基于RNA-Seq高通量测序技术对肉牛下丘脑基因表达分析及新基因挖掘研究

通过对9头不同月龄的安格斯母牛下丘脑组织进行转录组测序和生物信息学比较分析,筛选和挖掘与肉牛生长、繁殖活动相关候选基因和信号通路。通过转录组测序,进行表达基因分析、GO和KEGG富集分析以及信号通路筛选。结果显示,共获得59.74 Gb clean data,各组的样品clean data均达到6.64 Gb, Q30碱基百分比平均在94.60%及以上。有18 979个基因在所有组织中都有表达,有1 706个基因只在2个月龄段下丘脑组织中共同表达,有2 149个基因只在其中的1个月龄段下丘脑组织中表达。在所有下丘脑所表达的基因中,GO、KOG和KEGG数据库得到注释的分别为2 621,12 930和13 453个。在所有KEGG通路中,血管内皮生长因子信号通路、Notch信号通路和Hippo信号通路在各年龄段下丘脑组织中检出频率最高,说明这些信号通路可能通过下丘脑和性腺轴对母牛生殖活动产生影响。     

基于转录组测序数据的山羊下丘脑组织繁殖相关信号通路及候选基因的筛选

旨在通过对不同光照时长条件下河南槐山羊下丘脑组织进行转录组测序和生物信息学分析,筛选出与山羊繁殖相关的信号通路及候选基因。本研究利用Illumina二代高通量测序平台(NGST),采用PE150测序策略,对经自然光照(8 h光照:16 h黑暗)与人工光照(16 h光照:8 h黑暗)条件处理后的8只空怀母羊(每组各4只,平均年龄1周岁)下丘脑组织进行转录组测序,将组装得到的Unigene总数比对到参考基因组序列,进行差异表达基因分析、GO和KEGG富集分析以及候选基因筛选,并采用Real-time PCR方法对候选基因的相对表达量变化进行分析。结果显示,RNA-Seq共得到了约4.4亿条reads,平均每个样本的reads数约为5 249万条;自然光照与人工光照2组DESeq分析得到448个差异表达基因,并富集在KEGG数据库中的241个信号通路,其中包括5个与繁殖相关的信号通路;3个速激肽家族候选基因(TACR1、TACR2和TACR3)显著富集在Calcium signaling pathway(钙离子信号通路,chx04020)通路;Real-time PCR分析结果显示,转录组测序结果可靠。综上表明,Calcium signaling pathway(钙离子信号通路,chx04020)与TACR1、TACR2和TACR3基因,可能在山羊繁殖过程中发挥着重要作用。     

仔猪生长发育关键基因筛选和功能分析

为揭示对仔猪背最长肌和皮下脂肪组织生长发育过程起关键作用的基因,从GEO数据库下载背最长肌和皮下脂肪组织各18个转录组测序数据,采用Ensembl release 104版本的猪基因组和注释文件,进行生物信息学分析。结果显示,在所有样本中共获得79 800个转录本,其中包括29 118个mRNA、2 105个已知长链非编码RNA (lncRNA)和47 142个新的转录本。两种组织中共获得34 873个差异表达的转录本,包括12 536个差异表达的mRNA。对差异表达的mRNA进行KEGG和GO功能富集分析显示,肌节组织(sarcomere organization)、肌动蛋白细胞骨架组织(actin cytoskeleton organization)等通路与背最长肌发育性能相关,关键基因包括MYPN、TNNT1和PDLIM3等;脂肪细胞因子信号通路(Adipocytokine signaling pathway)、鞘脂信号通路(Sphingolipid signaling pathway)、脂肪酸代谢(Fatty acid metabolism)等通路与脂肪组织发育相关,关键基因包...     

