞体外培养22～24 h后,取其卵丘颗粒细胞,采用Annexin V-FITC法进行颗粒细胞凋亡染色,进行凋亡率的分析,并与卵母细胞的成熟情况和卵母细胞的评分及形成卵裂、囊胚的结果进行对照.结果发现,随着卵母细胞成熟时间的增加,卵丘颗粒细胞凋亡率升高;随着卵母细胞评分和发育潜能的降低,卵丘颗粒细胞凋亡率逐渐升高.由此表明,卵母细胞发育潜能与卵丘颗粒细胞凋亡密切相关,通过测定卵丘颗粒细胞的凋亡率可预测未成熟卵母细胞的发育潜能.     

血清对水牛卵母细胞体外成熟、体外受精及早期胚胎发育的影响

从屠宰场收集了本地水牛55头、黑白花奶牛22头的卵巢共获卵泡847枚,平均每个水牛卵巢回收3.67枚可用卵母细胞,约为黑白花奶牛(10.23枚/头)的1/3。试验分别采用添加与不添加血清的培养液体外成熟培养水牛卵母细胞,结果二者的成熟率无明显毒性差异(58.23%对56.67%),但体外受精后早期胚胎发育的8-细胞率有显著差异(35.4%对23.0%),表明体外成熟液中有无血清对水牛卵母细胞体外成熟率没有影响,但血清对卵母细胞的早期胚胎发育有重要影响。进一步比较成熟液中不添加血清但在受精液及胚胎液中添加血清和在各个阶段均有血清参与的早期胚胎发育率(8-细胞率),表明二者差异不显著(33.8%对35.4%)。经无血清成熟培养液培养的成熟卵母细胞可以经孤雌激活后得到早期胚胎(4细胞)。     

共培养体系对哺乳动物卵母细胞体外成熟影响的研究进展

卵母细胞体外成熟是进行体外胚胎生产的关键环节,但目前哺乳动物卵母细胞体外成熟培养存在成熟率低、受精率低和胚胎质量差等问题。卵母细胞体外成熟培养体系是制约卵母细胞体外成熟效果的重要因素,共培养体系可提高哺乳动物卵母细胞体外成熟效率。本文主要从卵母细胞成熟与卵泡细胞共培养、与裸卵共培养和与间充质干细胞共培养3个方面综述共培养体系对哺乳动物卵母细胞体外成熟的影响,为共培养体系应用于卵母细胞体外成熟提供理论依据和研究借鉴。     

成熟液和时间对绵羊体外孤雌胚发育的影响

颗粒细胞在卵母细胞体外成熟和体外受精进程中具有重要的作用,能显著提高卵母细胞体外成熟和体外受精率;但也有研究发现,颗粒细胞存在与否并不影响卵母细胞体外成熟和体外受精率,甚至还可显著降低其体外成熟率和体外受精率.     

不同共培养细胞类型对绵羊孤雌生殖胚发育的影响

体外成熟的绵羊卵母细胞经孤雌激活4 h后,分别在5种体细胞单层(成熟前颗粒细胞、成熟后颗粒细胞、输卵管壶腹部上皮细胞、输卵管峡部上皮细胞、子宫内膜细胞)中进行共培养,比较其对绵羊孤雌生殖胚体外发育的影响.结果表明:成熟前后颗粒细胞对绵羊孤雌胚体外发育的卵裂率和囊胚率差异不显著(P>0.05);但输卵管壶腹部上皮细胞(27.5%)、子宫内膜细胞组囊胚率(27.7%)高于输卵管峡部上皮细胞和颗粒细胞(17.7%、20.3%),且差异显著(P<0.05);壶腹部上皮细胞与子宫内膜细胞在囊胚率上差异不显著(P>0.05).说明在绵羊孤雌生殖胚体外发育中,选择成熟前及成熟后的颗粒细胞都可达到相同的共培养效果;使用输卵管壶腹部上皮细胞、子宫内膜细胞进行共培养效果优于输卵管峡部上皮细胞和颗粒细胞,可以得到较高的囊胚率.     

