油菜含MATH结构域基因BnaMT1的克隆及表达分析

利用已构建的甘蓝型油菜种子发育过程SSH文库,筛选得到1个含MATH结构域的EST序列,并以其为信息探针,经电子克隆获得了该基因的全长cDNA,命名为BnaMT-1。BnaMT-1的开放阅读框(ORF)全长1 209 bp,编码402个氨基酸,相对分子质量为46 130.7,预测的理论等电点为8.50,其结构包括信号肽、跨膜结构及2个连续的MATH结构域,为亲水性胞外分泌蛋白;进化树分析发现,该基因与拟南芥含MATH结构域基因亲缘关系较近;利用半定量RT-PCR技术对该基因在甘蓝型油菜湘油15号不同组织及种子不同发育时期的表达分析表明:BnaMT-1在叶、花和果荚中都有表达,在根和茎中没有表达;种子发育过程中,BnaMT-1均有表达,且表达量于花后30～35 d最高,之后表达量下降。推测该基因可能与种子发育及油脂合成代谢相关。     

芥蓝BoaBKI1基因的克隆及表达分析

[目的]克隆芥蓝中的BoaBKI1基因,进行生物信息学与表达分析.[方法]采用改良CTAB法提取芥蓝总RNA,并反转录为cDNA;设计引物,克隆BoaBKI1基因;使用生物信息学方法分析BoaBKI1基因序列;用半定量PCR进行BoaBKI1基因的时空表达分析.[结果]成功克隆到BoaBKI1基因,序列分析显示其开放阅...     

甘蓝型油菜生物节律钟输出基因BnGI的克隆和表达分析

利用同源克隆的方法,以拟南芥GIGANTEA基因为种子序列,在甘蓝型油菜中克隆得到GI基因,命名为BnGI。序列分析结果表明:该基因编码区全长为3 516bp,编码1 171个氨基酸,与白菜GI基因序列同源性达99%,与拟南芥GI基因同源性达87%。成熟蛋白的等电点为6.59,分子量为127.15kDa,亚细胞定位预测在细胞核定位。荧光半定量检测结果表明:BnGI基因在根、茎、顶端分生组织、叶、花等中均有表达,但表达水平具有组织特异性。     

红肉苹果MpMYBPA1的克隆及表达分析

利用RACE和电子克隆技术相结合的方法从野生红肉苹果(Malus pumila var.niedzwetzkyana Schneid)中克隆了1个MYB类转录因子的全长序列,利用生物信息学方法对其进行分析,同时进行了亚细胞定位分析以及表达特性的研究。结果表明:该基因全长为1 020 bp,编码340个氨基酸;其核苷酸序列与葡萄MYBPA1同源性最高,命名为MpMYBPA1,其N端含2个约有55个氨基酸组成的MYB特征结构域。亚细胞定位分析结果表明MpMYBPA1蛋白定位在细胞核中。荧光定量PCR结果表明:MpMYBPA1基因在根、茎、叶、果皮中均有表达,果皮中表达量最大。在20℃处理4 d后该基因的表达量得到了上调,而在30℃高温条件下,该基因的表达上调不明显,说明低温有利于该基因的表达,并且该基因受ABA调控。推测MpMYBPA1基因可能参与苹果的着色过程。     

甘蓝型油菜湿害相关基因BnLDH-1的克隆和表达分析

采用RACE技术从中双9号中克隆了甘蓝型油菜BnLDH-1基因全长cDNA序列和基因组序列。BnLDH-1基因的DNA序列为1 432 bp,包含1个内含子;cDNA序列全长1 319 bp,含有1个1 053 bp的ORF,其编码蛋白含350个氨基酸。经预测发现,BnLDH-1蛋白存在LDH-1保守结构域。qRT-PCR结果表明,湿害诱导BnLDH-1表达,但在不同耐湿性甘蓝型油菜品种中,BnLDH-1的诱导表达水平不同。相关分析表明,湿害胁迫后48 h的BnLDH-1表达量与12份测试的甘蓝型油菜材料的耐湿指数呈显著负相关,其相关系数为0.73。     