不同繁殖季节绵羊卵巢组织中piRNAs序列特征及表达差异分析

为了分析绵羊卵巢组织中piRNAs的序列特征及不同繁殖季节绵羊卵巢组织中piRNAs的表达差异,本试验采用Solexa测序技术对休情季节（休情期）和发情季节（卵泡期和黄体期）滩羊卵巢组织进行高通量测序,采用生物信息学方法筛选绵羊卵巢中的piRNAs,对piRNAs的长度分布、首位碱基偏好、基因组来源、染色体分布、链特异性、ping-pong循环特征、piRNAs比对重复序列类型进行分析,并对发情季节与休情季节绵羊卵巢之间差异表达的piRNAs进行靶基因预测及其靶基因的GO功能和KEGG Pathway富集分析。结果显示,绵羊卵巢中不同长度的piRNAs首位碱基偏好性不一致;3个时期（休情期、黄体期和卵泡期）的piRNAs均主要比对到基因内含子、编码区及lncRNA区域,而比对到重复序列的piRNAs相对较少;绵羊卵巢piRNAs在染色体上呈不均匀分布;绵羊piRNAs簇存在很强的链特异性,但首位碱基偏好性不明显;3个时期的piRNAs均无明显的ping-pong循环特征。KEGG富集分析发现,差异piRNA靶基因主要富集在RNA运输通路（RNA transport pathway）、嘌呤代谢通路（purine metabolism pathway）、黏着斑通路（focal adhesion）、PI3K-Akt信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、Hippo信号通路（Hippo signaling pathway）等与绵羊繁殖相关的通路。本研究揭示了不同繁殖季节绵羊卵巢组织中的piRNAs序列特征,暗示绵羊卵巢组织中的piRNAs可能通过BAD等基因和黏着斑通路等调控绵羊季节性繁殖,为深入解析绵羊季节性发情分子机制提供一定参考。     

不同繁殖季节绵羊卵巢组织中piRNAs序列特征及表达差异分析

为了分析绵羊卵巢组织中piRNAs的序列特征及不同繁殖季节绵羊卵巢组织中piRNAs的表达差异,本试验采用Solexa测序技术对休情季节(休情期)和发情季节(卵泡期和黄体期)滩羊卵巢组织进行高通量测序,采用生物信息学方法筛选绵羊卵巢中的piRNAs,对piRNAs的长度分布、首位碱基偏好、基因组来源、染色体分布、链特异性、ping-pong循环特征、piRNAs比对重复序列类型进行分析,并对发情季节与休情季节绵羊卵巢之间差异表达的piRNAs进行靶基因预测及其靶基因的GO功能和KEGG Pathway富集分析。结果显示,绵羊卵巢中不同长度的piRNAs首位碱基偏好性不一致;3个时期(休情期、黄体期和卵泡期)的piRNAs均主要比对到基因内含子、编码区及lncRNA区域,而比对到重复序列的piRNAs相对较少;绵羊卵巢piRNAs在染色体上呈不均匀分布;绵羊piRNAs簇存在很强的链特异性,但首位碱基偏好性不明显;3个时期的piRNAs均无明显的ping-pong循环特征。KEGG富集分析发现,差异piRNA靶基因主要富集在RNA运输通路(RNA transport pathway)、嘌呤代谢通路(purine metabolism pathway)、黏着斑通路(focal adhesion)、PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、Hippo信号通路(Hippo signaling pathway)等与绵羊繁殖相关的通路。本研究揭示了不同繁殖季节绵羊卵巢组织中的piRNAs序列特征,暗示绵羊卵巢组织中的piRNAs可能通过BAD等基因和黏着斑通路等调控绵羊季节性繁殖,为深入解析绵羊季节性发情分子机制提供一定参考。     

单多羔湖羊下丘脑转录组比较分析

通过对湖羊下丘脑组织进行转录组分析,旨在挖掘影响多羔性状的关键功能基因。分别选取三羔组湖羊(n=3)和单羔组湖羊(n=3),利用转录组测序(RNA-Seq)技术对下丘脑cDNA文库进行测序和生物信息学分析,然后采用实时定量PCR验证差异基因在下丘脑组织中的表达情况。通过比较分析转录组数据,共筛选出56个差异基因,其中三羔组中有24个基因上调,32个基因下调。GO分类注释显示,差异基因与器官发育、信号传导、转录调控等生物学过程存在密切关联,同时与DNA结合、蛋白结合、ATP结合等分子事件表现活跃。KEGG通路分析显示,神经信号传递通路、γ-氨基丁酸信号通路可能在湖羊下丘脑调控排卵及卵泡发育方面发挥着重要的调控作用。随机选择5个差异表达的基因进行q-PCR验证,定量结果与测序结果一致。本研究结果为进一步阐述湖羊下丘脑的基本分子机理奠定基础,同时也为全面理解湖羊多羔特性提供新的思路。     

