鹅坦布苏病毒囊膜蛋白结构域Ⅱ在大肠杆菌中的表达及免疫学鉴定

为了实现鹅坦布苏病毒囊膜蛋白(E蛋白)结构域Ⅱ在大肠杆菌中的表达并对其进行免疫学鉴定,根据鹅坦布苏病毒JS804株囊膜蛋白基因序列,利用人工合成法获得鹅坦布苏病毒囊膜蛋白结构域Ⅱ编码基因并引入限制性酶切位点,片段大小为507 bp。将合成的基因片段克隆入pGEX-4t-1原核表达载体中,构建重组表达载体pGEX-EII并转化至BL21(DE3)中。通过优化表达条件获得重组蛋白质并进行免疫学鉴定。结果显示,重组蛋白质分子量约为4.4×104,Western-blot和间接免疫荧光检测结果表明重组蛋白质具有良好的免疫原性。     

谷胱甘肽硫转移酶与hEGF在大肠杆菌中的融合表达及活性研究

为了得到具有生物学活性的人表皮生长因子(hEGF),将含有人表皮生长因子基因的原核表达载体pGEX-4t-1(+)-hEGF转化入BL21-CodonPlusTM-RP表达宿主菌进行大量表达,SDS-PAGE分析表明,融合蛋白主要以包涵体的形式存在。收集包涵体,用氧化复性的方法,加入还原型的谷胱甘肽进行复性,之后通过GlutathioneSepharoseTM4B纯化柱,分离纯化得到复性的融合蛋白。以兔抗人EGF单克隆抗体为一抗,进行Western blotting鉴定,证明分离纯化得到的融合蛋白含有目的蛋白hEGF。最后对复性的融合蛋白进行了活性分析,表明该融合蛋白具有良好的hEGF生物学活性。     

红花miR397a基因表达及对靶基因LAC2的调控作用

【目的】研究红花miR397a前体基因及成熟基因在红花不同组织中的表达水平,并对miR397a基因序列、靶基因及基因功能进行分析,为深入研究红花抗逆机制提供参考。【方法】提取红花籽粒、花瓣、茎、根、叶片等5个组织材料的总RNA,使用荧光定量PCR鉴定miR397a在不同组织中的表达水平;利用生物信息学方法分析红花miR397a基因序列,用原生质体转化方法验证红花miR397a调控的靶基因LAC2,并利用转基因拟南芥表型研究miR397a基因的功能。【结果】miR397a前体基因和成熟基因均能在红花不同组织中表达,且均以叶片组织中的表达量最高,分别是籽粒组织的2.5与1.9倍,差异达极显著水平;miR397a序列在不同物种间高度保守,序列中仅存在1~2个碱基的错配或缺失;miR397a对LAC2基因有调控作用,miR397a的过表达可引起LAC2表达水平降低,红花miR397a表达引起植物对NaCl的敏感性增加。【结论】红花miR397a在叶片组织中的表达量最高,基因序列保守,且红花miR397a表达可增强植物对NaCl的敏感性。     

PrGV多角体膜蛋白（PEP）的分析

【目的】对菜粉蝶颗粒体病毒(Pieris rapae Granulovirus,PrGV)多角体膜蛋白(polyhedron envelope protein,PEP)进行研究,为揭示PEP的功能及其在病毒生命过程中的作用提供参考。【方法】以PrGV PEP为对象,通过序列分析、原核表达、抗体制备、Western blotting、胶体金免疫定位、实时荧光定量PCR等方法初步确认该基因定位和表达时相。【结果】PrGV PEP与其他鳞翅目昆虫颗粒体病毒的PEP同源性达到50%左右,但未在核型多角体病毒(Nucleo polyhedro virus,NPV)中发现同源序列。定量PCR分析表明,菜青虫感染PrGV后24h可检测到PEP的存在,随后该基因的表达水平逐渐升高,并在72h达到峰值。通过Western blotting可以在感染PrGV的菜青虫体内检测到大小分别为23ku和15ku的清晰条带,说明制备的多克隆抗体具有较好的特异性。免疫金标记将PEP定位于椭圆型的颗粒体,证明PEP是GV包涵体的重要组成部分。【结论】PrGV PEP在颗粒体病毒中较为保守,可能是PrGV晚期表达的重要基因,参与病毒侵染后期颗粒体结构的形成。     

