嗜水气单胞菌外膜蛋白基因ompTS的克隆与序列分析

根据已发表的外膜蛋白基因ompⅡ的核苷酸序列设计引物，从分离 自患红底板病的中华鳖的嗜水气单胞菌中扩增得到了ompTS基因，对ompTS 基因进行序列分析，发现其与ompⅡ基因的核苷酸序列有83.5%的同源性。ompTS基因最长的开放阅读框（ORF）为1068nt，编码由355个氨基酸组成，分子量为38.9kDa的蛋白质OmpTS，其氨基酸序列的前20个氨基酸残基可能组成信号肽。由ompTS基因的编码氨基酸序列与其它细菌外膜蛋白的氨基酸序列的比较结果，进一步证实细菌外膜蛋白氨基酸序列的N端存在高度保守区。根据序列分析结果推测，ompTS基因很可能是一个新的基因，编码38.9kDa的嗜水气单胞菌外膜蛋白OmpTS，该蛋白质在膜中极有可能形成孔道，具备与孔蛋白相似的性质。     

鳗源嗜水气单胞菌主要外膜蛋白基因克隆及其表达

A pair of primers were designed according to the published nucleotide sequence of a putative outer membrane protein gene (omp) of Aeromonas hydrophila . With the specific primers, a target fragment about 1.1 kb was amplified from Aeromonas hydrophila ML316 via PCR .The target fragment was inserted into the linearized pGEM-T easy vector. After enzyme restriction and sequencing analysis,the nucleotide data had been further analyzed by DNAman and ClutalW software. The analysis results showed that the cloned DNA fragment had a longest open reading frame (ORF) of 1035 nt,it predicted to be encoded a 344 aa protein with the molecular weight of 36 kD. Hydrophobicity analysis suggested that the protein was highly hydrophilic, especialy at the first 24 aminoacid, this region could function as signal peptide. The homologious comparison proved the cloned gene had 96% homology to the sequence of the omp gene, and the alignment of the amino acid sequence was 98% . The recombinant plasmid was constructed with the target gene and the expressing vector pGEX-4T-1 and then was transformed into E. coli BL21（DE3）by BamH and Sal I .The fusion protein was expressed under the IPTG inducing condition,and exhibited about 62 kD in size,very close to the predicted molecular weight of GSTMOMP, furthermore,the fusion protein was specifically recognized by antiserum which raised against the major outer membrane protein of AHML316. Considering all these together, it proved that the cloned gene represented the major outer membrane protein gene of AHML316, and the expressed gene products shared identical antigenicity with the natural main outer membrane protein,and also provided technical support for developing an advanced gene engineering vaccine against Aeromonas hydrophila.     

不同来源嗜水气单胞菌外膜蛋白基因检测及序列分析

采用PCR方法,对分离于发病宽体金线蛭(Whitmania pigra)、中国林蛙(Rana temporaria chensinensis)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)、草鱼(Ctenopharyngodon idellua)、青鱼(Mylopharyngodon piceus)、鲤(Cyprinus carpio)的42株致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)进行了外膜蛋白(OMP)基因的检测;将代表菌株的外膜蛋白基因通过DNAStar软件与GenBank中报道的4株嗜水气单胞菌(FJ437030.1、AF183931.1、AF276639.2、CP000462.1)和1株温和气单胞菌(A.sobria,FJ437029.1)参考菌株进行了核苷酸同源性比较分析。结果表明,所检不同来源嗜水气单胞菌的OMP基因携带率为100%;所测代表菌株的OMP基因与参考菌株的同源性在86.0%～99.2%之间。所测得的不同来源嗜水气单胞菌OMP基因的同源性98.3%～100%,其中分离于宽体金线蛭的HTQ010505-1与青鱼的HL060811-4两菌株间同源性高达100%。     

