利用SLAF-seq技术构建水稻籼粳交DH群体遗传图谱

我们利用特定位点扩增片段测序技术(specific-length amplified fragment sequencing,SLAF-seq)对籼稻窄叶青8(ZYQ8)和粳稻京系17(JX17)构建的双单倍体(doubled haploid,DH)群体进行了简化基因组测序。将DH群体测序数据与水稻参考基因组进行比较分析,获得了70 997个在两个亲本中存在多态性的SLAF标签。通过进一步的筛选,我们利用8 940个高质量的SLAF标签构建了该群体的遗传图谱。图谱覆盖12个连锁群,总图距为2 294 71 c M,标记间的平均图距为0.26 c M。遗传图谱的连锁群与水稻物理图的相关系数统计显示,除了9号连锁群的相关系数为0.87外,其余的11个连锁群的相关系数均在0.95以上,表明该图谱的12个连锁群与水稻物理图有很好共线性关系。该高密度图谱的构建为我们进一步研究籼、粳差异基因提供了帮助。     

基于SLAF-seq技术枇杷SNP位点开发

利用SLAF-seq测序技术,开发一批特异性强、稳定性高的单核苷酸多态性(SNP)位点,为枇杷遗传图谱构建、分子辅助育种和物种进化等研究提供理论依据。本研究共收集294份枇杷属资源,利用SLAF-seq测序技术进行测序。以梨基因组为参考基因组进行电子酶切预测,确定使用HaeⅢ+Hpy166Ⅱ进行酶切,构建SLAF-seq文库,而后筛选314～364 bp长度的DNA片段定义为SLAF标签,预测可得到116 171个SLAF标签。共获得526.63 M reads数据,各样品所获得的读长数目在119 893～9 305 152范围内,平均读长为1 787581;测序质量值Q30的范围在88.26%～95.67%,平均为93.61%;GC含量分布在38.79%～42.92%范围内,平均值为40.35%。本实验以水稻测序获得0.16 M reads的数据量为Control,双端比对效率在91.28%,说明SLAF建库基本正常。生物信息学分析结果显示本研究共获得623 356个SLAF标签,且有123 498个多态性的标签,多态性为19.81%。在多态性SLAF标签上开发得到1 604 434个群体SNP标记。根据完整度0.8,MAF0.05过滤,共得到95 960个高一致性的群体SNP。     

华山松高通量全基因组SNP标记开发及其分析

为开发华山松大量的稳定性高、特异性强的SNP标记,本研究以279份华山松针叶为试验材料,利用SLAF-seq技术,测序共获得Reads数据3 169 Mb,SLAF标签12 952 676个,多态性SLAF标签为1 456 486个,SLAF多态性百分率是11.24%,平均测序深度为20.52 x,测序平均Q30为96.58%,平均GC含量为37.76%。且采用水稻‘日本晴’的测序数据用于评估试验建库的准确性,结果显示本试验比对效率在97%;且水稻‘日本晴’数据的酶切效率在100%,这表明本试验酶切反应也正常。最终从12 952 676个SLAF标签中检测到了3 469 074个群体SNP标记。这为华山松分子辅助育种、遗传多样性分析和遗传图谱构建等研究提供理论参考。     

紫苏SNP分子标记开发及遗传多样性分析

紫苏(Perilla frutescens(L.))是一种药食兼用型的植物,具有丰富的营养价值和药用价值,本研究利用特异性位点扩增片段测序技术(specific-locus amplified fragment sequencing,SLAF-seq)对30份紫苏种质资源进行了分子标记开发,以‘日本晴’(水稻)为对照,测序获得紫苏全基因组范围内的SNP分子标记。通过测序共获得106.92 Mb Reads数据,各样本Reads数据在1742153~9815872之间,样本平均测序质量值Q30为95.91%;平均GC含量为39.16%。通过生物信息学分析,本研究获得406599个SLAF标签,样本的平均测序深度为19.13倍,其中多态性的SLAF标签共有140387个,共得到419223个群体SNP标记。利用开发的SNP分子标记将30份紫苏种质资源分为2组,紫苏SNP分子标记的研究可为紫苏的遗传图谱构建、种质资源鉴定以及农艺性状的关联分析提供理论基础。     