乏情和发情初产母猪下丘脑-垂体轴中miRNA表达谱比较分析

【目的】从神经内分泌系统揭示微小RNA(microRNA,miRNA)调控初产母猪情期活动的遗传机制。【方法】利用RNA-Seq技术对乏情和发情初产母猪下丘脑-垂体轴中的small RNA进行测序,获得了母猪下丘脑和垂体miRNA表达谱,并对筛选的差异表达miRNA进行GO和KEGG等功能分析。【结果】从所构建的4个文库中共鉴定出1 096个miRNAs,其中已知miRNAs 364个,新预测miRNAs 732个。以发情母猪为对照,在乏情母猪的下丘脑有16个miRNAs存在差异表达,其中6个上调,10个下调;在乏情母猪垂体有9个miRNAs存在差异表达,其中2个上调,7个下调。下丘脑中16个差异表达miRNAs共预测到5 212个靶基因,垂体中9个差异表达miRNAs共预测到6 897个靶基因。下丘脑中靶基因主要在细胞投射组装、质膜结合的细胞投射组装、神经元投射发育的负调控、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性等GO条目及Ras信号通路、神经营养因子信号通路、ErbB信号通路、mTOR信号通路等KEGG信号通路中显著富集;垂体中靶基因主要在mRNA加工调控、Ras GTP酶结合、泛素样蛋白连接...     

连城白鸭与沔阳麻鸭胸肌转录组比较

为了解连城白鸭与沔阳麻鸭肉质的差异,本研究选择300日龄连城白鸭与沔阳麻鸭各3只母鸭,测定胸肌粗脂肪、肌苷酸含量,同时对胸肌组织进行转录组高通量测序筛选品种间的差异表达基因,并对其功能进行注释、KEGG通路分析,挑选部分基因进行荧光定量PCR验证。结果显示:2个品种胸肌转录组测序得到40.6 Gb Clean Data,各样品的Clean reads与北京鸭参考基因组的比对效率在68.65%~72.17%。共筛选2333个差异表达基因,其中连城白鸭显著高表达1060个,沔阳麻鸭显著高表达1273个。差异表达基因共富集到280条信号通路中,67条通路显著富集,其中多条通路和肌肉脂肪沉积、能量代谢以及各类物质代谢相关。ACDC、FABP4、AMPD1、MITF、MAOA和CSAD等差异表达基因可能对不同品种鸭特异的肉质风味形成产生影响。经qRT-PCR验证,测序结果可靠。连城白鸭与沔阳麻鸭胸肌转录组比较显示不同地方鸭品种肉质存在一定差异。     

不同产羔数绵羊性腺轴比较转录组研究

试验通过对巴美肉羊性腺轴进行转录组分析,旨在挖掘影响多羔性状的关键功能基因。分别选取双羔组巴美肉羊5只、单羔组4只,利用转录组测序（RNA-Seq）技术对下丘脑、垂体、卵巢转录组文库进行测序,然后对得到的测序数据进行生物信息学分析。测序数据经过质量控制后,27个样品共得到112 Gb的有效数据。差异基因分析表明,与单羔组相比,双羔组下丘脑中,上调表达基因111个,下调表达基因106个;垂体组织中,上调表达基因97个,下调表达基因142个;卵巢组织中,上调表达基因182个,下调表达基因67个。功能富集性分析表明,神经活性的配体－受体相互作用信号通路在下丘脑－垂体－卵巢性腺轴调控排卵及卵泡发育方面发挥着重要的调控作用。通过不同产羔数巴美肉羊性腺轴比较转录组研究,提供了全部的转录本信息,筛选了影响产羔数的相关功能基因,丰富和补充了绵羊基因组信息,为进一步阐明绵羊繁殖力差异的分子机制奠定基础。     