单壁碳纳米管载嗜水气单胞菌外膜蛋白亚单位疫苗的研制及免疫效果评价

为了筛选细菌的疫苗候选蛋白,本实验根据课题组前期的研究,挑选了2个嗜水气单胞菌外膜蛋白(A0KLQ6和A0KH89),以A0KHR9(OmpAII)为对照,通过比较外膜蛋白与碳纳米管载外膜蛋白通过腹腔注射与浸泡免疫模式,比较和评价斑马鱼的免疫反应与免疫保护效果。结果显示,腹腔注射组和浸泡组与普通蛋白组对比,碳纳米管载蛋白能够显著提高斑马鱼免疫相关基因表达量。腹腔注射组在5μg剂量下免疫A0KHR9、A0KLQ6和A0KH89蛋白分别获得61.60%、 65.39%和84.96%相对免疫保护率(relative immune protection rate,RPS),在5μg剂量下免疫碳纳米管载蛋白SWCNTs-A0KHR9、SWCNTsA0KLQ6和SWCNTs-A0KH89分别获得68.10%、77.50%和90.43%的RPSs。浸泡组在40 mg/L剂量下免疫A0KHR9、A0KLQ6和A0KH89蛋白分别获得30.80%、25.85%和37.80%的RPSs,在40 mg/L最高剂量下免疫碳纳米管载蛋白疫苗SWCNTs-A0KHR9、SWCNTsA0KLQ6和SWCNTs-A0...     

嗜水气单胞菌研究进展

嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)属于弧菌科、气单胞菌属,是嗜温、有动力的气单胞菌群,普遍存在于淡水、污水、淤泥、土壤和人类粪便中,对水产动物、畜禽和人类均有致病性,是一种典型人—兽—鱼共患病病原[1],可引起多种水产动物的败血症和人类腹泻,往往给淡水养殖业造成惨重的经济损失,已引起国内外水产界、兽医学界和医学界学者的高度重视。目前国内外学者对嗜水气单胞菌的研究已有了很大进展。本文将国内外有关嗜水气单胞菌研究现状从其毒力因子以及诊断与检测技术方面综述如下。1　毒力因子嗜水气单胞菌可产生各种毒力因子,包括…     

鳖嗜水气单胞菌败血症

鳖嗜水气单胞菌败血症（ＴｒｉｏｎｙｘｓｉｎｅｎｓｉｓＡｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａｓｅｐｔｉｃｅｍｉａｓ）是由嗜水气单胞菌引发的一种败血性传染病。不分性别和个体大小皆可感染,分布面亦广,国内外养鳖场均有发生。病原嗜水气单胞菌,属弧菌科,气单胞...     

嗜水气单胞菌研究概述

嗜水气单胞菌是一种重要的人—兽—鱼共患病病原,本文介绍了嗜水气单胞菌的分类地位和生物学性状,并对其致病因子、鉴定方法和由其引起的疾病的预防和治疗进行了综述。     

致病性嗜水气单胞菌及其所致鱼病综述

尽管早在1891年就有因嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染引致蛙“红腿病”的报道,但由于该菌在自然界尤其是水中广泛分布,一般为正常共栖菌,因此长期以来对其致病性并未重视。近年来在我国南方各省淡水养殖鱼类流行暴发性传染病,有报道系为该菌所致败血症。此外在其它水生经济动物、哺乳动物亦有类似发现。人类因之而发生胃肠炎及伤口感染的病例也日渐增多。嗜水气     

鳗鲡病原性嗜水气单胞菌与爱德华氏菌二联表达外膜蛋白的免疫原性

采用鳗鲡源嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)外膜蛋白基因二联表达产物免疫日本鳗鲡(Anguilla japonica),检测其对日本鳗鲡免疫功能的影响及其攻毒免疫保护力。将150尾日本鳗鲡平均分为PBS、细菌免疫和外膜蛋白免疫3个组,3组鳗鲡分别以PBS(0.01 mol/L,p H7.4)、嗜水气单胞菌与迟缓爱德华氏菌二联灭活苗(5.0×108 CFU/m L)、嗜水气单胞菌与迟缓爱德华氏菌外膜蛋白二联表达产物(500μg/m L)腹腔注射0.2 m L。于免疫后14、21和28 d麻醉鳗鲡采血并分离抗凝血。测定3个时间点鳗鲡血浆中特异性抗体效价和同时期鳗鲡血浆、体表黏液、肝和肾组织匀浆液中的溶菌酶含量,同时检测3个时间点鳗鲡全血细胞的转化水平。免疫后28 d,嗜水气单胞菌和迟缓爱德华氏菌分别腹腔注射感染3组鳗鲡并测定其相对免疫保护率。结果表明,免疫后14 d和28 d,灭活菌和外膜蛋白免疫组的抗体水平均极显著高于PBS组(P0.01)。溶菌酶检测结果表明,不同处理组不同时间段血清、黏液和肝肾组织悬液的溶菌酶含量存在显著(P0.05)或极显著(P0.01)差异。免疫后14 d灭活菌组全血细胞转化水平显著高于PBS和外膜蛋白组(P0.05),而21 d两个免疫组则均显著低于PBS组(P0.05)。活菌感染结果表明,灭活菌和外膜蛋白免疫后28 d对两株病原菌的攻毒相对免疫保护率均比PBS组提高了50%(P0.05)。本研究结果表明鳗鲡源嗜水气单胞菌和迟缓爱德华氏菌外膜蛋白二联表达产物免疫日本鳗鲡后可提高鳗鲡的免疫功能及其对这两株菌的抵抗力,从而可能应用于鳗鲡基因工程疫苗的研发。     

