应用PCR快速诊断黄鳝嗜水气单胞菌败血症

根据致病性嗜水气单胞菌的标志性毒力基因-气溶素(aerolysin)基因序列,设计出一对特异性引物,采用PCR方法,对22尾临床疑似患嗜水气单胞菌败血症的黄鳝进行了诊断,检测出其中17尾呈致病性嗜水气单胞菌阳性,检测过程仅需6h;而常规细菌分离鉴定则耗时72 h,检出率仅为9/22.     

致病性嗜水气单胞菌多重PCR检测方法的建立

致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是近年中国各地大规模流行的淡水养殖鱼类暴发性疾病的主要病原,本研究针对GenBank中登录的致病性嗜水气单胞菌的气溶素基因(hlyA)、溶血素基因(aerA)以及为气单胞菌属所特有的内参照基因16S rRNA保守区设计了3对特异性引物,通过进行多重PCR反应体系优化,多重PCR产物的测序鉴定与特异性和敏感性实验,试图建立一种检测致病性嗜水气单胞菌的多重PCR检测方法。对8株嗜水气单胞菌、16株相关菌株进行多重PCR检测,结果显示,非致病性分离株均未扩增出毒力基因hlyA和aerA,而致病性分离株则至少含有hlyA基因;对40份送检的水产动物样品进行多重PCR检测,结果与常规微生物学检测符合率为97.5%。多重PCR检测方法具有较高的敏感性与特异性,最低可检测模板量为10 ng的样品。该方法的建立对水产动物嗜水气单胞菌病的快速诊断和分子流行病学的调查有重要意义。     

PCR扩增特异性16SrDNA和溶血素基因检测致病性嗜水气单胞菌

根据已发表的气单胞菌16S rDNA基因序列及气单胞菌气溶素(aerolysin)基因序列，设计了2对引物，建立了检测致病性嗜水气单胞菌的PCR方法。通过对12株气单胞菌的检测，发现16S rDNA引物具有高度的特异性，仅对嗜水气单胞菌扩增阳性。而Aero基因引物检测结果与采用生物学方法(鲜血平板法)检测的结果符合率为97．2％，且具有高度的敏感性，可检测最低1fg的模板。将16S rDNA与Aero基因结合PCR方法检测致病性嗜水气单胞菌与用致病性嗜水气单胞菌检测试剂盒的符合率为94．4％。该方法的建立为致病性嗜水气单胞菌的检测提供了一种简便、快速的途径，是一种比较实用的致病性嗜水气单胞菌的检测方法。     

蚌嗜水气单胞菌病的预防治疗

2001年4月份我县的部分养蚌农户中发生蚌嗜水气单胞菌病,且病情严重,死亡率很高。笔者于5月份携病蚌前往湖南省水产研究所找有关专家研究防治对策,经过病原分离、转接,结果在病蚌中分离出嗜水气单胞菌病原株,确诊为蚌嗜水气单胞菌病。经过近3年的探索,已经初步掌握了蚌嗜水气单胞菌病的发病规律、诊断方法、预防和治疗措施。现向广大养蚌农户作简单的介绍。1什么是嗜水气单胞菌嗜水气单胞菌是水体中广泛存在的一种条件致病细菌。目前,我国的科学工作者已提取3个变种,即白鲢嗜水气单胞菌,牛蛙嗜水气单胞菌和甲鱼嗜水气单胞菌。珠蚌最易感染的…     

水产养殖动物嗜水气单胞菌病的免疫技术介绍

目前在我国水产养殖动物中普遍发生的嗜水气单胞菌病如对虾细菌性红体病、肠炎病及淡水养殖鱼类暴发性出血病业已查明，其主要病原为嗜水气单胞菌，这类细菌属于弧菌科、气单胞菌属，是养殖水体普遍存在的一种条件性致病菌。嗜水气单胞菌在水温14.0-40.5℃范围内均可繁殖，以28     

