木薯碱性/中性转化酶MeNINV4酵母功能互补

木薯(Manihot esculenta Crantz)为大戟科植物,其块根富含淀粉,主要用于食用、饲用,同时木薯淀粉还可广泛应用于工业生产中。木薯块根淀粉的合成需要蔗糖提供碳水化合物和能量,碱性/中性转化酶在木薯块根蔗糖分解利用时起关键作用。前期已从木薯基因组中克隆获得了11个碱性/中性转化酶基因,其中Me NINV4主要在茎中表达。本研究主要利用转化酶酵母突变菌株SEY2102进行酵母功能互补实验,鉴定Me NINV4是否具有催化蔗糖分解的功能。结果发现,转了p DR196-Me NINV4的SEY2102酵母可以在以蔗糖为唯一碳源的培养基中生长,表明Me NINV4能催化分解蔗糖。提取含有p DR196-Me NINV4质粒的SEY2102酵母粗酶液,进行碱性/中性转化酶活性检测,发现其能催化蔗糖分解成还原糖。这些结果为进一步研究Me NINV4的酶学特性及生理功能提供参考。     

木薯磷脂酰肌醇磷酸5-激酶PIP5K9基因的克隆及表达分析

磷脂酰肌醇磷酸5-激酶9(PIP5K9)参与负调控植物碱性/中性转化酶的活性。本研究根据拟南芥PIP5K9基因序列信息,BLAST搜索木薯基因组数据库,找到木薯PIP5K9基因序列信息,利用RT-PCR方法克隆了木薯PIP5K9基因,命名为Me PIP5K9。生物信息学分析结果表明,该基因全长5 421 bp,包含8个外显子和7个内含子,CDS区全长2 496 bp,编码831个氨基酸。蛋白的N端包含8个MORN结构域,C端具有PIPKc结构域。序列比对和系统进化树分析结果表明,Me PIP5K9与麻风树PIP5K9亲缘关系最近,其次为蓖麻。基因表达分析发现,Me PIP5K9在叶片中表达量最高,其次是须根、茎和花,在块根和果中的表达量最低。本研究分离鉴定了木薯PIP5K9基因,分析了该基因的生物学信息及在不同组织中的表达模式,为进一步探讨其调控木薯碱性/中性转化酶的活性奠定基础。     

木薯不同部位光合同化产物分配的研究

摘要：本试验以南洋红、SC124、GR911、巴西种及GR891为试验材料,分析各木薯品种光合产物蔗糖和淀粉在不同部位的分配。试验结果表明：叶片同化产物蔗糖,直接通过韧皮部的运输到达块根,在块根中通过淀粉合成酶,转化成淀粉,随着块根淀粉含量的增大,叶片、块根中蔗糖含量也有增大的趋势,随着木薯块根淀粉积累的速度增加,叶片、叶柄中淀粉含量呈逐步减少的趋势。     

14-3-3蛋白结构与功能预测及其在木薯成熟期的表达分析

为了深入研究木薯14-3-3蛋白结构和功能,也为研究木薯块根淀粉积累的分子调控提供新思路。本研究采用生物信息学方法对木薯14-3-3蛋白家族的组成成分与理化性质、系统发育进化、导肽、亚细胞定位、二级结构、功能结构域、三级结构及亲水性、疏水性进行分析和预测,并对14-3-3基因在不同木薯品种中进行差异表达分析。结果表明：（1）木薯14-3-3蛋白家族16个异构体存在多个不同的保守结构域,二级结构相似的亲水性蛋白家族成员在进化关系上可划分为2大不同的类别;（2）14-3-3基因家族16个成员在花叶木薯、ZM-Seaside和华南9号(SC9)块根成熟期的表达水平存在显著性差异(P<0.05),与花叶木薯和SC9相比,产量较高的木薯品系ZM-Seaside块根中14-3-3基因表达水平显著下降(P<0.05),推测14-3-3蛋白在木薯块根成熟期的淀粉积累过程中可能起着负调控作用。     

