猪肺炎支原体高密度发酵工艺的研究

为提高猪肺炎支原体发酵培养的滴度,在500L发酵罐基础上,对猪肺炎支原体J株的发酵工艺进行了一系列优化试验,各项发酵培养条件经优化后,发酵支原体的滴度得到了明显提高,发酵滴度可达到1×109CCU/ml以上,本研究为提供高效、安全和稳定的猪肺炎支原体疫苗产品奠定基础.     

不同容积的培养瓶对猪肺炎支原体培养滴度的影响

本试验将猪肺炎支原体在不同容积的玻璃瓶中进行培养,对各自生长过程中不同时间点的颜色变化单位(CCU)和pH进行测定,分析不同容积的培养瓶对猪肺炎支原体培养滴度的影响。结果显示:与小瓶培养的猪肺炎支原体相比,万瓶的生长速度慢、CCU低、收获菌种的pH范围较广。本试验为猪肺炎支原体大规模培养和疫苗生产提供了参考。     

皮下接种猪肺炎支原体

本试验目的是检测无针皮下接种疫苗所诱导的猪对临床疾病的抗性,并比较肌肉和皮下接种猪肺炎支原体疫苗时的血清学反应。材料与方法:在每一组试验中,猪都曾接种过1次或2次猪肺炎支原体疫苗,并且检测其血清学反应都为阴性。通过DAKO猪肺炎支原体EL ISA反应试剂盒来检测肌肉和皮下接种疫苗时的血清学反应,皮下接种疫苗的效果通过猪肺炎支原体异源强毒菌株的试验性呼吸激发来检测。试验结果:所有疫苗注射点的副反应都是最小的。猪通过有针和无针皮下接种疫苗与肌内接种疫苗相比,前者具有较高的猪肺炎支原体抗体滴度。无针皮下接种与不接种疫苗的猪相比,前者更具有低的肺病变分数和在支气管肺泡灌洗液中有较高的IgA和IgG滴度。单一皮下接种疫苗21 d后机体建立了免疫保护。无针皮下接种猪肺炎支原体疫苗较安全且有效,不需要剃毛或者其他的皮肤准备工作。结论:如果配制小剂量的疫苗(如0.2 m l)对猪进行无针皮下注射是可行的。     

猪肺炎支原体DJ-166株的分离鉴定

从山西某猪场采集疑似猪支原体肺炎肺组织病料,接种CH培养基培养,克隆纯化获得一株菌株。该菌株经PCR、培养特性、生化特性和血清学特性试验鉴定为猪肺炎支原体,命名为DJ-166株。该分离菌株在人工合成培养基上传8代稳定后,活菌计数达到108CCU/m L;菌液培养物气管注射猪后,致病性较弱;免疫原性试验证明该分离菌株具有良好的免疫原性,此结论为猪支原体肺炎疫苗的研究提供了必要条件。     

猪支原体肺炎活疫苗(168株)生产工艺关键技术研究

肺炎支原体的培养和保存条件非常苛刻,是疫苗规模化生产的工艺难题。本文针对猪支原体肺炎活疫苗(168株)生产工艺关键技术进行研究。通过培养试验筛选四种培养基配方表明该疫苗株在低血清改良培养基中生长良好;优化发酵培养工艺,使其在发酵罐培养60～70 h的峰值可达到1010CCU/mL;设计筛选该疫苗耐热保护剂和冻干工艺,37℃下保存10 d的耐老化试验结果显示,下降滴度小于100.5CCU/mL。本研究为提供高效、安全和稳定的猪肺炎支原体疫苗产品奠定基础。     

猪肺炎支原体工业化高密度发酵与纯化工艺研究

为提高猪支原体肺炎灭活疫苗的产品质量,对猪肺炎支原体NJ株进行发酵与浓缩纯化工艺研究,通过筛选不同培养基、血清及血清添加比例,优化发酵参数,得到10 L-140 L-1 400 L发酵罐最佳发酵条件参数。结果显示:商品化干粉培养基添加10%的猪血清,在37℃条件下,恒定pH=7.3,溶氧20%,转速为100 r/min,间歇性通气,发酵36～48 h,支原体滴度最高可达到2.3×10~(10 )CCU_(50)/mL;采用孔径500 kDa的中空纤维纯化支原体效果最佳,经SDS-PAGE验证、BCA蛋白浓度和半数变色单位(CCU_(50))测定,杂蛋白去除率高达97%,支原体基本无损失,纯化效果良好。本研究为提供安全、高效和稳定的猪肺炎支原体疫苗产品奠定了基础。     