甘蓝型油菜BnTIR1基因的克隆和表达特征分析

植物的转运抑制应答因子1(transport inhibitor response 1,TIR1)作为生长素的受体,在生长素信号的感知与转导过程中发挥重要作用。采用RACE技术从中双9号中克隆了甘蓝型油菜BnTIR1全长c DNA序列和基因组序列。BnTIR1的DNA序列为2 502 bp,包含2个内含子;c DNA序列为2 355 bp,ORF为1 824 bp,其编码蛋白含607个氨基酸。预测发现,BnTIR1蛋白存在AMN1保守结构域。qRT-PCR结果表明,BnTIR1在甘蓝型油菜根、茎、叶、芽、花、角果中均有表达,但表达水平不同,在叶中表达水平最高,花中最低;干旱和ABA均可诱导BnTIR1表达,暗示其可能参与植物逆境胁迫响应过程。     

桂花OfAP1基因的克隆及表达分析

AP1（APETALA1）基因在植物花分生组织及花器官形成过程中发挥着重要作用。以桂花品种‘堰虹桂’Osmanthus fragrans‘Yanhonggui’为材料,根据前期获得的转录组数据中AP1的序列设计引物,利用PCR技术,克隆得到约750 bp桂花AP1 cDNA序列,即OfAP1基因,其中开放阅读框长为720 bp（注册号为MH593222）。氨基酸序列比对发现,与其他物种的AP1基因的同源性高达69%~88%。荧光定量PCR结果表明:在不同组织中,桂花的OfAP1基因在花芽中的表达量显著高于其他组织,根中几乎不表达;在花芽分化过程中,OfAP1在成花转变及花芽分化初期（花瓣、花萼分化期）表达量较高,随后呈下降趋势。这说明OfAP1具有组织表达特异性,同时在桂花成花转变、花芽分化和发育中有重要作用。     

油菜BnERF1基因的克隆及其过表达载体的构建

利用拟南芥ERF1基因的序列,在NCBI数据库中检索油菜(Brassica napus)ERF1基因的序列信息,并设计特异性引物,PCR扩增油菜BnERF1基因。结果表明,成功扩增出油菜BnERF1基因,并构建了过表达载体pCAMBIA2301-ERF1,为进一步研究BnERF1的抗病分子机理和选育新的抗病油菜种质奠定了试验基础。     

哈密瓜果实转录因子CmCBF_1的克隆及表达分析

【目的】研究CBF在哈密瓜果实采后抗冷过程中的调控功能,对转录因子CmCBF_1进行克隆与表达分析,为进一步研究哈密瓜果实低温贮藏过程中的冷害发生机制提供理论依据。【方法】以新密3号采后离体果实为试材,根据已报道的甜瓜CBF1预测序列(XM_008440940),与基因组甜瓜组(https://melonomics.net)进行BLAST比对,确定基因编码区起始和终止位置,针对CBF1编码区设计特异性引物,通过对果实c DNA进行扩增,获得CBF1全长序列,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析其在不同温度条件下的表达特性。【结果】克隆获得哈密瓜果实转录因子CBF1,命名为CmCBF_1,该基因序列为639 bp(Gen Bank登录号为KT737742),编码212个氨基酸,蛋白质分子量为23.89 k Da,等电点为5.23;同源性分析表明,哈密瓜果实转录因子CmCBF_1与草莓Fa CBF1亲缘关系较近,达到85%。qRT-PCR分析结果显示,哈密瓜果实转录因子CmCBF_1在1、3及5℃低温诱导条件下特异性表达,在20℃室温条件下几乎不表达。【结论】转录因子CmCBF1的表达与哈密瓜果实采后冷害发生负相关(r=-0.663)。     