丙型肝炎病毒囊膜蛋白基因疫苗的构建及其诱导小鼠体液免疫应答

将丙型肝炎病毒（HCV）H77株全长囊膜蛋白基因克隆到真核表达载体pcDNA4.0的CMV启动子下游，采用磷酸钙转染法将重组质粒转入293T细胞，用流式细胞仪检测细胞瞬时表达的目的蛋白。将构建的重组质粒肌注BALB/c小鼠，用表达HCV囊膜蛋白的SP2/0细胞作为抗原，用流式细胞仪检测小鼠血清HCV囊膜蛋白抗体。再用原核系统表达的E2蛋白作为抗原,Western Blot检测免疫小鼠血清抗体。试验结果显示,囊膜蛋白E1E2在293T细胞膜上进行了瞬时表达，基因疫苗免疫小鼠后产生了抗HCV囊膜蛋白的抗体，该抗体能与表达HCV囊膜蛋白的SP2/0细胞特异性结合，Western Blot表明该抗体也能与原核系统表达的E2蛋白结合。     

丙型肝炎病毒囊膜蛋白基因E1E2在真核细胞中的表达及动物免疫试验

利用DNA重组技术将丙型肝炎病毒（HCV）H77株E1E2囊膜蛋白基因插入逆转录病毒载体pBABE-puro中，构建成重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E1E2，用重组逆转录病毒载体与pVSVg质粒磷酸钙共沉淀法转染293T细胞,包装逆转录病毒假病毒。用包装的假病毒感染SP2/0细胞，经嘌呤霉素筛选阳性细胞后进行流式细胞仪技术（FACS）分析，结果表明,HCV E1E2基因在SP2/0细胞膜上成功表达。将表达E1E2蛋白的SP2/0细胞腹腔免疫BALB/c小鼠，经FACS分析免疫鼠血清，成功诱导小鼠产生了抗HCV E1E2蛋白的抗体，Western blot检测结果表明该抗体能与原核系统表达的E2蛋白结合。     

Characterization of gp41 as the transmembrane protein coded by the HTLV-III/LAV envelope gene

Radiolabeled amino acid sequencing was used to characterize gp41, an antigen of HTLV-III/LAV, the virus believed to be the etiological agent of the acquired immune deficiency syndrome. This antigen is the one most commonly detected in immunoblot assays by sera of patients with AIDS or AIDS-related complex (ARC) and other individuals infected with HTLV-III/LAV. A mouse monoclonal antibody that was reactive with gp41 precipitated a 160-kilodalton protein (gp160) in addition to gp41, but did not precipitate a 120-kilodalton protein (gp120) from extracts of metabolically labeled cells producing HTLV-III. Extracts of infected cells that had been labeled with tritiated leucine or isoleucine were immunoprecipitated with the monoclonal antibody. The immunoprecipitates were fractionated by polyacrylamide gel electrophoresis and the p41 was eluted from the gel bands and subjected to amino-terminal radiolabeled amino acid sequencing by the semiautomated Edman degradation. Leucine residues occurred in cycles 7, 9, 12, 26, 33, and 34 among 40 cycles and isoleucine occurred in cycle 4 among 24 cycles analyzed. Comparison of the data with the deduced amino acid sequence of the env gene product of HTLV-III precisely placed gp41 in the COOH-terminal region of the env gene product. Gp160 is thus the primary env gene product and it is processed into gp120 and gp41.     

鼻咽癌组织中WWOX基因和蛋白的表达及其临床意义

目的 探讨WWOX基因和蛋白在鼻咽癌组织中的表达及其与临床病理特征关系.方法 收集52例鼻咽癌和25例正常鼻咽组织,采用实时荧光定量PCR和免疫组化染色分别检测WWOX mRNA、蛋白表达.结果 鼻咽癌组织中WWOX基因、蛋白表达显著低于正常鼻咽组织（P＜0.05）.癌组织中WWOX基因、蛋白表达与分化程度、TNM分期有关（P＜0.05）.结论 检测WWOX表达可能有助于鼻咽癌诊断及预后判断.     

oleosin-MT融合蛋白在拟南芥中的表达及鉴定

【目的】获得转金属硫蛋白(MT)基因的拟南芥植株,为利用植物生物反应器规模化生产MT奠定基础。【方法】利用融合PCR方法,扩增拟南芥MT基因与油体蛋白oleosin基因的融合基因,将融合基因克隆至表达载体pOP上,构建重组质粒pOP-oleosin-MT。采用冻融法将质粒pOP-oleosin-MT转入根癌农杆菌EHA105中,通过农杆菌介导法转化拟南芥,用PCR检测并筛选转基因拟南芥阳性植株,采用SDS-PAGE法检测oleosin-MT融合蛋白的表达,用邻苯三酚自氧化法和结晶紫法测定融合蛋白的体外抗氧化活性。【结果】成功构建了植物油体特异表达载体pOP-oleosin-MT,融合蛋白oleosin-MT在拟南芥种子中成功表达,其分子质量为26ku;总蛋白质量浓度达到50μg/μL时,超氧阴离子的清除率最高,为58.5%;总蛋白质量浓度为10μg/μL时,羟自由基清除率可达69.7%。【结论】成功获得转MT基因的拟南芥株系,并证明融合蛋白oleosin-MT在拟南芥中具有良好的体外抗氧化活性。     

