番石榴最适ISSR-PCR反应体系的建立与验证

为更好地将ISSR标记应用于番石榴种质研究,以"维邦2号"番石榴DNA为筛选体系试验材料,采用单因子试验对ISSR-PCR反应中Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq酶浓度、DNA浓度进行了优化;选用引物UBC810对9份番石榴种质进行PCR反应,选取"南宁本地番石榴实生2号"DNA作为模板对8条ISSR引物进行PCR反应,对优化扩增体系进行验证。结果表明,番石榴20μL最适ISSR-PCR反应体系为1.0mmol/L Mg~(2+),0.25mmol/L dNTPs,0.8μmol/L引物,0.2U Taq酶,10ng的DNA(2.0μL 10×Buffer,加入适量ddH2O至20μL)。验证试验得到的扩增产物条带多态性丰富,且特异性强、重复性好。试验确立的最适ISSR-PCR反应体系适用于番石榴的ISSR分子标记。     

石榴ISSR-PCR反应体系的正交设计优化

现利用正交设计L16(45)探讨DNA模板、Mg2+、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶对石榴ISSR-PCR反应体系的影响,首次应用加权平均法及百分制对正交实验结果进行评分,并应用DPS数据处理系统进行数据分析;同时对石榴ISSR-PCR最佳反应体系进行退火温度梯度试验。结果表明:适合石榴的ISSR-PCR最优反应体系(25μL)为:Mg2+1.75 mmol/L、dNTPs0.15 mmol/L、TaqDNA聚合酶1 U、引物0.8 mmol/L、DNA模板20 ng;引物UBC 811的最适退火温度为51.2℃,且最适退火温度因引物而异。     

番茄EST-SSR标记PCR反应体系的优化

应用L16 (44)正交实验优化番茄EST-SSR标记PCR反应体系.结果表明:20 μL体系中各反应物最适浓度为:DNA模板45 ng/20μL,引物0.75 μmol/L,Mg2+ 2.0 mmol/L,dNTPs0.4 mmol/L,Taq DNA酶0.5 U/20μL,且Mg2+对该标记反应体系影响最大.利用5对EST-SSR引物及P1、P2基因组DNA验证优化体系的可靠性,为该标记在番茄基因组分子标记辅助育种提供了试验依据.     

茶花品种ISSR指纹图谱反应体系建立与优化

以30个茶花品种为试材,采用5因素4水平正交实验以及单因素优化试验方法,研究Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度和模板DNA浓度对ISSR-PCR指纹图谱条带清晰度的影响,以进行茶花品种ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选。结果表明:茶花品种ISSR-PCR最适扩增条件为25μL反应体系中,Mg2+3.0mmol/L、dNTPs 0.2mmol/L、引物0.3mmol/L、Taq DNA聚合酶0.5U、模板DNA 80ng以及52.1℃退火温度;试验从100个ISSR引物中筛选出12个适用引物;并对12个ISSR引物的多态性和稳定性进行了检验。     

甜樱桃SSR体系的建立、优化及应用

为摸索适宜甜樱桃的SSR反应体系,利用正交设计对Mg2+、dNTPs、引物、Taq酶和模板DNA等5种因素4个水平进行筛选和优化,20μL反应体系中,Mg2+、dNTPs和引物的最适浓度为1.5mmol/L、0.2mmol/L、0.4μmol/L,Taq酶宜加入1U,模板DNA应加入10～40ng;引物的最佳退火温度为56.0～62.8℃。用10对引物及建成的反应体系对10个供试品种扩增,6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,品种间DNA谱带多态性丰富,共有29个等位位点,证实该体系稳定可靠。     

仁用杏SSR反应体系的建立与优化

采用正交设计结合单因素分析,建立并优化了仁用杏SSR反应体系。结果表明:20μL反应体系中,Mg2+、Taq DNA聚合酶、dNTPs和引物的浓度分别为1.5 mmol/L1、.5 U、0.2mmol/L、0.25μmol/L,引物退火温度为52℃。应用该体系对24份仁用杏资源进行SSR分析,DNA谱带多态性丰富,将为仁用杏资源的SSR分析提供技术支持。     

