养殖刺参保苗期重大疾病“腐皮综合征”病原及其感染源分析

2003～2005年冬、春季,山东省和辽宁省众多养殖区域的保苗期刺参(Apostichopus japonicus)暴发了较为严重的传染性疾病-"腐皮综合征".该病波及面广,传染性强,死亡率常高达90%以上.发病症状主要表现为厌食、摇头、肿嘴、排脏、身体萎缩、口部溃烂乃至体表大面积溃疡.本研究对症状较为典型的3家海参保苗期的发病幼参进行了详细的病原学分析,从所有病参的病灶组织分离得到了1种占有绝对优势的菌株,经人工感染实验证明它对健康刺参具有较强的致病性,且感染病参的症状与自然发病海参的症状相同.通过形态学、生理生化和16S rDNA分子生物学方法对该菌进行的分类鉴定表明,导致保苗期刺参"腐皮综合征"的致病菌是假交替单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens).同时也对3家养殖场刺参保苗养殖系统进行了分析研究.结果表明,水源中细菌含量不高,为(0.8×102)～(1.2×102)cells/mL,其特征与病灶处优势菌不同;而饵料中细菌含量最高可达3.2×106 cells/mL.饵料、池水和池底污物的优势菌与病灶处优势菌基本一致,说明饵料可能是病原菌的主要来源.本研究首次揭示了"腐皮综合征"导致保苗期刺参大规模死亡的原因及其致病原,对刺参健康养殖和病害防治具有重要的指导意义.     

抗“腐皮综合症”刺参体腔液指标变化的初步研究

对用“腐皮综合症”致病菌灿烂弧菌（Vibrio splendidus）感染刺参的7个体腔液指标进行了测定。结果显示：1）抗病刺参和易感刺参体腔液吸光值和颗粒细胞浓度在第10天差异显著（P〈0．05）。2）抗病刺参和易感刺参总细胞浓度和透明细胞一淋巴样细胞浓度在第5天差异显著（P〈0．05）。3）抗病刺参体腔液碱性磷酸酶活力在试验各天均保持较高水平,且在第10天与易感刺参有显著差异（P〈0．05）;易感刺参体腔液酸性磷酸酶活力在第5天明显高于抗病刺参（P〈0．05）,之后各天迅速降低,并显著低于抗病刺参（P〈0．05）。4）抗病刺参和对照组刺参超氧化物歧化酶活力各天始终无显著蒡异（P〉0．05）．抗病刺参和易感刺参在第10天蒡异昂著（P〈0．05）．     

养殖刺参腐皮综合征 2 种致病菌间接荧光抗体快速检测方法

以养殖刺参(Apostichopus japonicus)腐皮综合征的2种致病菌:灿烂弧菌(Vibrio splendidus)和假交替单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)为抗原,分别制备兔抗血清。以载玻片为介质,建立了2种病原菌的间接荧光抗体检测技术(IFAT)。交叉反应、阻断试验和吸收试验结果均表明本方法特异性强。对人工感染实验中的养殖水体及发病刺参溃烂组织检测,可以检出水体和患病刺参溃烂组织中的相应病原菌,病原菌被染成明亮的黄绿色,检测灵敏度2.4×104cell/mL。冰冻切片检测结果显示,在刺参肿胀嘴部与溃烂肌肉处有大量染成黄绿色的细菌颗粒。结果表明:采用IFAT可以对刺参腐皮综合征2种致病菌进行准确快速的检测。该方法的建立对刺参腐皮综合征的流行病学调查及快速诊断具有重要意义。     