四种天麻基于SLAF测序的SNP标记开发与分析

为了分析天麻种质资源的遗传多样性及其进化关系,开发特异性SNP(Singlenucleotidepolymorphism)标记位点。实验通过对4种不同种或不同产地的同种天麻共28个样品进行SLAF测序,首次在天麻种质资源中得到SLAF标签并开发SNP标记,通过De nove测序技术,构建SLAF文库,利用GATK和SAMTOOLS技术开发SNP标记。共获得75.95 M高质量的reads数据,471001个SLAF标签,其中多态性SLAF标签19675个,并开发出60238个群体SNP。对SNP标记的分析的结果表明,作为主要栽培种的天麻(W)由于长时间的人工培育,也许使得其遗传进化体系与其他的天麻种质资源存在较大差异。另外,所有样品中SNP标记的杂合率普遍高于20%,突出了天麻这一物种广泛的杂合性。而且,利用简化基因组测序技术SLAF-seq可以高效地、低成本地开发出大量的可用于群体遗传结构分析的SNP标记。     

基于SLAF-seq技术的向日葵SNP标记开发与利用

为解决向日葵基因组序列庞大及基因位点挖掘的问题,试验共收集了122份向日葵资源材料,利用SLAF-seq技术,以菊科小蓬草基因组作为参考基因组进行酶切预测,水稻日本晴测序数据为对照进行比对,获得多态性标签,并开发大量特异性SNP。本研究共获得477.76 M Reads数据,读长范围在1 329 754~5 770 666之间,对照数据的双端比对效率为92.96%,酶切效率为95.07%,平均Q30为92.32%,平均GC含量为43.04%,每个样本平均开发171 684个SLAF标签,样本SLAF标签的平均测序深度为20.07 x,通过生物信息学分析,共获得1 105 347个SLAF标签,其中多态性SLAF标签共有86 985个,共鉴定到414 692个群体SNP。这些SNP位点可为向日葵特异SNP标记的开发、资源鉴定分析以及农艺性状的关联分析等提供理论依据。     

基于SLAF-seq技术的树莓SNP位点开发

为分析树莓群体的遗传进化关系,开发特异性SNP标记。选用23 个栽培种树莓以用SLAF-seq技术测序,从树莓全基因组范围开发SNP位点,以黑树莓基因组为参考基因组,通过生物信息学分析进行电子酶切预测,筛选特异长度的DNA片断,构建SLAF-seq 文库。通过高通量测序的方式获得海量序列标签,利用软件分析比对,获得多态性SLAF标签,进而开发大量特异性SNP位点。对照水稻的测序数据与参考基因组比对结果,双端比对效率为95.60%,酶切效率为93.52%,说明SLAF建库正常。通过测序共产生59.93 Mb的读长数据,测序质量值Q30 平均为95.07%,所有样品GC含量均值为39.16%,GC含量普遍不高,说明达到测序要求。本研究共获得425402 个SLAF标签,其中多态性的SLAF标签共有121610 个。获得749811 个有效单核苷酸多态(SNP),利用这些SNP分析了23 个树莓种质的群体结构与系统发生树。利用简化基因组测序技术SLAF-seq 可以高效地、低成本地开发出大量的可用于群体遗传结构分析的SNP标记。     

高粱单核苷酸多态性(SNP)标记开发研究初报

高粱在粮食安全、人类健康和生物能源的开发上具有非常重要的作用,其被认为是二倍体模式化作物和多倍体能源作物甘蔗和芒草类的参考植物,开发高粱多态性分子标记对促进分子遗传学发展及高粱分子标记辅助育种意义重大。以甜高粱与粒用高粱杂交的F2遗传群体作为研究材料,对其全基因组DNA进行酶切,然后用高通量测序法开发SLAF(Specific-locus amplified fragment sequencing)标签,并经过分析筛选多态性SNP标记。试验过程中测序的reads数达到43 528 021个,母本2 598 472个,父本3 134 524个,子代的reads数为205 083~454 258个,平均为290 732.5个。通过原始数据的评估、聚类和纠错开发的SLAF标签数,父母本分别为44 895,42 100个。测序深度分别为19.78和16.22,F2群体每个个体的SLAF标签为26 737~39 291个,平均为33 445.06个,测序深度2.24~3.72,平均为2.79。通过对聚类群中高深度片段的潜在基因型分析,得到了6 353个多态性SNP标记,其中5 829个标记成功分型,占多态性SNP标记的91.75%,剔除不适宜作图的标记,剩余有效的SNP标记2 246个,占有效标记百分比100%,F2个体的各样品完整度平均为94.99%。所以,对基因组DNA进行酶切和高通量测序,从庞大的reads中获得SLAF标签是得到全基因组SNP标记的有效途径。为高粱高密度图谱构建和QTL定位研究,以及分子标记辅助育种奠定了基础。     