实时荧光定量PCR检测木薯转化酶和蔗糖合酶的mRNA表达量

本研究通过对木薯根不同发育时期的酸性转化酶和蔗糖合酶进行m RNA表达量检测,旨在为木薯块根膨大过程中韧皮部卸载路径的阐明提供一定的证据。采用了实时荧光定量PCR技术、△△Ct法对蔗糖代谢酶m RNA相对表达量进行测定。质外体途径的调控酶细胞壁和可溶性酸性转化酶都在须根里表现出了较高的表达量,尤其是细胞壁性酸性转化酶在两种须根里的表达量都显著高于三个发育时期的块根,与之相反,共质体途径的调控酶蔗糖合酶在块根中的表达量则显著高于须根,特别是膨大期的表达量在这些组织中表现出最高水平。因此,细胞壁酸性转化酶和蔗糖合酶分别在须根和块根中的相对高表达,初步证实了须根的质外体和块根的共质体卸载途径的主体地位。     

不同木薯品种叶片碳氮代谢与块根淀粉积累特性研究

摘 要：本试验以木薯高淀粉品种GR891、南植199(nanzhi199)和低淀粉品种南洋红(SC201)为材料,分别在块根形成期、块根膨大期和工艺成熟期测定叶片碳氮代谢有关指标和块根淀粉含量,探讨木薯叶片碳氮代谢与块根淀粉积累的关系。结果表明,块根淀粉含量与叶片叶片谷氨酰胺合成酶(GS)活性、叶片蔗糖磷酸合成酶(SPS)活性、叶片磷酸合成酶(SS)活性、叶片可溶性糖含量呈正相关关系且与叶片磷酸合成酶(SS)活性达到显著水平,与叶片硝酸还原酶(NR)活性呈负相关但不显著。块根淀粉含量与叶片蔗糖含量、叶片可溶性蛋白含量、叶片氨基酸含量呈极显著负相关关系。但高淀粉木薯品种在生育后期代谢活性下降缓慢,显示出源端较强的同化物持续供应能力。各品种表现出相同的规律。     

5个木薯品种生理特性与主要农艺性状的研究

对木薯品种西选07、桂垦09-11、辐选01、南植199和华南205的生理特性和主要农艺性状进行比较研究。结果表明,5个木薯品种的叶片叶绿素、蔗糖、可溶性糖含量、农艺性状、产量和淀粉含量有显著差异。西选07块根产量最高,其次是桂垦09-11和辐选01;南植199淀粉含量最高,其次是辐选01和西选07;西选07淀粉产量最高,其次是辐选01和桂垦09-11;西选07单株块根数、块根长、块根粗和块根重最高,其次是桂垦09-11和辐选01;南植199叶片蔗糖和可溶性糖含量最高,其次是西选07和辐选01。叶片蔗糖、可溶性糖含量均与块根淀粉含量呈极显著正相关,可作为高淀粉木薯品种评价的生理指标。淀粉产量综合反映木薯淀粉生产能力,可作为木薯品种品质评价的指标。     

甘蔗不同品种(种)间叶片中酶活性差异的研究

研究了8个甘蔗品种(种)叶片中的酸性转化酶、中性转化酶、淀粉酶以及酸性磷酸酶在不同生长期的活性。结果表明,叶片中的酸性和中性转化酶以及淀粉酶与甘蔗的生长有明显的关系。酸性转化酶活性以及酸性对中性转化酶活性的比率与品种(种)蔗糖份的高低有密切的负相关趋势。因此,似乎有可能把叶片中的酸性和中性转化酶活性作为在     

高低淀粉木薯品种光合特性研究

为了探讨高低淀粉木薯品种不同生育期内光合特性的变化,以SC124和‘辐选01’两个块根淀粉含量不同的木薯品种为材料,利用LI-6400光合作用测定仪,研究高、低淀粉木薯品种的光合特性。结果表明：在整个生育期,高低淀粉木薯品种净光合速率呈先上升后下降的趋势,在木薯的苗期,‘辐选01’的净光合速率明显低于SC124;在块根膨大期,‘辐选01’的净光合速率明显高于SC124;在块根形成期、块根成熟期,差异不明显。在整个生育期,高低淀粉木薯品种蒸腾速率呈先上升后下降的趋势,在木薯的苗期、块根形成期、块根成熟期,‘辐选01’的蒸腾速率明显低于SC124;而在块根膨大期,‘辐选01’的蒸腾速率高于SC124,但差异不明显。在整个生育期,高低淀粉木薯品种气孔导度呈先上升后下降的趋势,在木薯的整个生长时期,‘辐选01’的气孔导度都低于SC124。在整个生育期,高低淀粉木薯品种胞间CO2浓度呈先上升后下降的趋势,在木薯的苗期、块根形成期,‘辐选01’的胞间CO2浓度都低于SC124,但差异不明显;在块根膨大期,‘辐选01’的胞间CO2浓度明显高于SC124;在块根成熟期,‘辐选01’的胞间CO2浓度明显低于SC124。     