Alterations in T4 (CD4) protein and mRNA synthesis in cells infected with HIV

Cells infected with the human immunodeficiency virus (HIV) show decreased expression of the 58-kilodalton T4 (CD4) antigen on their surface. In this study, the effect of HIV infection on the synthesis of T4 messenger RNA (mRNA) and protein products was evaluated in T-cell lines. Metabolically labeled lysates from the T4+ cell line Sup-T1 were immunoprecipitated with monoclonal antibodies to T4. Compared with uninfected cells, HIV-infected Sup-T1 cells showed decreased amounts of T4 that coprecipitated with both the 120-kilodalton viral envelope and the 150-kilodalton envelope precursor molecules. In four of five HIV-producing T-cell lines studied, the steady-state levels of T4 mRNA were also reduced. Thus, the decreased T4 antigen on HIV-infected cells is due to at least three factors: reduced steady-state levels of T4-specific mRNA, reduced amounts of immunoprecipitable T4 antigen, and the complexing of available T4 antigen with viral envelope gene products. The data suggested that the T4 protein produced after infection may be complexed with viral envelope gene products within infected cells. Retroviral envelope-receptor complexes may thus participate in a general mechanism by which receptors for retroviruses are down-modulated and alterations in cellular function develop after infection.     

重组猪肺表面活性蛋白A在昆虫杆状病毒表达系统的表达及体外抗PRRSV活性初步鉴定

为研究重组猪肺表面活性蛋白A(RpSP-A)的抗病毒活性,采用Bac-to-Bac系统对RpSP-A蛋白进行表达。首先PCR扩增目的基因并将其克隆至pFastBac1转移载体获得pFast-SP-A,通过转化DH10Bac感受态细胞获得重组Bacmid,然后转染sf9细胞获得重组杆状病毒rBV-SP-A,在sf9细胞上进行目的蛋白的表达,经镍柱纯化、脱盐柱处理后,采用蚀斑减少方法评价RpSP-A对PRRSV感染Marc-145细胞的抑制作用。结果显示RpSP-A在sf9细胞中得到正确表达,并且能够降低PRRSV在Marc-145细胞上的感染,补加Ca~(2+)时30μg/mL RpSP-A抑制率高达77%,15μg/mL RpSP-A抑制率为43%,未补加Ca~(2+)时RpSP-A没有表现出抑制作用。上述结果表明利用Bac-to-Bac系统可以稳定获得大量具有抗PRRSV作用的可溶性RpSP-A。     

布鲁氏菌核糖体L7/L12蛋白的原核表达及对鼠源树突状细胞的作用

为了研究和探讨布鲁氏菌核糖体L7/L12蛋白对鼠源树突状细胞(BM-DCs)分化和成熟的影响,用布鲁氏菌S2疫苗株为模板扩增L7/L12基因,构建重组质粒pET30a-L7/L12,用大肠埃希菌原核表达系统进行诱导表达,并用Ni柱对表达的蛋白进行纯化.用IL-4和GM-CSF诱导培养鼠源DCs,用脂多糖(LPS)和L7...     

Autocatalytic synthesis of a viral RNA in vitro

Experiments with an RNA-dependent RNA polymerase ("replicase") purified from Escherichia coli infected with an RNA bacteriophage (Qbeta) demonstrate that the enzyme generates a polynucleotide of the same molecular weight as viral RNA; the "replicase" cannot distinguish the polynucleotide from its own RNA genome. By starting reactions at input ratios below the saturation levels of template to enzyme, autocatalytic kinetics of RNA increase are observed. The data are consistent with the conclusion that self-propagation of complete viral genomes is occurring in this simple system.     