应用PCR方法检测刺参腐皮综合征病原——灿烂弧菌

腐皮综合征是近年来刺参养殖最主要的疾病,导致刺参大批死亡和惨重的经济损失.根据其主要致病原灿烂弧菌(VibrioQQQsplendidus)的16S～23S间隔区序列,设计特异性引物,利用PCR技术,从纯化的V.splendidus DNA中成功地扩增出产物大小为177bp的DNA片断,并对此方法的灵敏度和特异性进行了研究.结果表明,PCR技术对V.splendidus DNA的检测灵敏度为0.5pg,并且对灿烂弧菌的DNA呈现特异性,而与其他细菌V.Fluvialis、V.Anguillarum、V.Alginolyticus、Aeromonas hydrophila、V.Harveyi、V.Parahaemolyticus、V.Vulnificus的DNA均无交叉反应.应用PCR技术对人工感染的以及取自青岛、烟台和威海的腐皮综合征发病海参进行检测,其检出率均为100%.研究结果表明,PCR方法具有良好的特异性和敏感性,可成功用于快速检测养殖刺参腐皮综合征原灿烂弧菌.在国内,该方法应用于刺参腐皮综合征的检测尚属首次,它将为刺参腐皮综合征的快速诊断及防治提供又一新的方法.     

养殖刺参腐皮综合征病原菌的分离与鉴定

2003年春季,山东省青岛地区刺参养殖场暴发了较为严重的传染性疾病一“腐皮综合征”,该病引起的死亡造成约30％的损失。养殖刺参的发病症状表现为：厌食、摇头、肿嘴、排脏、身体萎缩、口部溃烂乃至体表大面积溃疡。从患病个体溃疡部位分离得到一种优势细菌KL-1,KL-1经人工回接感染实验证明对健康刺参具有较强的致病性,且感染病参的症状与自然发病海参的症状相同。通过形态学、生理生化和16S rDNA分子生物学方法对该菌进行的分类鉴定表明,导致养成刺参“腐皮综合征”的致病菌是灿烂弧菌（Vibrio splendidus）。本文首次揭示了该地区“腐皮综合征”导致养成刺参大规模死亡的致病原因,对刺参病害防治和健康养殖具有重要的指导意义。     

养殖刺参暴发性疾病——“腐皮综合症”的初步研究与防治

“刺参腐皮综合症”(俗称化皮病)是当前养殖刺参的最主要疾病，死亡率达90％以上．属急性死亡．越冬保苗期幼参和养成期海参均可被感染发病。较为详细地报道了该疾病的发病症状、流行情况、发病原因与防治方法。由不同地区的病参分离得到的2种优势菌株的人工回接感染试验证实了它们是该病的主要致病原．这2株细菌经鉴定分别隶属于弧菌属和假单胞菌属，表现出病原的区域性和多样性。解剖和病理检验分析结果表明霉菌和扁虫则属于继发性感染，对加剧海参死亡也起到协同作用。另外．本文还就海参养殖存在的问题和今后研究方向进行了探讨。     

刺参腐皮综合征重要病原灿烂弧菌DNA的探针制备及应用

腐皮综合征是近年来刺参养殖最重要的疾病,导致刺参大批死亡和惨重的经济损失。以其主要致病原灿烂弧菌（Vibrio splendidus）DNA为模板,PCR扩增出16s-23s间隔区序列,将该片段克隆进pMD19-T Vector,转化大肠杆菌DH5a,获得重组质粒转化菌并进行测序。根据序列、设计引物,合成177bp的地高辛标记DNA探针。该探针对灿烂弧菌的DNA呈现特异性,而对其它细菌Vibrio fluvialis、Vibrio anguillarum、Vibrio alginolyticus、Aeromonas hydrophila、Vibrio harveyi、Vibrio parahaemolyticus、Vibrio vulnificus的核酸均呈阴性;探针对灿烂弧菌DNA的检出极限为6.25pg, 具有较高敏感度。应用该探针对人工感染以及从青岛、烟台、威海获取的腐皮综合征发病海参和养殖水体进行斑点杂交探针检测,其检出率均为100%。研究结果表明,该探针具有良好的特异性和敏感性,可成功用于快速检测养殖刺参“腐皮综合征”重要病原灿烂弧菌。该方法应用于刺参腐皮综合征的检测尚属首次,它将为刺参腐皮综合征的快速诊断、疾病防治和养殖生产提供技术支撑和参考。     