杨桃SCoT标记PCR反应体系建立与验证

用单因素设计法对影响杨桃SCoT-PCR反应体系的主要因素Mg2+、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶及DNA模板浓度进行优化。结果表明,20μL反应体系中,含Mg2+2.5 mmol/L,dNTPs 0.3mmol/L,模板DNA 30mg/L,引物1.00μmol/L和Taq DNA聚合酶0.4U为最佳反应体系。用不同引物及杨桃DNA对该体系进行验证,扩增条带清晰,结果稳定可靠,证明该反应体系适用于杨桃SCoT-PCR扩增。     

光核桃ISSR扩增体系的优化

为确保光核桃ISSR反应条件的稳定性,以改良的CTAB法提取光核桃基因组DNA,对模板DNA浓度、MgCl2浓度、dNTPs浓度、Taq酶用量、引物浓度等因素进行了优化,确立了光核桃ISSR反应体系。结果表明:最佳反应体系为模板浓度40ng/μL、引物浓度0.4μmol/L、Mg2+的浓度2.5mmol/L、酶浓度0.5U、dNTPs浓度0.5mmol/L,为光核桃这一优质的种质资源的遗传多样性研究奠定了理论基础。     

苹果SSR反应体系的建立

为摸索适宜苹果的SSR反应体系,以金冠苹果为试验材料,研究了苹果SSR技术中PCR反应体系的主要成分对SSR扩增结果的影响。对SSR反应体系中的Mg2+浓度、引物浓度、dNTP浓度、TaqDNA聚合酶浓度、模板浓度以及退火温度进行了探索,确立了适合苹果的SSR反应体系为:在20μL反应体系中,Mg2+、引物和dNTP的最适浓度分别为2.5mmol/L、0.8μmol/L、0.10mmol/L;反应体系中TaqDNA聚合酶宜加入1U,模板DNA应加入15-30ng;引物的最佳退火温度为48.5-52.0℃。并利用该反应体系对10个苹果代表品种进行SSR反应,用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,不同品种间DNA谱带多态性丰富,证实该体系稳定可靠。     

链格孢属小孢子种ISSR和RAPD-PCR最佳反应体系的建立

以13个链格孢属小孢子种菌株为试材,采用正交实验设计的方法,研究Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶和引物4个因素在4个水平上对链格孢属小孢子种的ISSR和RAPD反应体系的影响。结果表明:链格孢属小孢子种ISSR和RAPD的最佳反应体系为25μL的ISSR-PCR反应体系中,10×PCR Buffer 2.50μL,Mg2+浓度为2.50mmol/L,dNTPs浓度为0.10mmol/L,引物浓度为0.30μmol/L,Taq DNA聚合酶用量为1.25U;在RAPD-PCR反应体系中,10×PCR Buffer 2.50μL,Mg2+浓度为2.00mmol/L,dNTPs浓度为0.15mmol/L,引物浓度为0.60μmol/L,Taq DNA聚合酶用量为1.25U;在此基础上,对最佳反应体系的退火温度进行了筛选确定;在确定退火温度后,采用最佳反应体系,用ISSR引物UBC808和RAPD引物OPE07进行稳定性和通用性验证,结果表明该优化反应体系具有较好的稳定性和通用性。     

中国樱桃S-RNase基因PCR扩增技术体系的建立

通过对TaqDNA聚合酶、Mg2+、dNTP、通用引物、模板DNA浓度等反应参数的系统研究,建立了中国樱桃S-RNase基因特异PCR扩增体系。该体系反应的总体积25μL,其中Taq酶1.25U,MgCl22.5mmol/L,dNTP0.15mmol/L,通用引物0.25μmol/L,模板DNA 50 ng。反应程序为:94℃预变性3 min;33个循环的94℃变性1 min,56℃退火45 s,72℃延伸1.5 min;最后72℃延伸10 min。利用优化的扩增体系在中国樱桃的不同品种中获得有效扩增,进一步证明了该体系具有良好的稳定性和重复性。     

Development of specific primers for cpSSR analysis in caper,olive and grapevine using consensus chloroplast primer pairs

Chloroplast SSR (cpSSR) markers have demonstrated utility in studying genetic relationships. DNA sequence information of the chloroplast genome is necessary for the development of cpSSR primer pairs. To overcome this limitation, “consensus” primers have been developed to amplify the homologous regions in plants where chloroplast sequences are not available. However, 80% Pinus thunbergi and Nicotiana tabacum developed “consensus” primers tested with grapevine, olive and caper showed multi-locus patterns. The presence of multi-locus patterns requires the use of agarose gel electrophoresis followed from isolation and sequencing of the bands. Herein, a PCR-strategy is proposed to construct specific cpSSR primer pairs without genomic sequence information, giving single-band amplifications that can be directly sequenced. Twelve new specific cpSSR primer pairs were developed for Capparis spinosa L., Olea europea L. and Vitis vinifera L. PCR products were sequenced to confirm the presence of microsatellite sequences, and their transportability was tested on six V. vinifera cultivars. Both single-nucleotide polymorphisms and polymorphic cpSSR were observed in the six grapevine cultivars using the specific cpSSR primers.     