四种培养液对牦牛孤雌胚胎发育的影响

为探讨不同培养液对牦牛早期胚胎发育的影响,本试验将经过孤雌激活后的牦牛卵母细胞分别置于m SOF,G1/G2,CR1aa和CR1aa颗粒细胞共培养四种体外培养液中进行体外培养。结果表明,四种培养液对胚胎的卵裂率影响差异不显著,CR1aa和CR1aa颗粒细胞共培养组的囊胚率显著高于m SOF和G1/G2组,CR1aa和CR1aa颗粒细胞共培养组的囊胚率之间没有显著差异,但是CR1aa颗粒细胞共培养组的囊胚孵化率显著高于CR1aa组,说明CR1aa颗粒细胞共培养可作为较为合适的牦牛早期胚胎培养液。     

生殖激素对奶水牛卵母细胞成熟及发育潜能的影响

本试验以屠宰场获取的奶水牛卵巢为试验材料,收集卵母细胞进行体外成熟培养(IVM)、体外受精(IVF)及早期胚胎培养(IVC)。研究激素(FSH、LH、E2、P4)的不同浓度对奶水牛卵母细胞成熟和早期胚胎发育的影响,以期探讨奶水牛卵母细胞成熟和早期胚胎体外培养发育机制,优选不同激素的最佳浓度。结果表明:添加FSH试验组奶水牛颗粒细胞扩散率和卵裂率高于未添加试验组(P<0.05);添加LH试验组奶水牛颗粒细胞扩散率、卵裂率及8-细胞率与未添加试验组比较,差异不明显(P>0.05);17β-E2试验组(1.0μg/mL)的奶水牛颗粒细胞扩散率、卵裂率及8-细胞率高于未添加试验组(P<0.05);添加P4试验各组(0.9μg/mL、1.2μg/mL)的颗粒细胞扩散率明显低于未添加试验组(P<0.01)。     

水牛卵母细胞孤雌激活及孤雌胚与体外受精胚发育比较

对MII期水牛卵母细胞进行人工诱导激活可帮助人们间接判断体外成熟卵母细胞质量的优劣,且卵母细胞的充分激活也是提高核移植效率的关键因素之一。本试验比较了水牛卵母细胞体外成熟时间对孤雌激活胚发育能力的影响及不同化学激活方法对水牛卵母细胞孤雌激活效果的影响,并在相同条件下,对孤雌激活胚与体外受精胚的发育能力进行了比较。结果表明,水牛卵母细胞体外成熟27h或30h的囊胚发育率（19.0%or 17.7%）明显高于体外成熟21h或24h的囊胚发育率（12.3%or 13.8%）;Ion联合6-DMAP激活水牛卵母细胞的效果优于其他激活方法;在相同条件下,孤雌激活胚的囊胚发育率显著高于体外受精胚（13.0%vs.21.7%）。     

水牛卵母细胞孤雌激活及孤雌胚与体外受精胚发育比较

对MⅡ期水牛卵母细胞进行人工诱导激活可以帮助人们间接判断体外成熟卵母细胞质量的优劣,并且,卵母细胞的充分激活也是提高核移植效率的关键因素之一.试验比较了水牛卵母细胞体外成熟时间对孤雌激活胚发育能力的影响以及不同化学激活方法对水牛卵母细胞孤雌激活效果的影响,并在相同条件下,对孤雌激活胚与体外受精胚的发育能力进行了比较.结果表明,水牛卵母细胞体外成熟27h或30h的囊胚发育率(19.0%or 17.7%)明显高于体外成熟21h或24h的囊胚发育率(12.3%or 13.8%);Ion联合6-DMAP激活水牛卵母细胞的效果优于其他几组激活方法;在相同条件下,孤雌激活胚与体外受精胚的发育能力存在着差异,其中卵裂率差异不显著,但孤雌激活胚的囊胚发育率显著高于体外受精胚(13.0%vs.21.7%).     