养殖刺参“腐皮综合征”致病菌——灿烂弧菌的原位杂交检测方法的建立与应用

以养殖刺参“腐皮综合征”的重要致病菌——灿烂弧菌Vibrio splendidus的16S~23S间隔区序列,设计特异性引物,用PCR方法制备地高辛(DIG)标记探针,建立了原位杂交技术检测感染刺参体内灿烂弧菌的技术方法,并利用该方法对人工感染刺参和健康刺参各组织进行检测。结果显示,感染刺参的体壁结缔组织、肌肉组织、肠粘膜上皮、辐水管等组织的原位杂交检测呈阳性,而与健康刺参组织无交叉反应。在感染组织中,阳性信号（显色）强弱清晰,能准确反映出灿烂弧菌的侵染部位及感染程度,这为探明灿烂弧菌的感染途径、感染病程等致病机理研究奠定了基础,也为养殖刺参疾病预防和健康管理提供了技术支撑。     

刺参幼苗培育“腐皮综合症”的防治方法

海参纲是棘皮动物门中经济意义最大的一个纲。全世界约有1100多种，现存约900种，我国约有140种。刺参不仅含有丰富的营养物质，而且含有抗癌物质（酸性黏多糖），因此喜食海参的人越来越多。     

刺参腐皮综合征病原灿烂弧菌检测探针的制备及应用

腐皮综合征是近年来养殖刺参发生的严重疾病.发病时,刺参大批死亡,经济损失惨重.以其主要致病原灿烂弧菌(Vibrio splendidus)DNA为模板,PCR扩增出16S-23S核糖体RNA基因间隔区序列,插入pMD19-T,转化大肠杆菌DH5α并测序.根据该间隔区序列,设计引物扩增177 bp的地高辛标记的探针.该探针对灿烂弧菌呈现特异性,而对其它细菌V. Fluvialis,V. Anguillarum,V. Alginolyticus,Aeromonas hydrophila,V. Harveyi,V. Parahaemolyticus,V. Vulnificus均呈阴性.探针对灿烂弧菌DNA的检出限为6.25 pg, 具有较高敏感度.用该探针对人工感染以及从青岛、烟台、威海获取的腐皮综合征发病海参和养殖水体进行斑点杂交,灿烂弧菌检出率达100%.结果表明,该探针具有良好的特异性和敏感性,可用于快速检测养殖刺参腐皮综合征的病原灿烂弧菌.用该方法检测刺参腐皮综合征尚属首次,为刺参腐皮综合征的快速诊断和防治提供技术支撑.     

老化参池刺参腐皮综合征致病原的分离与鉴定

从患病刺参体表病灶组织分离出菌株060330B,其优势度高达90%,人工回接感染试验证实其具有较强的致病性,可导致健康刺参出现与自然患病刺参相同的症状。通过形态学观察、API半自动化鉴定和常规生理生化试验的结果表明,菌株060330B具有假单胞菌属的特征,其表型特征与恶臭假单胞菌相似。对该菌株进行16SrRNA基因序列分析和构建系统发育树,结果显示其与恶臭假单胞菌的亲缘关系最近,相似率达到99.5%。菌株060330B可鉴定为恶臭假单胞菌,并视为养殖刺参腐皮综合征的致病原之一。通过对多起不同来源患病刺参的研究表明,使用年限长、淤泥层厚呈黑色并伴有腥味的养殖池塘在该时期容易导致刺参腐皮综合征的发生。     