基于高密度遗传图谱的水稻糙米率QTL定位分析

水稻糙米率是加工品质中的一个重要组成部分。为了探索糙米率的遗传基础,本研究以V20B和CPSLO17作为亲本,构建了150个重组自交系(recombinant inbred lines,RIL)群体。利用SLAF标签构建的精度更高、平均遗传距离为0.292 c M的高密度遗传图谱,结合亲本和群体糙米率表型数据,对三亚和贵阳两个环境下控制水稻糙米率的数量性状位点(quantitative trait loci,QTL)进行遗传分析。结果显示:三亚和贵阳共检测到两个QTL。其中,三亚检测到1个QTL位点q BR1,位于第1染色体Marker600937~Marker685097区间上,两个标记间遗传距离为0.471 c M,贡献率为9.7470%;贵阳检测到1个QTL位点q BR4位于第4染色体Marker503771~Marker431234区间上,两个标记间遗传距离为0.469 c M,贡献率为9.7634%。两个检测到的QTL,在两个环境中未重复检测到,且增效位点均来自于亲本V20B。本研究对进一步发掘和利用水稻糙米率QTL具有重要意义,同时为利用分子标记辅助选择提高水稻糙米率提供参考。     

控制高粱分蘖与主茎株高一致性的基因定位

用分蘖与主茎株高一致的高粱品系K35-Y5与分蘖明显高于主茎的高粱恢复系1383杂交, F1自交获得F2分离群体,构建两混池,采用BSA (bulked segregation analysis)和SLAF (specific length amplified fragment sequencing)技术将高粱分蘖与主茎株高一致基因定位。遗传分析表明,分蘖与主茎株高一致性状由1对隐性核基因控制。参考已公布高粱基因组设计酶切方案,构建SLAF文库并测序。对高粱参考基因组序列进行电子酶切预测,确定限制性内切酶为Rsa I+Hae III,酶切片段长度为364～414 bp;测序Q30为91.70%, GC含量为45.79%,达到测序要求;与水稻的测序数据相比,高粱的双端比对效率为93.35%,酶切效率为90.60%, SLAF建库正常。共获得30.80 M reads,开发出133,246个SLAF标签,再通过分析SLAF标签的多态性,检测到319,428个SNP位点。利用SNP-index法和Euclideandistance法及取两者交集进行关联分析,最后得到一个关联区域,位于第9染色体上的54,788,026～56,740,873区间内,关联区域长度1.95 Mb。分析关联区域内的基因在2个亲本之间SNP,对这些SNP进行变异的注释,发现4个非同义突变的SNP。经验证,这4个SNP位点和分蘖与主茎株高一致性状相关。对应到Sobic.009G197901.1、Sobic.009G213300.1和Sobic.009G221200.1三个基因上,这些基因可能是与性状直接相关的功能基因。     

利用高密度SNP芯片精确定位长豇豆耐早衰性QTLs

早衰性是长豇豆的一个重要不利农艺性状。由于嫩荚是长豇豆最主要的商品器官,植株早衰容易影响后期结荚数,导致豆荚产量下降,给种植者带来经济损失。本研究以长豇豆品系ZN016和ZJ282杂交构建的一个含119个株系的扩大重组自交系(F6:8代)群体为材料,利用由豇豆60K高密度SNP芯片构建的含8 032个SNP位点的高密度分子遗传图谱对长豇豆耐早衰性状进行QTL精确定位,最终将长豇豆耐早衰性状的主效QTL定位在LG11上约0.424 c M的区间内。与早期对同一性状QTL定位结果相比证实了本实验室前期的粗定位结果,并且本次QTL定位精度明显提高,大幅度缩小了侧翼标记间的距离。本研究为今后针对耐早衰性这一农艺性状的分子标记辅助育种、基因克隆提供了基础。     