Theca cell-conditioned medium added to in vitro maturation enhances embryo developmental competence of buffalo (Bubalus bubalis) oocytes after parthenogenic activation

Theca cells (TCs) play a key role in follicular growth and atresia. TCs synthesize androgens that act as substrate for granulosa cells (GCs) aromatization to estrogens needed for oocyte maturation. However, the effects of TCs in the form of conditioned medium on in vitro maturation (IVM) and developmental competence of buffalo oocytes remain unclear. In the present study, we examined the impacts of TC-conditioned medium (TCCM) on maturation efficiency and embryo development of buffalo oocytes after parthenogenic activation (PA). Our results showed that TCCM that was collected on day 2 and added to IVM medium at a 20% proportional level (2 days & 20%) exerted no significant effect on IVM rate (43.06% vs. 44.71%), but significantly (p  < .05) enhanced embryo development (oocyte cleavage, 80.93% vs. 69.66%; blastocyst formation, 39.85% vs. 32.84%) of buffalo oocytes after PA compared with the control group. However, monolayer TC significantly (p < .05) promoted both maturation efficiency (48.84% vs. 44.53%) and embryo development (oocyte cleavage, 80.39% vs. 69.32%; blastocyst formation, 35.38% vs. 29.25%) of buffalo oocytes after PA compared to that in the control group. Furthermore, TCs secreted some testosterone into the conditioned medium, which significantly (p < .05) promoted the expression levels of oestrogen synthesis-related genes (CYP11A1, CYP19A1 and 17β-HSD) in buffalo cumulus–oocyte complexes (COCs). Our study indicated that TCCM (2 days & 20%) did not significantly affect IVM efficiency, but enhanced embryo developmental competence of oocytes after PA principally by stimulating the secretion of testosterone and facilitating estradiol synthesis of buffalo COCs.     

无卵丘的水牛卵母细胞体外成熟方法的初步探讨

主要探讨无卵丘水牛卵母细胞体外成熟的可行性,以便为研究卵母细胞成熟机理提供模型。无卵丘的水牛卵母细胞随机分为5组,然后分别进行直接成熟培养（M1）,与卵丘细胞单层共培养（M2）,用未扩展的卵丘细胞块包围培养（M3）,与扩展的卵丘细胞团共培养（M4）和用卵巢组织包围培养（M5）。无卵丘的水牛卵母细胞体外成熟培养24 h后检查第一极体（PB1）排出率,随后对这些卵母细胞进行孤雌激活,评定其成熟质量。结果发现,M4组的第一极体排出率明显高于M1组和M5组,其它各组间没有显著差异（P〉0.05）;M5组的孤雌激活卵裂率显著低于M1组和M4组（P〈0.05）,而与M2组和M3组没有显著差异（P〉0.05）,但M3和M4两组的囊胚发育率显著高于M1组和M5组（P〈0.05）。这些研究结果表明：（1）未扩展卵丘细胞包围法和扩展卵丘细胞团支撑法可促进无卵丘水牛卵母细胞的体外成熟,但与卵丘细胞单层共培养没有作用;（2）卵巢组织包围培养不利于水牛卵母细胞的体外成熟。     

水牛卵母细胞的体外受精及其胚胎发育的研究

本研究比较了不同来源的水牛卵母细胞的体外受精及其胚胎发育。对10头摩拉母水牛连续6周进行活体采卵,共采集292枚卵母细胞,头均回收卵母细胞4.87枚,头均A级卵数为3.07枚,从屠宰场收集74头水牛卵巢共采集559枚卵母细胞,头均回收卵母细胞和A级卵母细胞分别为7.55枚和5.20枚,均显著高于活体采集的水牛卵母细胞(P<0.01)。将收集的AB级水牛卵母细胞在相同的条件下进行体外成熟、体外受精和体外培养至囊胚。结果表明,活体采卵组和屠宰水牛卵母细胞组受精分裂率差异不显著,分别为54.81%和57.73%。屠宰水牛卵母细胞组的囊胚率则高于活体采卵组(28.78%vs21.34%,P<0.05)。利用两组的胚胎进行常规法冷冻保存,冻胚解冻后的存活率差异不显著(P>0.05)。     