不同因素对猪肺炎支原体颜色变化单位测定的影响

为摸清猪肺炎支原体的颜色变化单位(CCU)测定是否受试验相关因素的影响,通过不同培养体系、不同种类的容器、不同的稀释方法测定猪肺炎支原体的CCU,观察培养基的变色情况,最终通过测定各组猪肺炎支原体的CCU来分析不同因素对猪肺炎支原体培养滴度的影响。结果显示,利用不同培养体系、不同容器及不同的稀释方法测定猪肺炎支原体的CCU,其结果差异均不显著(P>0.05)。该研究可为今后支原体的CCU测定提供参考。     

一株猪肺炎支原体的分离鉴定

从全国部分猪场采集到疑似猪支原体肺炎肺组织病料12份,提取DNA进行猪肺炎支原体PCR和多重PCR检测,将病料研磨后分离猪肺炎支原体,最终分离到1株疑似猪肺炎支原体;通过测序分析、形态观察、生化试验、血清学试验证实其为猪肺炎支原体。该菌株能适应人工培养基的培养,且传代生长良好,液体培养基中培养活菌滴度达109CCU/m L;菌株有一定的致病性,免疫原性好,可作为疫苗备用菌株,该菌株的分离鉴定为研制猪支原体肺炎疫苗奠定了基础。     

猪肺炎支原体YN200901株的分离鉴定

采集疑似猪肺炎支原体病理变化的肺脏,接种到改良牛心培养基、猪胃消化液培养基进行培养,经瑞特染色、镜检,菌落狄氏染色、PCR鉴定及序列比对、生化试验鉴定,抗猪肺炎支原体血清生长抑制试验,分离获得一株猪肺炎支原体云南地方流行菌株,命名为YN200901。试验结果为云南本地株猪肺炎支原体的后续研究提供了物质基础。     

猪肺炎支原体HN0613株高密度发酵工艺研究及效力评价

旨在建立猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）HN0613株高密度发酵工艺技术。以培养滴度（CCU）作为考查指标，确定Mhp HN0613株的最佳活力代次以及复苏培养时间；通过四因素三水平正交试验筛选最佳基础培养基配方；以通气量、搅拌转速和接种百分比作为单因素考查指标，优化15L发酵工艺参变量，并确定700L高密度发酵放大工艺；按照确定的高密度发酵工艺技术，制备MhpHN0613株灭活疫苗，评价其对兔和仔猪的免疫效力。结果表明，Mhp HN0613株F11代较其他代次CCU水平高，可达1×10^9CCU／mL，为最佳活力代次；其在复苏72h后，pH值降为7．0左右，CCU水平达到最高，为1×10^9CCU／mL，为最佳复苏培养时间；培养体系中，2％的初始葡萄糖添加量、8％接种百分比、初始培养基pH值7．6、15％猪血清添加量为最适培养条件；通气量100L／h、搅拌转速300r／min和8％接种百分比条件最有利于Mhp HN0613株15L发酵培养；首次建立了平衡kLa联动pH值回调的工艺技术路线，并将优化后发酵罐搅拌叶轮结构改为推进式叶轮，降低了叶轮对菌体的剪切作用力，CCU较优化前提高了10倍，且培养周期较优化前缩短了2-3d；700L高密度发酵放大工艺中，Mhp HN0613株培养滴度不低于5×10^9CCU／mL．最高可达1×10^10CCU／mL；免疫兔血清抗体效价均不低于1：40，最高可达1：160；免疫组实验仔猪肺炎减少率均高于80％，临床观察精神及食欲未见异常。该研究为Mhp疫苗规模化发酵生产提供了一定的理论依据。     

猪肺炎支原体疫苗与猪瘟疫苗联合免疫试验

猪瘟和猪呼吸道病综合征（PRDC）给当前猪场造成重要威胁,猪瘟疫苗和猪肺炎支原体疫苗是重要的防制工具。由于两种疫苗同时注射有利于减少猪群应激并减轻劳动强度,本试验旨在探讨仔猪3周龄时同时注射猪瘟疫苗和肺炎支原体疫苗对猪瘟抗体滴度变化的影响。选择3头同期分娩母猪,将每头母猪所产12头仔猪随机平均分到A、B、C、D这4个组。4个组都在3、8周龄注射猪瘟疫苗。A组只注射猪瘟疫苗;B组和C组在1、3周龄接种猪肺炎支原体疫苗,3周龄时猪肺炎支原体疫苗与猪瘟疫苗同时注射,B组为两种疫苗分点注射,C组为混合注射;D组在2、4周龄注射猪肺炎支原体疫苗。统计分析表明,10周龄和13周龄时4个组猪瘟抗体滴度差异不显著,说明猪肺炎支原体疫苗与猪瘟疫苗同时注射并不干扰猪瘟抗体的生成。另外发现,在母源抗体水平较高的情况下,3周龄接种猪瘟疫苗会受到母源抗体的部分干扰。     