基于SLAF-seq技术连翘SNP分子标记开发及遗传多样性分析

连翘(Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl)是一种极具开发价值的药用植物,本研究利用特异性位点扩增片段测序技术对39份连翘种质资源进行了分子标记开发,通过测序共获得112.28 Mb reads数据,各样本reads数据在1 324 860～5 911 565之间,样本平均测序质量值Q30为96.29%;平均GC含量为36.97%。通过生物信息学分析,本研究获得535 357个SLAF标签,样本的平均测序深度为16.20倍,其中多态性的SLAF标签共有262 297个,开发获得1 809 741个SNP标记。利用开发的SNP分子标记将39份连翘种质资源分为4组,连翘SNP分子标记的研究可为连翘种质资源鉴定和遗传多样性分析提供理论基础。     

苹果SLAF图谱构建及果锈基因QTL分析

为了定位苹果果锈的QTL,鉴定果锈基因的遗传位点,以解析苹果果锈基因的分子遗传基础。以宫崎短枝富士×坂田津轻分离群体及其亲本为材料,基于SLAF-seq技术开发分子标签,并构建高密度遗传图谱,结合3个年份的田间表型数据,采用mapqtl进行果锈基因的QTL分析。结果表明,获得了522 122 315 reads(110.32 Gb)的测序数据,测序平均Q30为95.07%,平均GC含量为40.11%;开发了20 440个SLAF标签,7 309 729个SNP;构建了17个连锁群,4 075个上图标记,总图距为2 235.23 cM,平均图距达0.55 cM,上图标记的完整度为99.92%。共检测到了9个果锈相关的QTL,分别分布在Chr3、Chr9、Chr11、Chr15染色体上,标记距离为0～4.9 cM,贡献率为18.0%～85.5%。其中,检测到控制果锈的Qru-9、Qru-15、Qru-3的贡献率较高,可能是控制苹果果锈的关键位点。构建了苹果SLAF遗传图谱,获得了9个与果锈相关的QTL,研究结果对于苹果果锈及其相关基因的进一步挖掘与利用具有重要意义。     

基于SLAF-seq技术的闽楠SNP标记开发及遗传多样性分析

利用简化基因组测序技术SLAF-seq,对广泛分布在长江以南地区8个省份的33份闽楠种质进行SNP标记开发、指纹图谱构建和遗传多样性分析。本研究对各样品的测序数据进行统计,共获得107.52 Mb Clean Reads数据,每个样品的SNP标记数目介于309 012～540 030之间,样本平均测序质量值Q30为93.78%,平均GC含量为40.90%。共获得1 072 115个SLAF标签,其中多态性SLAF标签275 389个。通过序列分析,获得121 352个有效的单核苷酸多态性标记(SNP);经过指纹图谱严格的过滤条件,筛选出3 452个SNP位点作为指纹图谱SNP。利用开发的SNP分子标记,将33份闽楠种质资源分为3个亚群,这3个亚群分别包含材料为Q1:17个,Q2:11个,Q3:5个。通过进一步过滤,获得270个核心SNP标记作为指纹图谱的核心标记,可用于品种种质的鉴定。研究结果表明,简化基因组测序技术SLAF-seq能高效、低廉地开发出大量SNP标记,是一种适用于闽楠种质资源遗传分析的有效工具;利用筛选出的核心SNP分子标记构建闽楠DNA指纹图谱,为SNP分子标记应用于闽楠种质鉴定、闽楠品种改良与优质品种选育提供依据,也有利于闽楠种质的高效利用及杂种优势群的建立。     

采用基于高分辨率熔解曲线技术的SNP标记定位徐州142无絮的短绒控制基因

【目的】定位徐州142无絮(XZ142w)突变体的短绒控制基因n2。【方法】以陆地棉(Gossypium hirsutum L.)徐州142(XZ142)×XZ142w的F2群体为研究对象,利用108个简单重复序列(Simple sequence repeat,SSR)标记对n2进行初步定位,再根据2个亲本材料中有单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphic,SNP)的差异基因设计50对SNP引物,用高分辨率熔解曲线(High resolution melting,HRM)技术从中筛选在亲本间有多态性的SNP引物,并用于后代的基因分型。【结果】利用108个SSR标记将n2初步定位在26号染色体的20.2c M的遗传区间内;用HRM技术筛选到9对亲本间有多态性的SNP引物,成功实现基因分型;并结合以SSR构建的连锁图谱,将n2的遗传区间缩小为19.5 c M,n2与最近的SNP标记Cricaas20158遗传距离为5.5 c M,且遗传图谱上的标记与四倍体陆地棉测序物理图谱基本一致。【结论】HRM技术可用于棉花中的SNP检测和n2基因的定位。     