枣树花分生组织特异基因ZjAP1的克隆与表达分析

以枣树(Ziziphus jujuba Mill)为试材,通过反转录RT-PCR和快速扩增cDNA末端的方法,从花萼片组织中克隆获得一个花分生组织特异性基因的全长序列(SQUA/AP1同源基因),命名为ZjAP1(GenBank登录号:EU916199)。生物信息学分析ZjAP1cDNA序列的开放阅读框长度为738bp,编码245个氨基酸,保守域含有SQUA/AP1家族典型的MADS盒蛋白、K盒结构域。ZjAP1的氨基酸序列与其他植物SQUA/AP1具有很高的相似性,进化树分析表明,ZjAP1和其他物种的AP1起源于相同的祖先。半定量RT-PCR分析表明,ZjAP1在花芽、花蕾、花、幼果中都有表达,在结果枝中整个花发育过程中一直有表达,在营养枝和膨大的果实及种仁组织中没有表达,说明ZjAP1与花发育的调控有关。     

甘蓝型油菜乙酰辅酶A羧化酶3个亚基基因的克隆及其表达

[目的]为构建乙酰辅酶A羧化酶的叶绿体表达载体奠定基础。[方法]以从甘蓝型油菜叶片中提取的叶绿体基因组DNA为模板进行PCR扩增,克隆羧基转移酶β亚基基因。以从开花20~29 d后油菜幼胚中提取的总RNA为模板进行RT-PCR扩增,克隆生物素羧化酶和生物素羧基载体蛋白的cDNA序列。最后,乙酰辅酶A羧化酶的3个亚基基因被克隆到大肠杆菌表达载体中。[结果]SDS-PAGE分析结果表明乙酰辅酶A羧化酶的3个亚基基因分别被克隆到大肠杆菌表达载体中。乙酰辅酶A羧化酶的3个亚基基因在大肠杆菌中的表达产物分别为76.6、44.0和81.5 kD,其融合蛋白分别占总菌体蛋白的12%、10%和6%。[结论]不同品种的甘蓝型油菜生物素羧基载体蛋白cDNA序列存在较大差异。     

甘蓝型油菜ADP-核糖基化因子基因全长cDNA克隆及表达分析

 【目的】克隆甘蓝型油菜（Brassica napus L.）矮化突变体“NDF-1”和野生型近等基因系亲本“3529”中ADP-核糖基化因子（ADP-ribosylation factor,ARF）基因全长cDNA,分析矮化突变体中该基因在不同组织中的表达水平,探讨矮化突变体中该基因在甘蓝型油菜茎杆发育过程中的作用。【方法】采用SSH（suppression subtractive hybridization）、RACE（rapid-amplification of cDNA ends）和RT-PCR技术,克隆甘蓝型油菜矮化突变体“NDF-1”和野生型“3529”中的ARF基因的全长cDNA序列。分别采集甘蓝型油菜野生型和矮化突变型苗期子叶、薹期根、茎尖和真叶,采用相对定量PCR方法检测矮化突变体中该基因的表达。【结果】获得了甘蓝型油菜矮化突变体“NDF-1”和野生型“3529”的ARF基因的全长cDNA,分别命名为BnARF和BnARF-h。序列分析表明：这两个基因长度分别为837和802 bp,都含有546 bp的完整开放阅读框（ORF）,编码181个氨基酸,与其它植物、动物和酵母的ARF基因有很高的相似性。BnARF基因在野生型和矮化突变体的根、子叶、茎尖和真叶中均有表达,其中在子叶中表达量最高,真叶中次之,根和茎尖中的表达量最少。同时BnARF在矮化突变体的根、子叶和茎尖中的表达量都显著低于野生型,但在真叶中表达量相近。【结论】克隆了甘蓝型油菜矮化突变体“NDF-1”和野生型“3529”中ADP-核糖基化因子基因的全长cDNA,这两个ARF基因的序列上有两处碱基存在差异,其中一处是错义突变,推测这一突变可能与植株矮化有关。而BnARF基因在野生型和矮化突变体的根、子叶和茎尖的表达存在显著性差异,可能参与了甘蓝型油菜的矮秆发育过程。     

