雷蒙德氏棉叶绿体基因组Fosmid文库构建

 采用高盐、低pH值法提取雷蒙德氏棉叶绿体DNA;通过物理剪切法获得随机断裂的DNA片段;剪切片段末端、补平修饰后与pCC1FOS载体连接;用噬菌体包装蛋白包装重组DNA,侵染大肠杆菌EPI300,构建了雷蒙德氏棉叶绿体基因组文库。对于叶绿体DNA剪切,以1 mL注射器中等速度吸打18次为最佳参数。叶绿体基因组Fosmid文库滴度为1×10⁴ cfu·mL^-1,插入片段大小平均为38 kb,最终筛选出39个克隆用于后续研究,覆盖叶绿体基因组9.2倍。以叶绿体特异标记筛选出能够覆盖雷蒙德氏棉叶绿体全基因组的6个克隆：F66,F46,F28,F8,F55和F3,为基因组结构和功能基因分析提供了良好的基础。     

甘蓝基因组细菌人工染色体文库的构建

细菌人工染色体（ BAC）文库是克隆甘蓝抗病优质重要基因的基础,以抗枯萎病、富含硫代葡萄糖苷的结球甘蓝自交系R4P1为材料,美国Epicentre公司的CopyControl TM pCC1BACTM为载体,构建了甘蓝细菌人工染色体文库。该文库有73344个克隆,插入片段平均大小约97 kb,空载率＜3％,覆盖甘蓝基因组约10．9倍,筛选到甘蓝任一基因的概率为99．99％,这些结果表明,构建的文库质量较好,可用于后续分析。构建的甘蓝BAC文库不仅可用于枯萎病基因的克隆,而且为克隆其他重要的功能基因及基因组学等的研究奠定了基础。     

棉花细菌人工染色体文库构建方法探讨

 细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosome, BAC）文库是开展基因组测序、基因图位克隆、分子标记、物理作图等研究的重要基因组资源。本文在构建了二倍体野生棉阿非利加棉（Gossypium herbaceum var. africanum）BAC文库的基础上,就棉花细菌人工染色体基因组文库构建过程中高分子量基因组DNA的提取、部分酶切片段选择、DNA的回收、连接转化以及BAC文库的保存等过程中一些细节和注意事项进行了比较详细的分析比较,希望能为棉花BAC文库的构建提供一些可供借鉴的经验。     

棉花细菌人工染色体文库构建的方法优化

以我国抗病、优质、丰产的棉花优良品种中棉所12号为材料,对棉花细菌人工染色体(BAC)文库构建过程中的一些关键技术,如plug的制备、DNA的部分消化、酶切片段的选择、插入片段与载体的摩尔比值、连接产物的浓缩等进行了研究,建立了构建棉花BAC文库的适宜方法体系。依照该方法初步构建了含有38000个克隆的棉花BAC文库。经检测,插入片段平均大小约为120kb,蓝斑率小于0.5%,空载率小于1%。插入片段与载体的最适摩尔比为1∶15,一次转化可以获得约2000个克隆,cfu·μl 1高达4。该方法为进一步构建中棉所12号多倍基因组的BAC文库、从而进行棉花基因组有关研究奠定了基础。     

细菌人工染色体文库及其应用

细菌人工染色体是1992年以来发展起来的一种新型克隆载体，用于构建人、动物、植物核基因组DNA大片段插入文库。细菌人工染色体在文库构建中具有转化效率高、构建文库简单、嵌合体少、插入片段容易回收、在寄主细胞中插入片段稳定性好、插入片段较大等优点。细菌人工染色体文库的构建对于基因组较大的真核生物基因组学研究具有重要作用，该文库可用于真核生物重要性状基因及全基因组的物理作图、重要农艺性状基因的图位克隆、基因结构及功能分析等研究。本文主要综述了细菌人工染色体文库的构建及其在图位克隆基因、荧光原位杂交、全基因组物理作图等研究中的应用进展。     

长片段小麦细菌人工染色体DNA亚克隆文库的构建

为了加快小麦基因组的测序,以Langdon库中的一个BAC克隆(BAC790O10)为材料,利用HydroShear DNA剪切仪将其打断,产生许多大小不同的DNA随机片段,回收其中3～5 kb的片段,并将这些片段随机克隆入TOPO载体,构建了适合于鸟枪法测序的亚克隆文库.     