木薯叶片可溶性糖含量与块根淀粉积累的关系

试验以辐选01，华南5号(SC5)，新选048，新选056，南洋红（SC201），华南205(SC205)，GR891，华南124（SC124）为材料，分别在块根形成期、块根膨大期和工艺成熟期测定叶片可溶性糖含量和块根淀粉含量，探讨木薯叶片可溶性含量与块根淀粉积累的关系。结果表明，从块根形成期到工艺成熟期，叶片可溶性总糖含量与块根淀粉积累都逐渐增加，叶片可溶性总糖含量与块根淀粉积累呈正相关，从块根膨大期到工艺成熟期，叶片还原糖含量逐浙增加，与块根淀粉积累呈正相关，而叶片蔗糖含量逐浙降低。与块根淀粉积累呈负相关。8个品种都有同样的趋势。     

甘薯细胞壁蔗糖转化酶基因IbCWIN家族成员鉴定及表达分析

甘薯是重要的粮食、饲料、工业原料作物和新型的生物能源作物,细胞壁蔗糖转化酶是植物源、库组织蔗糖代谢的关键酶,但关于甘薯细胞壁蔗糖转化酶基因IbCWIN家族成员的研究尚未见报道。本研究测定供试品种不同组织部位的蔗糖淀粉含量,利用生物信息学方法对IbCWIN基因家族的理化性质、保守结构域、系统进化关系、启动子作用元件、组织特异性表达模式进行分析。结果表明,甘薯茎中蔗糖含量最高,须根和叶次之,块根最低;块根淀粉含量最高,极显著高于其他部位。甘薯中含有10个IbCWIN基因,编码氨基酸442~1115个,蛋白质分子量范围49.56~124.44kD,等电点为5.0~9.1。分布在8条染色体上,都含有Glyco_32保守结构域及相同或相似的保守基序motif,属于糖基水解酶基因家族GH32。IbCWIN与木薯MeCWINV同源性高,IbCWIN基因家族启动子区域含有多种类型的顺式作用元件。qRT-PCR结果表明,IbCWIN基因家族在甘薯不同组织中均有表达且有多种表达模式,其中IbCWIN2和IbCWIN9在块根中表达量显著高于其他组织部位。本研究为下一步探索甘薯IbCWIN基因家族的功能及调控甘薯源、库关系机制提供理论指导。     

木薯碱性/中性转化酶MeNINV1基因启动子的克隆及激素应答表达分析

为了解木薯碱性/中性转化酶基因MeNINV1对激素的应答模式及调控机制本研究采用PCR技术,从木薯基因组中分离出MeNINV1基因启动子序列。分析结果显示该启动子长度1 714 bp,含有TATA box和CAAT box保守元件,以及四个激素响应元件:ERE(乙烯应答)、ABRE(ABA应答)、TAC-element(SA应答)和P-box(GA应答)。根据启动子上存在的参与激素应答相关的顺式作用元件信息,选用30μmol/L GA3、30μmol/L ABA、100μmol/L SA和1%乙烯利四种外源激素胁迫处理木薯SC8组培苗,利用实时荧光定量PCR技术,研究MeNINV1基因在不同激素处理下的表达模式。结果表明,MeNINV1基因的表达受激素的调控,因此推断碱性/中性转化酶基因MeNINV1启动子上的激素应答元件响应激素诱导,调控基因的表达。研究结果为进一步研究激素信号如何调控木薯块根蔗糖的分解代谢提供理论基础。     