猪肺炎支原体与猪支气管败血波氏杆菌在猪体液免疫和生长性能上的协同作用

试验选用10日龄成华×大约克杂交猪36头,随机分成四组(1、2、3、4),每组9头.其中1、2组用猪肺炎支原体全菌抗原免疫后再分别用猪肺炎支原体和猪支气管败血波氏杆菌进行攻毒,3、4组注射生理盐水作为对照,并与前两组同时分别用猪肺炎支原体和猪支气管败血波氏杆菌进行攻毒.采用间接ELISA、组织切片等方法对猪血清中的抗体水平、肺脏的病理变化及生长性能进行测定.试验表明:用猪肺炎支原体全菌抗原接种猪后,在血清中能检测到较高的抗体水平(25).猪肺炎支原体攻毒后2周,免疫猪和对照猪血清中猪肺炎支原体抗体的滴度分别为23.8与22.4(P＜0.05),且免疫猪的生长性能比对照猪好.在猪支气管败血波氏杆菌攻毒组,攻毒2周和4周后免疫猪血清中的猪支气管败血波氏杆菌抗体水平与对照猪相比分别提高了26.67%和30.00%(P＞0.05),6周后免疫猪和对照猪血清中的猪支气管败血波氏杆菌抗体分别为21.7和20.3(P＜0.05),且在攻毒后4～6周,免疫猪的生长性能有了显著的改善.组织切片显示,无论是用猪肺炎支原体攻毒还是用猪支气管败血波氏杆菌攻毒,免疫猪的肺脏病变程度都较对照猪轻.     

猪肺炎支原体强弱毒株感染后呼吸道特异性sIgA抗体分泌规律差异性

检验猪肺炎支原体强毒株与弱毒株感染后呼吸道sIgA抗体活性,并比较其抗体分泌规律差异。分别使用猪肺炎支原体强毒JS株和弱毒168株接种实验猪,同时设置健康猪为对照组,按时采集鼻拭子样本。通过ELISA检测0,2,4,7,14,21,28,35,42,49和56d特异性sIgA抗体滴度,比较两组抗体分泌规律。结果显示,在接种4~7d之间,强毒组已出现阳性猪,14d时所有猪呈感染阳性。而弱毒组在14~21d之间开始逐渐出现阳性猪,35d时80%左右的猪呈阳性感染,随后下降。并且强毒组抗体平均滴度高于弱毒组。结果显示,强毒转阳更早,抗体滴度更高,持续时间更长;弱毒为猪支原体肺炎弱毒疫苗株,该菌株同样保持了良好的免疫原性,可刺激呼吸道黏膜产生特异的sIgA,但黏膜抗体转阳时间较晚,滴度较低。强弱毒株在黏膜抗体分泌方面的差异有助于临床上对猪肺炎支原体的感染以及活疫苗免疫进行区别鉴定。     

一种猪肺炎支原体阳性血清的制备方法

本试验采用猪肺炎支原体抗原和灭活疫苗,多次免疫大兔来制备猪肺炎支原体阳性血清.本试验结果为鉴定和检测猪肺炎支原体提供了方法,程序简单,操作方便,大大降低了同源动物其他外源病毒的污染风险.该阳性血清的成功制备,为猪肺炎支原体疫苗的研究提供了基础保障.     