survivin与PTEN、PCNA在子宫内膜癌中的表达及其临床意义

目的观察survivin、PTEN、增殖细胞核抗原(PCNA)在子宫内膜癌(EMC)中的表达及临床意义。方法运用免疫组化S-P法检测survivin、PTEN、PCNA蛋白在48例EMC、19例子宫内膜不典型增生、23例正常子宫内膜组织中表达情况,及其在EMC不同临床分期、组织学分级、肌层浸润程度表达。结果survivin、PCNA和PTEN在正常子宫内膜、子宫内膜不典型增生及EMC中的表达不同,不典型增生组、EMC组与正常子宫内膜组比较,差异有统计学意义(P<0.05或0.01),不典型增生组与EMC组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。EMC临床Ⅱ期、ⅢⅣ期survivin表达与Ⅰ期有不同,Ⅲ~Ⅳ期PTEN、PCNA表达与Ⅰ期有不同,差异均有统计学意义(P<0.05)。不同组织学G2、G3 survivin、PTEN、PCNA表达与G1有不同,差异有统计学意义(P<0.05或0.01)。无肌层浸润或浸润程度≤1/2组PTEN、PCNA表达与浸润程度>1/2组不同,差异有统计学意义(P<0.05)。结论检测survivin、PTEN、PCNA三者的表达水平对判断EMC的恶性程度及预测预后具有一定的临床参考价值。     

组蛋白乙酰化/去乙酰化与基因表达调控研究进展

在真核生物中,组蛋白是构成核小体的重要成分,其乙酰化与去乙酰化修饰在真核生物基因表达调控中起重要作用。组蛋白乙酰化异常(低乙酰化或高乙酰化)常会引起基因表达紊乱,进而引起疾病的发生。对组蛋白乙酰转移酶(Histone acetyltransferase,HAT)及组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylase,HDAC)的种类,组蛋白乙酰化与去乙酰化与基因表达调控、疾病发生的关系进行了综述。     

甲状腺乳头状癌p53蛋白的表达及临床意义

目的：观察p53蛋白在甲状腺乳头状癌中的表达及临床意义。方法；采用免疫组化S-P法，对68例甲状腺乳头状癌和10例正常甲状腺组织检测，用有关统计学方法结合临床及随访资料进行分析。结果：68例甲状腺乳头状癌中．p53蛋白阳性率为27．9％。正常甲状腺组织阴性。甲状腺乳头状癌病理分级、有无淋巴结转移与p53蛋白阳性表达率有关。结论：甲状腺乳头状癌预后可能与p53蛋白过度表达有关。     

高校艺术设计类专业毕业设计存在的问题及改革探讨

通过对教学现状进行分析,探讨艺术设计类专业毕业设计的教学改革思路,以期为该专业的毕业设计教学改革提供理论指导,从而提高人才培养的质量.     

红螯螯虾CHH2基因的表达特征及其在卵巢发育中的功能

为研究高血糖激素基因(CHH)在红螯螯虾卵巢发育中的作用,基于转录组学数据鉴定到红螯螯虾CHH2基因序列,并对其基本特性进行生物信息学分析。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测了CHH2在红螯螯虾不同组织和卵巢发育阶段的表达情况。结果表明,CHH蛋白在甲壳类物种中高度保守,同源性高达66.84%。qRT-PCR结果表明,在红螯螯虾的肝胰腺中几乎检测不到CHH2表达,在其他组织均有表达,包括肌肉、鳃、肠、心,且在卵巢中的表达水平最高;另外,CHH2在卵巢发育各个时期(未发育、发育期、快速发育期、成熟期)均有表达,表达水平先升高后降低,在卵巢发育成熟期表达水平最低。此外,在切除单侧眼柄和雌二醇活体注射的红螯螯虾卵巢中,CHH2表达水平显著降低。通过注射体外合成CHH2-dsRNA对红螯螯虾进行RNAi干扰试验,结果显示,卵巢发育重要标记卵黄蛋白原基因(VTG)表达水平显著上升。综上所述,CHH2可能负调控红螯螯虾卵巢发育,研究结果为进一步开发基于RNAi的促性腺成熟技术奠定理论基础。     

Adenovirus tumorigenesis: role of the viral genome in determining tumor morphology

Adenovirus type 12 transforms the fibroblastic BHK21 (baby hamster kidney) cell line into rounded or cuboidal cells that give rise in hamsters to undifferentiated small cell sarcomas indistinguishable from those induced in newborn hamsters by inoculation of the virus itself. In contrast. cells from this line transformed by polyoma virus retain their fibroblastic morphology and induce fibrosarcomas in hamsters. This suggests that the morphology of tumors induced by the adenovirus-transformed cells from this line may be determined by the viral genome and that such mechanism may also explain the remarkably uniform microscopic appearance which seems to characterize tumors induced in hamsters by direct inoculation of adenovirus type 12.