水牛卵丘细胞和颗粒细胞单层对卵母细胞体外受精及其胚胎发育的影响

[目的]探讨卵丘细胞对水牛卵母细胞体外成熟、体外受精及颗粒细胞单层对水牛体外胚胎发育的影响。[方法]①按卵母细胞有无卵丘细胞情况分为五个组：即自然裸卵组（Ⅰ组）、自然裸卵＋卵丘细胞共成熟组（Ⅱ组）、人为裸卵＋卵丘细胞共成熟组（Ⅲ组）、AB级卵母细胞成熟后去除卵丘细胞受精组（Ⅳ组）、AB级卵母细胞对照组（Ⅴ组）分别进行体...     

In vitro Development of Buffalo Oocytes in Media-containing Fluids from Different Size Class Follicles

Studies were conducted to investigate the effect of supplementation of fluid from different sized class [small (SFF, < 3 mm), medium (MFF, 3-8 mm) and large (LFF, > 8 mm)] of normal and cystic (CFF) ovarian follicles in oocyte culture media on oocyte maturation rate and embryo development in vitro and to test the efficacy of follicular fluid (FF) from different size classes as a whole oocyte maturation medium. Results suggested that FF were capable of developing buffalo oocytes to embryonic stage in vitro although its efficacy was lower than that of serum. Regardless of high maturation rates after in vitro maturation (IVM) in media containing FF or IVM in whole FF, low blastocyst rates were obtained after in vitro fertilization (IVF) and culture of embryos. Follicular fluid from small follicles had significantly (p < 0.05) higher potential of developing buffalo oocytes to embryonic stage in vitro than that from medium and large follicles. Cystic FF was not capable of supporting development of buffalo oocytes in vitro.     

表皮生长因子对水牛卵母细胞体外培养核质成熟的影响

为了探讨表皮生长因子（EGF）对水牛卵泡卵母细胞体外培养核质成熟的影响，在以TCM199为基础的成熟液中加入不同浓度的EGF（0、10、25、50、100 ng/ml），体外成熟培养24~26 h，观察第一极体（PB1）的排放；随后进行孤雌激活检测其分裂率、囊胚发育率、囊胚孵化率，并用Hoechst33342染色后计算囊胚的细胞数。结果发现添加EGF各组的卵母细胞第一极体排放率显著提高（P<0.05）；成熟液中添加25 ng/ml EGF时，卵裂率及囊胚发育率（分别为80.0%、44.8%）明显高于对照组（分别为69.3%、31.9%，P<0.05），但对囊胚的细胞数影响不大。EGF不仅促进水牛卵母细胞体外培养的核成熟，而且有利于卵母细胞的胞质成熟，其中EGF的最佳浓度为25 ng/ml。     

转GFP基因核移植牛胚胎的研究

试验采用脂质体转染法与电穿孔法,以携带绿色荧光蛋白（GFP）-新霉抗性（neo-）双标记基因的pMSCV质粒转染胎牛耳成纤维细胞为供体与体外成熟的牛卵母细胞为受体构建克隆胚。研究了体外成熟培养液中添加EGF（表皮生长因子）对转基因胚的影响,不同转染方法构建供体细胞对重构胚发育的影响和在不同体外培养系统中的发育效果。结果显示,体外成熟培养液中添加EGF 30 ng/mL组的卵母细胞成熟率最高,但对后期转基因重构胚的囊胚发育率的影响,以添加EGF 20 ng/mL组的最高;以胎牛耳成纤维细胞为供体细胞,不同转染方法转染供体细胞构建重构胚,其囊胚发育率差异不显著（P>〖JP2〗0.05）;mSOFaa+颗粒细胞单层细胞共培养体系中的转基因囊胚发育率最好,该体系更适合体细胞核移植法生产转基因牛胚胎。     