基于高通量测序的水貂胚胎滞育期和激活期卵巢转录组分析

试验旨在获取胚胎滞育期与激活期水貂卵巢组织的转录组信息，挖掘滞育的胚胎激活前后水貂卵巢差异表达基因（DEGs）及其功能信息，为探讨卵巢信号调控水貂胚胎滞育的分子机制提供参考。随机采集8只健康雌性水貂（胚胎滞育期和激活期各4只）的卵巢组织为样本，利用Illumina HiSeq平台RNA-Seq技术对其进行转录组测序，筛选在水貂胚胎滞育期和激活期卵巢中的DEGs并进行生物信息学分析。结果显示，测序获得661 195 568个raw reads，经过滤后获得650 834 900个clean reads，组装后得到389 895个unigenes，通过与Nr、GO、KOG和KEGG数据库比对，对unigenes进行注释，其中Nr数据库注释了156 419个unigenes；GO数据库注释了122 657个unigenes；KOG数据库注释了58 320个unigenes；KEGG数据库注释了72 653个unigenes。滞育期和激活期卵巢中有1 797个DEGs，与胚胎滞育期水貂卵巢相比，激活期卵巢有1 298个DEGs显著上调，499个DEGs显著下调。GO功能分析发现，DEGs显著富集的生物学过程主要有跨膜信号受体活性、信号受体活性、G蛋白偶联受体活性、酶联受体蛋白信号通路、细胞表面受体信号通路、细胞周期阻滞、芳香酯酶活性。KEGG通路分析发现，水貂滞育期和激活期卵巢中的DEGs显著富集于神经活动配体-受体相互作用信号通路。本研究利用高通量测序技术获得水貂胚胎滞育期与胚胎激活期卵巢的转录组信息，为深入探究水貂卵巢调节胚胎滞育的分子机制奠定了基础。     

藏鸡与白羽肉鸡垂体转录组差异表达研究

试验旨在通过对藏鸡和白羽肉鸡垂体转录组测序和生物信息学分析,筛选出与鸡生长发育相关的差异表达基因（differentially expression genes,DEGs）及信号通路。本研究选用42日龄健康藏鸡和白羽肉鸡各3只,分别采集垂体组织利用Illumina HiSeq 2000平台进行转录组mRNA测序,对筛选到的DEGs筛选DEGs,GO和KEGG数据库功能注释和富集分析,实时荧光定量PCR验证随机挑选的DEGs表达水平。结果显示,藏鸡和白羽肉鸡分别获得126 094 302和125 666 442条clean reads。与白羽肉鸡相比,藏鸡垂体组织中共有DEGs 392个,其中196个为上调基因,196个为下调基因（P<0.05）,其中包括生长激素（GH）基因、生长激素释放激素受体（GHRHR）基因和胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白1（IGF2BP1）基因。GO和KEGG富集分析发现,DEGs显著富集于细胞黏附分子信号通路和神经活性配体-受体相互作用信号通路等细胞通讯相关的信号通路,GH、GHRHR和IGF2BP1基因也显著富集于神经活性配体-受体相互作用信号通路。实时荧光定量PCR结果显示,转录组测序结果准确可靠。综上研究,本研究初步揭示了影响藏鸡和白羽肉鸡生长发育速度差异的关键候选基因和信号通路,为了解鸡垂体组织调节生长发育的分子机制提供了理论依据。     