养殖刺参溃疡病病原菌RH2的鉴定及其生物学特性分析

从患溃疡病养殖刺参(Apostichopus japonicus)病灶处分离出3株优势菌(RH1、RH2、RH3),以浸浴、体腔注射、体壁肌肉注射等方式进行感染实验,证实菌株RH2为养殖刺参溃疡病的病原菌,其对刺参的LD50(半数致死量)每尾为5.68×106CFU,并证实浸浴、体腔注射的方式无法感染刺参,该菌可能通过体表创伤侵入的方式感染刺参。经形态学观察、生理生化特性分析、16SrRNA和HSP60基因测序确定菌株RH2为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)。基于16S rRNA基因构建的系统发育树显示,菌株RH2与溶藻弧菌(AF513447)亲缘关系最近,置信度为50%;HSP60基因序列分析表明RH2与溶藻弧菌(AY332570、AF230931)聚为一个分支,且置信度高达99%。菌株RH2的最适生长盐度为25~35,最适生长pH为7.2~8.0,最适生长温度为14~22℃。对18种药物的敏感实验证实菌株RH2对诺氟沙星、复方新诺明、壮观霉素等较为敏感。     

中草药对刺参腐皮综合征病原菌的体外抑菌试验

用改良二倍稀释法和抑菌圈法测定了24种单方中草药和9种复方中草药对刺参腐皮综合征4种重要病原菌灿烂弧菌、假交替单胞菌、哈维氏弧菌和恶臭假单胞菌的体外抑菌活性。结果显示,不同中草药对特定病原菌抑菌效果差异较大,单方中草药最低抑菌浓度（MIC）为1.56mg/ml,中草药水煎剂H-5和H-9对假交替单胞菌的抑菌圈最大,达22mm。单方中草药中穿心莲、大青叶、金银花和川芎4种中草药对4株病原菌抑菌效果最好,其水煎剂对4株病原菌平均抑菌浓度分别为6.25、7.81、5.86和3.52mg/ml;平均抑菌圈直径分别是17.5、11.3、14.0和11.5mm。将筛选的4种单方中草药组成9种复方,复方MIC和抑菌圈均显著好于单方,最低MIC降低到0.20mg/ml。其中复方HC-G和HC-D抑菌浓度最低,效果最好,平均抑菌浓度分别降低为0.54和0.64mg/ml;平均抑菌圈直径分别为15.3mm和16.3mm。试验结果显示,复方最佳配比为穿心莲、大青叶、金银花和川芎=2∶1∶3∶2。该复方可为生产高效专用中草药,以替代抗生素,为刺参健康养殖提供技术保障。     

福建吊笼养殖仿刺参肠道菌群结构分析

该研究基于Mi Seq高通量测序技术对福建霞浦海域海上吊笼养殖仿刺参（Apostichopus japonicus）肠道菌落结构进行分析。结果表明,仿刺参前肠（2H₁）、中肠（2H₂）和后肠（2H₃）测得的分类操作单元（OTUs）分别为124、116和78。3个组织样品菌群的物种丰度和优势菌种存在较大差别,其中前肠的物种丰度最高,为2.38,中肠其次,为2.22,后肠最低,为1.24。优势菌群方面,后肠的优势菌群为Formosa和乳球菌属（Lactococcus）（分别占细菌总数的87.38%和7.74%）,而前肠和中肠的优势菌群均是乳球菌属和芽孢杆菌属（Bacillus）,两者分别占前肠中细菌总数的59.68%和11.8%,在中肠中的占比分别为62.45%和12.07%。在重复性方面,后肠中发现的细菌在前肠和中肠中都有发现,而前肠和中肠分别发现6个和4个特有菌群。 

     