表皮生长因子和胰岛素样生长因子对水牛卵母细胞胞质成熟的影响

以皮层颗粒（CG）单层分布于质膜下做为卵母细胞胞质成熟的标志,利用CG荧光染色法,研究了不同浓度表皮生长因子（EGF）和胰岛素样生长因子（IGF-1）及其组合对水牛卵母细胞胞质成熟的影响。结果发现：（1）添加不同浓度的EGF（10、20、30、50ng／mL）都可以提高胞质的成熟率,但是组间差异不显著（P〉0．05）;皮质颗粒的分布随着EGF浓度的升高逐步由中间分布向皮层分布转变;（2）在成熟液中添加IGF-130ng／mL时效果较好,能显著提高卵母细胞胞质的成熟率;皮质颗粒的分布随着IGF-1浓度的升高逐步由中间分布向皮层分布转变,在添加IGF一130ng／mL时,在皮层分布最好,随着IGF-1量的进一步增加,皮质颗粒又向中间分布转变;（3）添加20ng／mL EGF＋30ng／mL IGF-1组卵母细胞体外成熟率高于添加30ng／mL的IGF-1组,显著高于添加20ng／m LEGF组和对照组（P〈0.05）。由此表明,EGF和IGF-1对水牛卵母细胞体外成熟有协同作用。     

Effect of insulin,transferrin and selenium and epidermal growth factor on development of buffalo oocytes to the blastocyst stage in vitro in serum-free,semidefined media

The in vitro development of buffalo oocytes up to the blastocyst stage was studied in serum-free, semidefined media containing bovine serum albumin, follicle-stimulating hormone (FSH), insulin, transferrin and selenium (ITS) and epidermal growth factor (EGF). In experiment 1, oocytes aspirated from abattoir-derived ovaries were cultured in eight serum-free, semidefined culture media containing different combinations of these four factors. In experiment 2, the maturation of buffalo oocytes and the development of the embryos were compared in a complex co-culture system and in the serum-free, semidefined media. Supplementation with FSH and EGF significantly (P < 0.05) increased the maturation rates of buffalo oocytes, and the yield of blastocysts was higher (P < 0.05) in media containing EGF and ITS. The yield of blastocysts was lower in the serum-free semidefined media (P < 0.05) than in the complex co-culture system.     

绵羊卵丘细胞对裸卵体外成熟及孤雌发育影响的研究

本研究探讨绵羊卵丘细胞对裸卵体外成熟和后期发育的影响。实验分为4组,对照组为卵丘-卵母细胞复合体(COCs);裸卵(DO)组;COCs与DO共培养组(CODO);卵丘细胞(CC)与DO共培养组(CCDO)。体外成熟培养18 h后,检测各组卵子成熟质量并进行孤雌发育研究。结果表明:CODO和CCDO组中裸卵活率显著高于DO组(P<0.05),但显著低于COCs组(P<0.05),且COCs组中卵子活率极显著高于DO组(P<0.01);在极体排出率方面,CODO、CCDO和DO3组差异不显著(P>0.05),但是它们都显著低于COCs组(P<0.05)。COCs、CODO、CCDO和DO 4组卵裂率差异均不显著(P>0.05)。然而,DO组的囊胚率显著低于CODO和CCDO组(P<0.05),极显著低于COCs组(P<0.01),但CODO和CCDO 2组中裸卵的囊胚率差异不显著(P>0.05)。总之,无论散在的卵丘细胞还是COCs均能提高裸卵体外成熟及后期发育潜力。