山羊支原体山羊肺炎亚种培养基的筛选及生长曲线测定

为筛选出山羊支原体山羊肺炎亚种的适宜培养基,将山羊支原体山羊肺炎亚种分离株M1601分别接种Thiaucourt肉汤、MEM-KM2和TSA 3种不同的培养基,测定其在3种不同培养基中生长滴度、生长速度,并测定了M1601在最适培养基中在不同培养阶段的生长滴度。结果表明,添加2g/L丙酮酸钠和150mL/L马血清的Thiaucourt肉汤培养基最适宜山羊支原体山羊肺炎亚种的生长,生长滴度可达109 CCU/mL,在培养6h后开始进入对数生长期,培养60h后进入稳定期,培养72h时后进入衰亡期。此试验结果为山羊支原体山羊肺炎亚种培养特性研究提供了参考数据。     

3种支原体培养基对猪肺炎支原体CJ株培养效果的比较分析

通过猪肺炎支原体CJ株接种3种猪肺炎支原体培养基后的生长活性研究发现,与其他2种培养基相比,接种改良Friis培养基培养2~3 d含菌量可达到1.0×109~10CCU/m L,具有生长迅速、含菌量高的特点,可用于猪肺炎支原体CJ株的培养。     

猪肺炎支原体强毒株的分离和鉴定

从15份疑似猪支原体肺炎病料中分离出病原,然后进行培养传代,再做染色镜检、PCR鉴定、序列分析和动物回归实验,最终将分离株接种于健康仔猪,结果仔猪出现典型的猪支原体肺炎临床症状和病理变化,证明该分离株为猪肺炎支原体.     

猪肺炎支原体检测芯片的研制及初步应用

本研究探索建立一种新的基因芯片方法检测和鉴定猪肺炎支原体。在猪肺炎支原体的16SrRNA、P36和P463个基因内设计3个靶基因片段,用PCR标记Cy3探针,建立了用于检测和鉴定猪肺炎支原体的检测芯片。试验结果显示,猪肺炎支原体与检测芯片的3个靶基因（Mhp-16S、Mhp-P46和Mhp-P36）杂交呈阳性,猪鼻支原体只与Mhp-16S靶基因杂交呈阳性,其它所测细菌和病毒不与检测芯片的靶基因杂交。检测芯片的检测灵敏度和PCR相同,能达到10pg基因组DNA／50μL标记体系或反应体系。用检测芯片鉴定了3株疑似猪肺炎支原体临床分离株,结果有2株为猪肺炎支原体,1株为其它猪支原体。用检测芯片、P36-PCR和分离鉴定分别对45头病猪临床样品选择混合培养物中的猪肺炎支原体进行了检测,结果它们的检出率分别为20％（9／45）、22．2％（10／45）和8．9％（4／45）。检测芯片还检出有26．7％（12／45）的病猪感染了其它猪支原体。试验结果表明,所建立的检测芯片是一种快速检测和鉴定猪肺炎支原体的敏感特异性方法。     

枯草芽孢杆菌发酵菌糠制备饲料微生物添加剂的研究

试验旨在优化枯草芽孢杆菌发酵金针菇菌糠的条件进而制备饲料微生物添加剂。试验采用L1(645)正交试验,测定枯草芽孢杆菌发酵金针菇菌糠的培养温度(A)、外源氮水平(B)、初始pH值(C)、发酵时间(D)、菌液接种量(E)5个因素对芽孢数的影响,同时测定发酵产物的有毒、有害物质含量。结果表明,枯草芽孢杆菌的最适发酵条件为培养温度35℃、棉粕添加量3%、初始pH值7.5、发酵时间48 h、菌液接种量10%。对其发酵结果的影响程度依次是外源氮水平>初始pH值>发酵时间>接种量>培养温度。此添加剂中的黄曲霉毒素B1以及重金属砷、铅、汞、镉的含量均符合国家饲料添加剂卫生指标。在此条件下固态发酵菌糠,枯草芽孢杆菌的芽孢数为8×109cfu/g(干重),对其发酵后产品烘干即得到饲料微生物添加剂。     

3种猪肺炎支原体疫苗对仔猪的免疫试验

猪肺炎支原体(Mhp)是引起猪的一种慢性接触性呼吸道病,这种病世界广泛流行,猪群感染率在30％～80％[1],由于降低了生长率和饲料利用率引起养猪业的巨大经济损失.一旦猪群中有几头猪被感染,就会在同圈猪之间传播,特别是在断奶时将猪混群以后更是这样.此外,大量研究表明,猪肺炎支原体与其他病原体具有协同感染作用,尤其是与猪繁殖与呼吸障碍综合征(PRRS)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)、猪流感病毒(SIV)等病毒性疫病混合感染后可以使病毒性肺炎的严重性和持久性明显增加[2].近年来猪肺炎支原体疫苗已在生产中广泛应用,市场上有国产、进口,肌肉注射、肺内接种、一次、二次免疫等[3-4],为了查清这些疫苗的免疫效果,我们选择不同类型的疫苗和不同的接种方法进行了免疫试验,总结如下.