嗜水气单胞菌感染后牛蛙血清中抗菌物质的初步研究

用1×107 mL-1的嗜水气单胞菌腹腔注射感染牛蛙,注射后7 d内试验组牛蛙血清抗菌活性都高于对照组,其中在3 d、7 d时存在显著性差异,峰值出现在感染后第3天。收集第2批人工感染后3 d时牛蛙的血清。该血清经Sephadex G25凝胶柱分离后,并在波长280 nm处测定紫外吸收值,得到两个吸收峰。以嗜水气单胞菌检测分离物的抗菌活性,结果表明经诱导的血清抗菌物质主要集中在第1个吸收峰。通过对金黄色葡萄球菌等10株指示菌抗菌谱的测定,其对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌等具有明显的抗菌作用;SDSPAGE分析显示抗菌蛋白分子量较大。结果说明：牛蛙被嗜水气单胞菌感染后能很快产生多种抗菌物质,主要的抗菌物质是分子量比较大的物质,这些抗菌物质对部分革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌有抗菌作用。图3表1参24 关键词：牛蛙;嗜水气单胞菌;抗菌蛋白;抗菌活性     

嗜水气单胞菌的研究进展

嗜水气单胞菌属于弧菌科气单胞菌属,在自然界分布广泛,可以感染多种水生及陆生动物并引起不同的疾病,是一种重要的人-兽-鱼共患病病原菌。该文概述了嗜水气单胞菌的分类地位和生物学性状,并对其致病因子、鉴定方法进行了综述。     

嗜水气单胞菌J-1株OmpA融合蛋白的高效表达及免疫原性分析

以嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）J-1株基因组为模板,根据GenBank已发表的嗜水气单胞菌外膜蛋白的基因序列设计1对引物,扩增去除信号肽序列的成熟外膜蛋白OmpA的基因片段,定向克隆至表达质粒pET32a（＋）中,重组质粒经限制性酶切鉴定后测序。结果表明,插入片段长度为948bp,与NCBI上登录的几个相关序列相比,同源性在93．1％-95％之间,缺失4个氨基酸。将重组原核表达质粒pET32a-OmpA转化至大肠杆菌BL21（DE3）,经诱导可表达分子量约57．4kD的蛋白,凝胶薄层扫描显示OmpA在转化菌中表达量占全菌蛋白的50％以上。用兔抗J-1株总外膜蛋白血清进行Western blot,在57．4kD处有明显反应条带。融合蛋白经Ni-NTA树脂柱亲和层析纯化后免疫新西兰兔制备抗血清,ELISA效价达1：12800以上。Western blot检测结果显示,该血清与9株具有代表性的气单胞菌的分子量约35kD的外膜蛋白均有较强反应,说明所表达的融合蛋白不仅保持原有外膜蛋白的免疫原性,而且提示OmpA可能是嗜水气单胞菌的共同保护性抗原。[中国水产科学,2008,15（2）：301—306]     

Protective immune responses of recombinant outer membrane proteins OmpF and OmpK of Aeromonas hydrophila in European eel (Anguilla anguilla)