嗜水气单胞菌与温和气单胞菌的LAMP检测方法的建立

利用环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）分别建立嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila,AH）与温和气单胞菌（A.sobria,AS）的快速检测方法。针对嗜水气单胞菌pilin基因、温和气单胞菌zipA基因设计特异性LAMP引物。在恒温条件下利用实时浊度仪对2组引物进行特异性和灵敏度试验,并以琼脂糖凝胶电泳和核酸染料颜色变化对扩增结果进行判定。结果显示,LAMP实时浊度法能够特异地检测嗜水气单胞菌和温和气单胞菌,最低检出限分别为46 fg·mL^-1和320 fg·mL^-1,是普通PCR方法的104倍和102倍;并能应用于已知临床样品检测。该研究建立的嗜水气单胞菌与温和气单胞菌LAMP快速检测方法具有高效、特异、灵敏的特点。     

快速简易诊断嗜水气单胞菌病的方法

近十年来,北京和全国各地养殖的淡水鱼类都相继暴发了由嗜水气单胞菌引起的传染病。阐明致病性嗜水气单胞菌的共性和区别于非致病株已成为研究控制该病的首要目标。近年来,各种检测嗜水气单胞菌方法相继被研究。本文将快速诊断嗜水气单胞菌病鉴定方法的研究报道如下。一...     

鲤隐性败血症病原菌的分离与鉴定

本文对东北地区流行的鲤隐性败血症进行了病原菌的分离、人工感染、病原菌生理、生化特性和药物敏感性的测定,观察了病理组织变化等。从病鱼内脏分离到场22株致病菌,其中标7株的生长及生化特性均符合嗜水气单胞菌种的特性,嗜水气单胞菌hec毒素检测呈阳性。有3株菌V—P(-)、赖氨酸(-)、葡萄糖产气(-)是区别嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)及温和气单胞菌(A．Sobrie)主要特征,这三株菌符合豚鼠气单胞菌(A．Caviae)种的特征。     

耐喹诺酮类药物嗜水气单胞菌的分离鉴定及电镜观察

本研究对吉林省内12个水域采集和送检的66尾病鱼进行细菌分离鉴定,共检出46株嗜水气单胞菌疑似株,通过生化试验和PCR扩增气溶素基因aer鉴定法,确定其中22株为嗜水气单胞菌。进一步采用纸片扩散法和双倍稀释法测定嗜水气单胞菌分离株对多种抗生素的耐药性,其中部分菌株存在不同程度的耐药性,22株嗜水气单胞菌中有4株对喹诺酮类药物耐药,并且为交叉耐药。其对喹诺酮类药物的抑菌圈均小于19mm。嗜水气单胞菌耐喹诺酮类药物的检出率为18 2%。将病料中分离的8株嗜水气单胞菌在电镜下观察发现,2株耐药菌表面发现均匀分布的球形结构,而6株敏感菌表面未见此结构。     

嗜水气单胞菌研究进展

嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)属于弧菌科、气单胞菌属,是嗜温、有动力的气单胞菌群,普遍存在于淡水、污水、淤泥、土壤和人类粪便中,对水产动物、畜禽和人类均有致病性,是一种典型人—兽—鱼共患病病原[1],可引起多种水产动物的败血症和人类腹泻,往往给淡水养殖业造成惨重的经济损失,已引起国内外水产界、兽医学界和医学界学者的高度重视。目前国内外学者对嗜水气单胞菌的研究已有了很大进展。本文将国内外有关嗜水气单胞菌研究现状从其毒力因子以及诊断与检测技术方面综述如下。1　毒力因子嗜水气单胞菌可产生各种毒力因子,包括…     

运动性气单胞菌分离、鉴定方法的研究与应用

通过碱性蛋白胨水（APW）的增菌效果与气单胞菌培养基（RYAN）的选择性效果试验,以及对运动性气单胞菌（Motil aeromonads）的培养特性、鉴定特征的比较观察,建立了运动性气单胞菌细菌学分离和鉴定的实验室检测程序。对8个模拟阳性样品进行检测,结果感染菌包括4株嗜水气单胞菌（A.hydrophila）、2株温和气单胞菌（A.sobia）和2株豚鼠气单胞菌（A.cavias）全部被分离到。对鱼粉、肉骨粉、牛肉粉、蛤蚧等60个动物产品样品,5个饲养牛蛙、鲫鱼和泥鳅的水样;6个牛蛙、鲫鱼、金鱼的病料进行检测,结果分离到20株运动性气单胞菌,其中8株嗜水气单胞菌,8株温和气单胞菌和4株豚鼠气单胞菌,实验表明,所建立的分离和鉴定方法是一种简便、快速和敏感的方法,其检测程序不仅运用于进出境动物产品和环境样品的检测,也可用于动物以及淡水养殖动物气单胞菌病的诊断和监测。     