甜菜蔗糖代谢相关酶活性与糖积累关系的研究

在甜菜不同生育时期同步测定了块根和叶片中的可溶性总糖、果糖和蔗糖含量及蔗糖代谢相关酶-酸性转化酶(AI)、中性转化酶(NI)、蔗糖合成酶(SS)和蔗糖磷酸合成酶(SPS)的活性,并对糖积累与酶活性的关系进行了分析.结果表明,甜菜蔗糖代谢的相关酶对块根的糖积累的影响要高于叶片;甜菜块根和叶片中的合成和分解酶类是协同作用进行糖积累过程,并非哪类酶在单独发挥作用;整个生育期甜菜块根的可溶性总糖、果糖和蔗糖含量均大于叶片,苗期块根中果糖是块根糖积累的主要产物,叶丛形成期块根中蔗糖是块根糖积累的主要产物.     

甜菜蔗糖代谢两种相关酶的活性变化及其相互关系

为了研究不同类型甜菜品种蔗糖代谢能力存在明显差异的生理机制,以糖用甜菜(高糖)和饲用甜菜(丰产)为试验对象,测定了不同生育阶段叶片、叶柄和块根中的蔗糖合成酶(SS)和蔗糖磷酸合成酶(SPS)活性。结果表明:叶片、叶柄和块根中存在蔗糖合成与降解过程,不同类型甜菜在生长期蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶活性存在差别,同一品种不同部位,块根中蔗糖的代谢强度高于叶片和叶柄,糖用甜菜两种酶活性高于饲用甜菜,蔗糖代谢相关酶活性差异是品种特性,可用于甜菜的选种实践。     

不同木薯品种生理及块根淀粉积累特性研究

以木薯品种南洋红、华南205、GR891、华南124、新选056、辐选01、华南5号、新选048为材料,对木薯不同品种生理生化和淀粉积累特性进行研究。结果表明：辐选01、GR891叶片可溶性糖、可溶性蛋白质、还原糖、蔗糖含量较高,块根淀粉积累早、积累快,淀粉含量较高;而华南124、南洋红叶片可溶性糖、可溶性蛋白质、还原糖、蔗糖含量较低,块根淀粉积累较迟、积累较慢,淀粉含量较低。华南205、新选056、华南5号、新选048介于前四者之间。可见,木薯叶片可溶性糖、可溶性蛋白质、还原糖、蔗糖含量与块根淀粉积累有密切关系。     

木薯MeVINV1基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体构建及验证

液泡转化酶(vacuolar invertase, VINV)是参与植物蔗糖代谢、器官发育的关键酶之一。木薯MeVINV1在块根发育及淀粉积累阶段的表达活跃,对该基因进行编辑敲除,将有助于解析MeVINV1在木薯块根淀粉积累过程中的作用。本研究构建了MeVINV1的CRISPR/Cas9基因编辑载体,转化木薯脆性胚性愈伤组织以验证载体的编辑效果。结果发现：转化后的样品中,MeVINV1基因靶点位置出现测序多峰,而未转化样品中没有多峰出现,表明本研究构建的基因编辑载体可对MeVINV1基因进行编辑;检测分析潜在脱靶位点的序列,发现未出现脱靶现象。该研究为获得MeVINV1基因的突变体,明确其在木薯块根发育及淀粉积累过程中的功能奠定了基础。     

木薯内源激素含量与块根淀粉积累关系研究

为探讨木薯内源激素(IAA、ABA、GA3、CYT)含量和块根淀粉积累的关系,分别对高低淀粉木薯品种不同时期块根、茎秆、叶片内源激素(IAA、ABA、GA3、CYT)和块根淀粉含量变化进行研究。结果表明：块根、茎秆、叶片中IAA含量变化趋势一致,在块根形成期达到最大值;块根、茎秆内ABA、GA3,叶片内ABA与块根淀粉含量呈极显著正相关关系,其中茎秆ABA、GA3主要是通过影响光合产物的装载和运输来促进块根淀粉的积累;在块根形成期和膨大期,高淀粉木薯品种‘辐选01’块根内CYT含量高且持续时间长。叶片中IAA、CYT、GA3与块根淀粉含量呈极显著负相关关系,随着块根成熟,这3种内源激素都有不同程度的上升趋势,可能与它抗衰老的能力有关。在块根膨大期,‘华南124’茎秆GA3含量极显著高于‘辐选01’,‘辐选01’块根、叶片ABA含量在生长后期显著高于‘华南124’,说明低淀粉木薯品种后期不易早衰,但地上部分生长过旺不利于块根淀粉积累。     