刺参响应灿烂弧菌侵染差异microRNAs鉴定及靶基因分析

microRNA参与基因的转录后调控,在真核生物的生长发育、细胞分化和免疫防御等过程中发挥重要作用。刺参(Apostichopus japonicus)病害问题已成为产业发展的主要限制因素之一,而其病害发生的分子机制尚待进一步完善。本研究以刺参重大疾病“腐皮综合征”的重要致病原灿烂弧菌(Vibrios splendidus)为侵染菌株,通过人工侵染实验制备患病刺参样本,采用miRNA-seq技术对侵染组(PT16S)和对照组(PT10H)各3头刺参的体壁组织进行miRNA测序,通过相关生物信息学软件对miRNAs进行鉴定和分析,筛选差异表达miRNAs (DEmiRNAs)并预测其靶基因,构建关键调控途径的miRNA-mRNA调控网络。结果显示,PT10H组平均得到5 902 588条有效序列,194个已知miRNA和19个新的miRNA;PT16S组平均得到5 053 529条有效序列,182个已知miRNA和42个新的miRNA。对2组鉴定到的miRNA进行差异表达分析,共筛选到2个上调和11个下调的具有显著差异的DEmiRNAs (P≤0.05),上调的DEmiRNAs靶基因预测结合到3010个靶基因,注释到585个GO terms及24条信号通路(P≤0.05),下调的DEmiRNAs靶基因预测到19 072个靶基因,注释到514个GO terms以及22条信号通路(P≤0.05)。对筛选到的DEmiRNAs进行实时荧光定量PCR (qRT-PCR)验证,显示miRNA-seq与qRT-PCR的一致率达到70%。根据KEGG分析结果构建泛素介导的蛋白水解途径和Notch信号通路的miRNA-mRNA调控网络,结果显示,13个DEmiRNAs分别靶向结合134个与泛素介导的蛋白水解相关的mRNAs和109个与Notch信号通路相关的mRNAs,Aja-miR-184、Aja-miR-2478和Aja-miR-9277p等DEmiRNAs可能参与对Notch信号通路和对泛素介导的蛋白水解的调控。相关研究结果将为刺参疾病发生调控网络建立和机制解析提供依据。     

刺参养殖池塘中一株植物乳杆菌的分离及其生物学特性

2017年5月,从山东东营刺参(Apostichopus japonicus)养殖池塘底泥中分离获得49株乳酸菌。以刺参“腐皮综合征”的2株致病菌[灿烂弧菌(Vibrio splendidus)和假交替单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)]为指示菌进行拮抗作用实验,获得1株具有显著抑菌活性的乳酸菌CLY-5,对该菌株进行了生理生化实验、16S rDNA序列分析、生长特性及其对刺参的安全性研究。结果显示,菌株CLY-5对灿烂弧菌和假交替单胞菌具有较好的抑制作用,且菌株的胞内产物与胞外产物均具有抑菌效果,抑菌圈分别为20 、23 mm和27 、38 mm,胞外产物的拮抗作用优于胞内产物。利用该菌对刺参进行高浓度浸浴测试其安全性,浓度为1×109、1×108和1×107 CFU/ml,实验期间刺参状态良好,无死亡现象。16S rDNA序列分析表明,CLY-5与植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum NR117813.1)的相似性为100%,初步鉴定该菌株为植物乳杆菌。菌株CLY-5在30℃~44℃、pH 6~8范围内生长较快,20 h进入对数生长期,28~32 h达到生长高峰。筛选的植物乳杆菌具有良好的抑菌能力,且其生长特性适应刺参池塘的养殖环境,为刺参疾病的生态防控及乳酸菌资源的开发提供应用数据参考。     

刺参一种囊膜病毒的分离及其超微结构观察

利用电镜负染技术检测发病的养殖刺参[Apostichopus japonicus（Selenka）]组织提取液。观察发现，提取液中存在大量病毒样粒子，该病毒粒子近似球形，具有囊膜。囊膜内可见高电子密度的核心结构。完整的病毒粒子直径为80～100nm，囊膜厚6～10nm，核心结构直径35-45nm，呈六边形。应用超薄切片技术对刺参的触手顶部、触手臂、疣足、呼吸树、背肠血管、肠等组织的病毒感染状况进行观察，发现该种病毒粒子大量存在于所检测各组织内。感染细胞超微结构表现为大量细胞器崩解形成空泡结构，并出现“髓袢样”结构等病理变化。根据观测结果，该病毒是一种无包涵体病毒。