3种淡水鱼病原菌多重PCR检测方法的建立与应用

根据辽宁地区常见淡水鱼病原菌嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌、蜡样芽孢杆菌的相关毒力因子,选择特异性较强的嗜水气单胞菌的溶血素(hlyA)基因、迟钝爱德华氏菌的效应蛋白(eseD)基因、蜡样芽孢杆菌非溶血性肠毒素(nheA)基因为分子靶标,分别设计1对特异性引物,建立可同步检测3种菌的多重PCR检测体系。研究结果显示,在3个毒力基因引物浓度均为0.4μmol/L,模板质量浓度为2.5 ng/μL,dNTP和酶添加量分别为2.5μL和0.3μL,退火温度为55℃时,各目的片段均可较好地扩增。敏感性试验结果表明,建立的多重PCR对嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌和蜡样芽孢杆菌的最低检测量分别为4.8、3.0 ng和2.6 ng。对临床分离的菌株样本进行检测,与16S rDNA分子鉴定结果的符合率为100%。建立的多重PCR体系检测方法特异、灵敏、快速,可同步完成淡水鱼源的嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌和蜡样芽孢杆菌的检测。     

我国南方地区鱼源气单胞菌不同种类的流行特征

为加深对我国南方地区养殖鱼类中不同种类气单胞菌流行特征的认识,选取2009年至2014年间我国南方地区70口池塘患病的草鱼、鲢鱼、鳙鱼、鲫鱼、鳜鱼、斑点叉尾和乌鳢等15种鱼类体内分离的143株气单胞菌为研究对象,通过细菌生理生化特征分析以及保守基因gyr B和rpo D的序列测序分析进行病原菌的鉴定,143株气单胞菌中有维氏气单胞菌80株,嗜水气单胞菌40株,简氏气单胞菌9株,舒氏气单胞菌10株和水生气单胞菌4株。调查分析结果表明,近年来我国南方地区养殖鱼类气单胞菌病的病原具有较高的种类多样性,其中维氏气单胞菌(80/143,56%)的出现比例最高,该菌主要感染草鱼、鲢鱼和鳜鱼等;嗜水气单胞菌次之(40/143,28%),其主要感染鳙鱼、团头鲂和斑点叉尾等;简氏气单胞菌(9/143,6%)亦常常在感染的草鱼、鳙鱼、广东鲂和锦鲤等鱼类中检出;目前,舒氏气单胞菌(10/143,7%)的感染宿主则较为单一,仅在患病乌鳢中分离得到该病原;水生气单胞菌(4/143,3%)目前仅在患病美国红鱼中发现。研究结果表明,我国南方地区鱼类气单胞菌败血症主要是由维氏气单胞菌和嗜水气单胞菌感染引起,并且常出现这两种菌的复合感染。本研究将为我国南方地区养殖鱼类气单胞菌病的流行病学分析、疾病预防和治疗奠定理论基础。     

6株鱼源嗜水气单胞菌的分子鉴定与毒力基因分析检测

为了分子鉴定6株鱼源嗜水气单胞菌,并从分子层面验证通过检测毒力基因以推测嗜水气单胞菌潜在致病性的可行性。实验采用PCR扩增16 S rDNA和gyrB基因并结合系统发育树的构建和分析进行菌种的分子鉴定,检测气溶素（ aerolysin, aer）、溶血素（ haemoly-sin, hly）、丝氨酸蛋白酶（ serine protease, ahp）、热稳定细胞肠毒素（ heat-stable cytotonic enterotoxin, ast）和热敏感细胞肠毒素（ heat-labile cytotonic enterotoxin, alt）5种毒力基因,且使用Mega 5．2对核苷酸和氨基酸序列进行分析。结果显示6株菌均为嗜水气单胞菌Aero-monas hydrophila,检测出5种毒力基因中的至少4种,其中均检测出溶血素和2种肠毒素,序列分析表明气溶素、溶血素和丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列高度保守。本研究基于16 S rD-NA和gyrB基因可以准确地对嗜水气单胞菌进行分子鉴定,6株菌的毒力基因丰富预示着一定的致病性, aer、 hly和ahp基因相对保守,编码的毒力因子高度同源,在临床分子诊断中建议使用aer、 ahp和hly基因对嗜水气单胞菌的潜在致病性进行检测。     