甘蓝型油菜ADC基因片段的克隆及序列分析

[目的]克隆甘蓝型油菜精氨酸脱羧酶(ADC)基因的cDNA片段,为进一步获得ADC基因全长及研究其的生物学功能奠定基础.[方法]以甘蓝型油菜(Brassica napus L.)品种中双6号的花蕾为材料,设计简并引物,采用同源克隆法扩增ADC基因的cDNA片段.[结果]成功扩增获得8个不同的ADC基因拷贝,按长度将其分为1011、999、981 bp 3类,8个拷贝核苷酸序列之间的同源性为81%~99%,其推导氨基酸序列之间的同源性为86%~99%.1011 bp片段包含3种不同的序列S1 ~S3,序列间存在9个单核苷酸多态性(SNP)位点.999 bp序列包含S4和S5,具有3个SNP位点,两个区段出现连续碱基缺失.981 bp序列包含S6~S8,发现14个SNP位点,且第67位核苷酸出现无义突变,4个区段发生碱基缺失.序列S4~S8共同缺失第632~634、642~650位的核苷酸小片段.氨基酸同源比对和系统进化分析结果表明,8个不同ADC基因拷贝与芥菜(Brassica juncea L.)、拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)、盐芥(Thellungiella halophila L.)等物种的ADC基因同源性高,亲缘关系近.[结论]所获得的8个基因拷贝即为来自于甘蓝型油菜ADC基因的片段.     

甘蓝型油菜叶绿体多顺反子单交换表达载体构建

[目的]为研究质体定位的乙酰辅酶A羧化酶转化叶绿体奠定基础。[方法]根据GeneBank上的甘蓝型油菜的叶绿体DNA序列设计1对引物,通过PCR扩增获得与甘蓝型油菜叶绿体基因组可发生同源重组的DNA片段,构建甘蓝型油菜叶绿体多顺反子单交换表达载体,并在大肠杆菌中通过平板定性分析和Western印迹对所构建载体上的表达盒进行功能鉴定。[结果]以甘蓝型油菜的叶片叶绿体基因组DNA为模板进行PCR扩增,获得4 357 bp的DNA片段,包含2个开放阅读框RbcL和β-CT。成功构建了甘蓝型油菜叶绿体多顺反子单交换表达载体pHBM720,而且同一多顺反子的3个基因均在大肠杆菌中得到表达。[结论]该叶绿体多顺反子单交换表达载体具有较强的通用性与安全性,比双交换表达载体更具优越性。     

甘蓝型油菜利用自交不亲和性的杂种优势

以一个自交不亲和系1010为共同母本与6个品种杂交,产生6个F_1代.用平均优势率、超亲优势率和对照优势率测定了F_1代的优势表现。结果表明,小区产量、主花序长、叶丛期叶长叶宽及主花序角果数的优势较强.讨论了三个优势指数的关系、杂种优势形成的原因及亲子间的相关性。     

油菜N13和N18上含油量QTL作图区间相关候选基因克隆

以前人报道的SG-图谱和DH群体为材料,利用拟南芥脂质基因库和芸薹属EST库信息资源,选择与拟南芥中诠释的重要油脂合成相关基因高度同源的甘蓝型油菜EST和其他具有基因信息的EST序列为标记来源,发展功能基因标记加密SG图谱;对定位在N13和N18连锁群上含油量QTL区间的相关基因片段进行克隆、测序和生物信息学分析,以期获得可能与种子含油量QTL有关联的侯选基因。结果表明:在2条连锁群的3个含油量QTL区域内共连锁上6个功能基因,其中与拟南芥同源的3个基因在油脂合成途径中发挥重要作用;其双亲差异片段经克隆测序和比对分析,发现有2个在双亲间存在氨基酸水平差异;将获得的基因片段和拟南芥同源基因序列比对结果显示,二者间内含子部分核苷酸序列相似率平均为57.7%,外显子区域为86.7%,氨基酸水平上则达到89.2%。