萝卜EST-SSR标记PCR反应体系的建立与优化

采用L16(45)正交试验设计优化了萝卜EST-SSR标记的PCR反应体系,建立了适于20μL PCR技术体系的最佳浓度:DNA模板65 ng/20μL,Mg2+0.8 mmol/L,dNTPs 0.25 mmol/L,引物0.8μmol/L,Taq DNA酶0.4 U/20μL,且Mg2+对该体系的影响最大。利用10对EST-SSR引物对该体系的验证结果表明,本研究建立的萝卜EST-SSR PCR体系重复性好、条带清晰、多态性丰富,对萝卜的种质资源的鉴定与评价、分子标记辅助选择育种等多方面都有重要作用。     

部分柿属植物SRAP-PCR反应体系的优化

SRAP技术是一种多态性和信息量丰富的新的分子标记技术,其技术简便、快速,不需预知序列信息,近年来在植物遗传多样性分析、种质鉴定、遗传连锁图的构建以及比较基因组学研究等方面得到广泛应用。为了建立柿属植物SRAP技术体系,对影响SRAP-PCR的Mg2+、dNTPs、Taq聚合酶、引物浓度等因素进行了优化。确定优化的反应体系为:模板DNA30ng,Buffer1×,Mg2+2.5mmol/mL,dNTPs0.2mmol/L,Taq酶1u,引物0.3μmol/L,反应总体积25μL。该体系在柿属植物6种1类型共29个基因型中获得较好的扩增结果,可望在柿属植物起源和进化研究中应用。     

正交设计优化莲藕ISSR-PCR反应体系研究

利用正交实验设计的方法,对莲藕ISSR-PCR反应的四因素(TaqDNA聚合酶浓度、dNTP浓度、引物浓度、Mg2+浓度)三水平进行优化分析,并在此基础上对模板DNA浓度、PCR反应过程中的退火温度进行梯度检测。结果表明:20μL的ISSR-PCR反应体系中各因素的最佳浓度为:10×PCRbuffer 2.0μL、dNTP150μmol/L、引物1.2μmol/L、Mg2+2.0 mmol/L和TaqDNA聚合酶4 U,最佳模板DNA浓度为40～60 ng,引物U826的最佳退火温度为48.7℃。     

草莓属植物SCoT分析体系的建立及优化

为利用SCoT技术开展草莓属(Fragaria)植物种质资源遗传多样性及分子系统学研究,以草莓属植物11个野生种和1个栽培品种为试材,采用L25(56)正交试验设计,建立了草莓属植物的最优SCoT-PCR反应体系,即20μL反应体系中,含Mg2+2.0 mmol·L-1、dNTPs 0.3 mmol·L-1、Taq酶0.75 U、引物0.75μmol·L-1、模板DNA 40 ng,并对退火温度进行了优化,对电泳检测方法及草莓属植物DNA提取方法进行了改进。共筛选出22个适于进行草莓属植物SCoT分析的引物。经验证,该反应体系稳定性好、可重复性强、多态性高、扩增效果好,适于草莓属植物的SCoT分析。     

均匀设计优化澳洲坚果SRAP反应体系

以澳洲坚果部分种质为试材,采用U25(55)均匀设计表,对SRAP-PCR反应体系中Taq DNA聚合酶、模板DNA、dNTPs、Mg2+、引物5个组分的浓度进行优化。结果表明澳洲坚果25μL的SRAP反应体系的最佳组分包括2.5μL10×PCR buffer、1 UTaq DNA聚合酶、40 ng模板DNA、0.2 mmol/LdNTPs、0.2μmol/L引物和3.0 mmol/LMg2+。利用所确立的体系对部分澳洲坚果种质进行扩增的结果清晰可靠,多态性好。