斑点叉尾肠败血症(ESC)PCR诊断方法的建立

由爱德华氏细菌引起的肠败血症(ESC,又称爱德华氏病)是影响斑点叉尾养殖最大的疾病。为快速和准确的诊断该疾病,本研究以NCBI公布的爱德华氏细菌eip基因(GeneBank登录号为AF037441)为模板序列,设计种特异性诊断引物,成功建立了用于斑点叉尾肠败血症病原菌的PCR检测方法。研究结果表明,该方法能够直接从发病斑点叉尾脑、肝、脾和肾组织中检测到爱德华氏菌,检测的最低量为21个细菌;同时,该诊断方法与I型荧光假单胞菌、点状产气单胞菌点状亚种、鳗弧菌、温和气单胞菌、肠型点状产气单胞菌、柱状黄杆菌、嗜水气单胞菌、河弧菌、豚鼠气单胞菌及海豚链球菌等常见水产病原菌无交叉反应。临床样品检测证明,本研究所建立的PCR检测方法可以用于斑点叉尾肠败血症的快速诊断。     

嗜水气单胞菌对框镜鲤免疫实验研究

嗜水气单胞菌是水产动物的常见致病菌,本研究利用在生理生化和PCR鉴定的基础上确定为嗜水气单胞菌,并经PCR和药物敏感性实验确定对多种抗菌药物具有耐药性的嗜水气单胞菌多重耐药株。用该菌株制备细菌疫苗对框镜鲤进行免疫实验,免疫方法采用浸洗2 min,1.5、3、6个月后分别进行注射攻毒,攻毒实验结果显示免疫保护率60%~95%,实验室安全性检测结果为安全可靠。该方法避免了逐尾鱼注射造成的较大的工作强度,为在生产实践中广泛应用预防多重耐药嗜水气单胞菌所引起的疾病奠定了基础。     

喜旱莲子草粗提物对三种鱼类病原菌抑菌效果研究

用乙醇提取法获得喜旱莲子草的粗提物 ,并分别用嗜水气单胞菌、点状气单胞菌和温和气单胞菌进行体外抑菌实验。实验结果表明 :喜旱莲子草的粗提物具有较高的抗菌作用。嗜水气单胞菌对喜旱莲子草的粗提物最敏感 ,最小抑菌浓度 (MIC)为 133 3μL/mL。     

二温式PCR检测罗非鱼嗜水气单胞菌的研究

根据基因库嗜水气单胞菌的脂肪酶基因序列设计1对特异性引物,用二温式PCR对从病死罗非鱼体内分离的8株嗜水气单胞菌进行扩增。特异性结果显示该引物对8株嗜水气单胞菌均能扩增出与预期大小相一致的760bp扩增产物,而对弧菌、肠炎杆菌、禽多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌的扩增均无任何条带。二温式PCR敏感性结果表明可以检测到10pg的嗜水气单胞菌DNA模板。     

养殖水体嗜水气单胞菌对两种药物的耐药性分析

正嗜水气单胞菌普遍存在于养殖水体中,是危害水产养殖业最重要的病原微生物之一,市售多种抗生素都能够抑杀该菌。目前,苏州地区水产养殖使用最多、最广泛的抗生素为恩诺沙星与氟苯尼考。长期不合理施用这些抗生素,导致嗜水气单胞菌的耐药性增强。本研究以2017年4-6月收集的苏州地区24株不同养殖水体的嗜水气单胞菌为研究对象,采取最低抑菌浓度测定法、耐药基因PCR特异扩增法,对苏州地区嗜水气单胞菌耐