Outer membrane proteins (Omps) of Gram‐negative bacteria have been proven to be efficient subunit vaccines against bacteriosis. In this study, OmpF and OmpK of Aeromonas hydrophila were expressed, and their immune protective effects in European eel (Anguilla anguilla) were evaluated. The genomic DNA of A. hydrophila 322A was used as a template, and two kinds of prokaryotic expression plasmids, pET‐32a‐OmpF and pET‐32a‐OmpK, were constructed. Recombinant OmpF protein (r‐OmpF) and r‐OmpK were purified and were proven to have antigenicity by Western‐blot analysis. r‐OmpF and r‐OmpK were used as immunogens to immunize European eel by intraperitoneal injection. The mRNA expression of 6 immune‐related genes (IgM, IL‐10, IRF3, IRF7, LysG4 and HexB) in the liver tissues of eels at 1 hr, 3 hr, 6 hr, 12 hr, 24 hr, 72 hr and 10 days postimmunization was analysed by real‐time PCR. At 30 dpi, the serum antibody response was measured by ELISA. Fish were attacked at 15 dpi by live 322A to assess the protective immunity of r‐OmpF and r‐OmpK. All the six tested genes responded to r‐OmpF or r‐OmpK vaccination at varying degrees. The serum antibody titre of r‐OmpF‐ and r‐OmpK‐immunized groups was 1:1,600 and 1:3,200 respectively. In addition, r‐OmpF gave 35.5% of the relative immune protection rate to European eels, while r‐OmpK gave 70.0%. By analysing the protective immunity and the regulatory role in the immune‐related gene expression of the two recombinant proteins that were studied, it was found that r‐OmpK was a potential vaccine candidate against A. hydrophila.     

嗜水气单胞菌3种疫苗对斑点叉尾免疫原性比较研究

将经福尔马林灭活的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、菌体脂多糖(LPS)和菌体外膜蛋白(OMP)作为免疫原,分别接种斑点叉尾(Ictalurus punctatus Rafinsque)后,通过测定受免鱼的凝集抗体效价,头肾和血液中吞噬细胞的吞噬活性和用A.hydrophila活菌攻毒的方法,探讨了斑点叉尾对A.hydrophila的3种疫苗的免疫应答状况和对活菌攻毒的免疫保护效果。试验结果显示:对斑点叉尾经腹腔注射接种3种疫苗均能刺激受免鱼产生较强的免疫应答,3种疫苗的受免鱼均产生了特异性凝集抗体,接种F-Ah灭活菌苗的试验鱼最高,接种OMP疫苗的试验鱼其次,而接种LPS疫苗的试验鱼血清中凝集抗体效价最低;与未接种疫苗的对照鱼相比,受免鱼头肾和血液中吞噬细胞的吞噬活性明显上升,头肾和血液中吞噬细胞活性由高到低依次是LPS、OMP和F-Ah免疫接种的斑点叉尾;活菌攻毒的结果证明接种3种疫苗的受免斑点叉尾A.hydrophila的感染产生了不同程度的相对免疫保护力(RPS),以OMP免疫接种后的斑点叉尾RPS最高,达到72.5%,接种LPS的斑点叉尾稍差,RPS为62.5%,而RPS最低的是接种F-Ah的免疫组,RPS只有24.2%。     

luxR基因调控嗜水气单胞菌耐药性的分子机制初探

LuxR家族蛋白是一类在革兰氏阴性细菌中发挥重要作用的调控蛋白,参与细菌多项重要生理活动。采用RNAi技术构建嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila) luxR05735稳定沉默菌株luxR05735-RNAi,并利用qRT-PCR检测基因沉默效果。结果显示,与野生株相比,沉默株中luxR05735的表达量降低了96.8%。药物敏感性实验表明,与野生株相比,luxR05735-RNAi对庆大霉素、诺氟沙星、卡那霉素、吡哌酸的耐药性显著降低。对野生株与沉默株luxR05735-RNAi的转录组数据进行分析发现,表达差异显著的基因共有1286个,其中,上调基因353个,下调基因933个;显著富集的通路4条,分别是核糖体通路、精氨酸生物合成通路、硫代谢通路、硒化合物代谢通路;在这4条通路中可能与嗜水气单胞菌耐药性相关的重要功能基因包括metE、glnA、rplB、rplX、rpsA、rpsJ等,这些功能基因编码的蛋白主要与细菌的生物成膜及核糖体蛋白合成相关。综合以上研究结果,可以推测嗜水气单胞菌的luxR05735通过调控细菌的生物膜形成相关基因及核糖体蛋白相关基因的表达,从而调控细菌对药物的耐受性。