甜瓜遗传图谱与基因定位研究进展

甜瓜是重要的葫芦科蔬菜作物之一,其遗传育种学广受研究者的关注。高密度分子遗传图谱有助于提高甜瓜的育种水平,加快育种进程。自1996年第一张甜瓜分子遗传图谱报道后,AFLP等分子标记逐步被应用于甜瓜分子遗传图谱的构建及基因定位。近年来,基因组测序技术发展迅速,全基因组重测序、简化基因组测序、转录组测序等技术逐渐被应用于构建覆盖全基因组的、更加饱和的甜瓜遗传连锁图谱。本研究着重对甜瓜分子遗传图谱、重要农艺性状基因定位研究进展进行了综述,以期为甜瓜生物学研究及分子改良提供理论参考。     

利用简化基因组技术分析甘薯种间单核苷酸多态性

选用Xushu18 (6x)和Nancy Hall (6x)、2个二倍体I. trifida (2x)品系(4597-10和4597-21)、四倍体I. trifida (4x)、六倍体I. trifida (6x)、二倍体I. temussima (2x)和I. littorallis (2x)以简化基因组测序技术SLAF-seq测序,获得724 589个SLAF标签,其中多态性SLAF标签35 310个。通过序列分析,获得40 765个有效单核苷酸多态(SNP),并用这些SNP分析了8个种质的群体结构和系统发生树。结果表明,利用简化基因组测序技术SLAF-seq能高效、低成本地开发出大量可用于群体遗传分析的SNP标记;通过构建进化树发现甘薯栽培种和野生种I. trifida的亲缘关系比较近。这些分析结果为进一步研究甘薯栽培种的起源提供了基础数据。     

芒果杂交F_1代群体的遗传多样性分析及遗传图谱的构建

以芒果品种贵妃、金煌及其98株杂交F_1代为材料,利用SRAP标记构建了芒果的遗传图谱,并对杂交后代的遗传多样性进行分析。从266对SRAP引物中筛选了35对多态性引物,扩增出200条多态性条带,多态性条带比率为43.18%。UPGMA聚类分析表明,材料间的遗传相似系数为0.52~0.92,有8份材料表现出较强的变异。用JoinMap4.0作图,构建了一张总长801.6 cM的芒果遗传图谱,包含20个连锁群,113个标记位点,标记间的平均距离为9.32 cM。这是首张芒果SRAP标记的遗传图谱,可为芒果高密度遗传图谱的构建提供参考。     

基于SLAF-seq的葡萄种质遗传关系分析

为探明部分系谱不明的葡萄种质的遗传背景,利用简化基因组测序技术对23份鲜食葡萄种质进行遗传关系分析。共获得25.96 Gb高质量数据,开发了715 776个SLAF标签,505 092个多态性SLAF标签。基于456 776个高一致性的SNP,分析和构建了23个葡萄种质的系统发育树。通过SNP聚类分析,23个葡萄种质聚为3大类。其中,同一种质的衍生品种、具有亲子代关系的品种及姊妹系品种各聚合在一类,血缘关系相近的欧亚种和欧美种聚合在一类。研究表明,简化基因组测序技术可以高效地开发出SNP标记、准确分析遗传关系。本研究通过SNP聚类分析为2份遗传背景不明的种质找到了亲缘关系最近的葡萄品种,为葡萄种质鉴定、资源保护和高效育种提供参考依据。     

三个基于水稻明恢86的SSR电子遗传图谱的构建

本研究利用1103对SSR引物（其中716对来自已报道的SSR引物,387对新开发SSR引物）对明恢86与93-11、02428和中花15的多态性进行PCR分析,结果分别检测到多态性标记281个、473个和470个,多态性频率分别为25.48%、42.88%和42.61%。根据各标记在染色体上的电子遗传距离,利用Mapdraw.evenmarker软件,构建了3张基于明恢86的SSR电子遗传图谱。其中明恢86与93-11的标记间平均距离为5.3cM,而明恢86与02428和中花15的标记间平均距离仅都约为3.2cM。这3张高密度的电子遗传图谱的构建,为高通量初步定位明恢86背景下突变体基因创造了条件,同时也为另外3个水稻品种突变体基因的图位克隆提供了方便。