木薯块根有色体分离及其蛋白质组学的研究

木薯(Manihot esculenta Crantz)块根有色体是类胡萝卜素贮藏和调控多种生理生化过程的场所。本研究发现Percoll密度梯度离心法最适合于木薯块根有色体的提取,利用光学显微镜观察发现40%~50%Percoll梯度层富含完整有色体,Western blot分析显示该层的线粒体标志酶Vdac1杂交信号较低,而质体标志酶Rbc L杂交信号最高,并以此确定木薯块根有色体的分离方法。利用蛋白质组学方法显示SC9块根有色体存在34个差异蛋白质,其中上调表达17个,下调表达17个;涉及碳代谢及能量代谢相关蛋白所占比例最高。STRING蛋白质互作网络显示,Enolase 2与Elongation Factor互作关系最多,是整个互作网络的核心蛋白质。q RT-PCR定量分析显示Enolase 2在高类胡萝卜素的蛋黄木薯SC9的表达水平显著高于低类胡萝卜素品种SC6068。推测其可能是影响SC9与SC6068类胡萝卜素差异的主要蛋白质之一。     

HPLC-ELSD法测定木薯块根中蔗糖、葡萄糖、果糖的含量

可溶性糖为木薯块根淀粉的合成提供底物和能量,准确测定其含量有助于进一步了解木薯块根淀粉积累过程。本研究以水提法提取木薯块根中的可溶性糖,采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法(HPLCELSD)测定样品中果糖、葡萄糖、蔗糖的含量。以Waters-NH2色谱柱结合Alltech 3300 ELSD蒸发光检测器进行糖含量的测定,流动相为乙腈/水(70/30,V/V),含0.1%的氨水。果糖、葡萄糖和蔗糖的分离效果较好,在1~25μg范围内线性关系良好,精密度RSD分别为0.31%、0.22%和1.42%,回收率分别为97.62%、98.03%、96.30%,样品稳定性实验的RSD分别为0.88%、0.48%和1.05%。实验结果表明HPLC-ELSD法是分析木薯块根中的蔗糖、葡萄糖、果糖含量的有效技术,可为研究淀粉含量不同的木薯品种在糖代谢过程中的差异奠定基础。     

木薯不同生育时期内源激素含量变化研究

为探讨木薯块根淀粉含量不同的品种不同生育时期内源激素的变化,以‘华南124’和‘辐选01’2个块根淀粉含量不同的木薯品种为材料,分别对其不同生长发育时期的块根、茎杆及叶片中内源吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA3)、玉米素(ZR)、脱落酸(ABA)的含量变化进行了研究。结果表明：2个木薯品种块根、茎杆及叶片中IAA、GA3和ZR 3种激素的含量变化趋势基本一致,在块根中这3种激素均呈先上升后下降的变化趋势,茎杆中这3种激素的含量均呈先下降后上升的变化趋势,叶片中这3种激素的含量均为逐渐下降的变化趋势;而ABA含量的变化不同于IAA、GA3和ZR,其在整个生育期间呈不断上升的变化趋势。不同品种内源激素含量变化不同,块根IAA含量生育前中期,‘辐选01’高于‘华南124’,后期两者差异不大。块根GA3含量生育前期,2个品上差不大,中后期‘华南124’高于‘辐选01’。块根ZR含量前期两个品种相差不大,中期‘辐选01’高于‘华南124’,后期‘华南124’高于‘辐选01’;块根ABA含量整个生育期‘华南124’高于‘辐选01’,但叶片ABA含量则相反,‘辐选01’高于‘华南124’。木薯不同生育时期块根、茎杆及叶片的内源激素IAA、GA3、ZR、ABA含量变化不同,块根淀粉含量不同的品种内源激素含量变化也不同。