鸭瘟病毒感染鸭十二指肠黏膜炎症相关基因及调控通路的筛选

试验旨在分析鸭瘟病毒（duck plague virus，DPV）感染樱桃谷鸭后十二指肠黏膜转录组水平的变化，筛选出DPV感染后参与炎症的相关基因和调控通路。DEV-GZ株经腿部肌肉接种35日龄鸭后，于接种后24、48和72 h采集鸭十二指肠黏膜组织样本，提取总RNA进行转录组测序，对数据进行质控与注释，筛选与炎症相关的差异表达基因及调控通路，并应用实时荧光定量PCR对部分差异表达基因进行验证。结果显示，对照组与试验组总计得到21.39 Gb的Clean Bases，测序样本有效序列占原始序列的99%以上，映射率高于83%。鸭接毒DPV后24 h十二指肠黏膜的差异表达基因有221个，参与炎症相关生物学过程的有3个，均为下调基因；接毒DPV后48 h差异表达基因有499个，参与炎症相关生物学过程的有17个，均为下调基因；接毒DPV后72 h差异表达基因有798个，参与炎症相关生物学过程的有20个，其中上调基因13个、下调基因7个。GO数据库分析显示，参与炎症相关的差异表达基因主要是CCR8、CCL19、CCL4、IL-17、IRF1、IFN-γ、SLC11A1等，涉及急性炎症反应、趋化因子受体活性、急性期反应、炎症反应和炎症反应的正调节等生物学过程。KEGG数据库分析显示，差异表达炎症相关基因主要富集在Toll样受体信号通路、NF-κB信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路和炎症性肠病等；实时荧光定量PCR结果显示，IFN-γ和MALT基因的相对表达倍数与转录组结果基本一致。本试验完成了DPV感染樱桃谷鸭十二指肠的转录组测序分析，获取了差异表达基因的功能注释信息，初步揭示了参与DPV感染的炎症相关通路，为深入探究DPV的致病机制提供了理论参考。     

基于RNA-Seq技术的塔里木马鹿毛色相关差异表达基因筛选及初步分析

旨在基于RNA-Seq技术对塔里木马鹿毛色相关基因进行筛选及分析。采用Illumina Hi Seq TM2000测序平台对塔里木马鹿和天山马鹿的皮肤组织进行转录组测序,所得序列经质控、组装后比对到NR、Swiss-Prot、COG、KOG、KEGG、GO和Pfam数据库中注释,并对差异表达基因进行筛选、功能注释和富集分析。结果表明,测序获得25 038个有注释信息的Unigenes,比对分析显示,塔里木马鹿与天山马鹿有922个差异表达基因,其中上调表达基因495个,下调表达基因427个;GO功能富集分析结果显示,568个差异表达基因富集到61个GO条目上,分别参与了生物学过程、细胞组分及分子功能;KEGG代谢通路富集分析发现,在差异表达基因中富集最显著的代谢通路是ECM-受体相互作用。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法分析与塔里木马鹿毛色相关的7个候选基因的转录水平变化来验证转录组测序结果的准确性和可靠性,这些基因的表达趋势与转录组测序结果相一致。ECM-受体相互作用、蛋白质消化与吸收、PI3K-Akt信号通路及与黑色素合成相关的酪氨酸等通路可能与塔里木马鹿的毛色有关;候选基因MITF、Ggt1、VDR、PTPRF、CⅡTA、ARPC5L、POMC等可能在塔里木马鹿毛色形成过程中发挥重要作用。本研究结果为今后塔里木马鹿毛色相关基因的分子调控机制方面及挖掘潜在的新基因提供了丰富的试验数据。     

福清山羊和戴云山羊夏季发情期卵巢组织比较转录组分析

试验旨在从分子遗传学角度探讨戴云山羊夏季维持较高繁殖力的遗传机制,从中发掘有用的遗传变异信息。利用转录组测序方法对福清山羊和戴云山羊夏季发情期卵巢组织进行研究,筛选品种间的差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）,利用基因本体（gene ontology,GO）、蛋白相邻类的聚簇（cluster of orthologous groups of proteins,COG）和京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）数据库对筛选的差异表基因进行功能注释,并进行差异表达基因聚类分析,通过实时荧光定量PCR验证测序结果。结果显示,福清山羊和戴云山羊发情期卵巢的DEGs共357个,其中上调基因221个,下调基因136个。357个DEGs中的287个基因能够被GO数据库注释,78个DEGs能够被COG数据库注释,219个DEGs能够被KEGG数据库注释。KEGG数据库注释结果显示,这些差异基因显著富集的信号通路为蛋白消化吸收（protein digestion and absorption）、吞噬体（phagosome）、肺结核（tuberculosis）、胞外基质受体互作（ECM-receptor interaction）、金黄色葡萄球菌感染（Staphylococcus aureus infection）、同种异体移植物排斥（allograft rejection）等通路。经实时荧光定量PCR验证,所选基因（转录本）表达变化模式与转录组测序结果一致,表明测序结果可靠。本试验利用高通量测序获得大量山羊卵巢转录组信息,有助于从分子水平对山羊卵巢进行深入研究。