樟树细菌人工染色体(BAC)文库的构建及质量检测

樟树(Cinnamomum camphora(L.)Presl)是一种具有材用、药用、油用、香料和生态环境建设等多种用途的樟科植物代表种。本研究以樟树幼嫩叶片为材料,通过提取高分子量核DNA(HMW-DNA)构建了第一个樟树细菌人工染色体(BAC)文库。该文库一共有36 960个克隆,平均插入片段为120 kb,覆盖樟树全基因组5.7倍左右,空载率小于1%。随机挑选10个BAC克隆进行末端测序说明BAC克隆为正常可用的单克隆。以此为基础,对樟树的BAC文库进行了测序,最终得到287.28 G的数据。樟树基因组BAC文库的构建,为樟树重要功能基因的克隆、功能验证、物理图谱的构建和全基因组测序等研究工作奠定了基础。     

亚洲棉7号染色体分离及文库构建

 采用前低渗、酶解、后低渗和盖片轻压相结合的方法,建立了激光法分离二倍体亚洲棉石系亚1号单条染色体技术。单染色体经去蛋白、酶切和PCR扩增后,产物以Southern杂交、简单重复序列(Simple sequence repeats, SSR)引物扩增和荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization, FISH)进行验证,构建了棉花单条染色体文库。克隆片段长度在150~1000 bp,平均为550 bp;文库包含1.38×10⁵个克隆,覆盖染色体长度1倍左右,空载率为1%,滴度为1.3×10⁶ pfu·mL^-1,单一拷贝和低拷贝比例达到59%以上,为该条染色体分子标记的筛选、重要基因克隆和定位、遗传图谱的饱和奠定基础。     

云南疣粒野生稻细菌人工染色体（BAC）文库的构建与分析

我国有3种野生稻,即普通野生稻(oryza rufipogon)、药用野生稻(O.officinalis)、疣粒野生稻(O.granulata).野生稻由于长期处于野生状态,经受了各种灾害和不良环境的自然选择,抗逆性较强,是天然的基因库,保持有栽培稻不具有或已经消失了的遗传基因,它在水稻育种中具有独特的作用,是水稻育种的宏厚物质基础.     

雷蒙德氏棉和亚洲棉TCP基因家族的生物信息学分析

TCP基因家族是植物中特有的一类转录因子家族,涉及了植物的多种生长途径以及各种生理生化反应的信号传导。为了更好地了解TCP基因家族在雷蒙德氏棉和亚洲棉基因组中的数量和分布情况等,通过生物信息学方法,在雷蒙德氏棉(D5)和亚洲棉(A2)全基因组中分别鉴定出37个TCP基因家族成员,并对TCP家族成员进行基因结构、染色体定位、保守域、进化关系等分析。结果表明,雷蒙德氏棉和亚洲棉全基因组分别编码37个TCP转录因子成员。雷蒙德氏棉30个成员基因分布在10条染色体上,亚洲棉37个成员基因分布在13条染色体上;内含子/外显子结构分析表明,TCP基因结构较为简单,大部分不含内含子;功能结构域分析,发现所有TCP转录因子具有高度保守的TCP结构域;根据结构域差异和系统发育分析的结果,将TCP基因家族分成2个亚族,进一步划分为PCF、CIN、CYC/TB1三个亚类。以上结果为进一步研究棉花TCP基因家族各成员的功能奠定一定的理论基础。     

雷蒙德氏棉PIF-like转座元件鉴定与特征分析

PIF-like转座元件在植物基因组中含量丰富,是植物DNA转座子的重要组成部分。利用基因组学和生物信息学的研究手段,系统研究了雷蒙德氏棉全基因组水平PIF-like转座元件的数量、染色体分布、结构特征、表达模式及相邻基因的种类和功能等,共鉴定了440条包含转座酶且插入位置明确的PIF-like转座元件。这些元件几乎均匀地分布在13条染色体上,上下游2 kb内共有171个相邻编码蛋白的基因,其中132个基因注释到了GO数据库中,且这些基因的功能分布广泛;部分PIF-like转座元件表达,且具有组织特异性。这些遗传信息为深入研究棉花PIF-like转座元件介导的基因和基因组的进化规律以及棉花基因的功能奠定基础。     

雷蒙德氏棉和亚洲棉Alfin-like PHD finger家族的生物信息学分析

Alfin-like PHD finger是植物中特有的一类转录调控因子,在调控植物生长发育、非生物胁迫响应及抗病反应等过程中起重要作用。为全面了解Alfin-like PHD finger基因家族在雷蒙德氏棉和亚洲棉基因组中的数目、分布情况及家族各成员间的关系,进而研究和揭示Alfin-like PHD finger在棉花抵抗逆境胁迫中的作用。运用生物信息学的方法在雷蒙德氏棉(D5)和亚洲棉(A2)全基因组中分别鉴定出12个和10个Alfin-like PHD finger基因家族成员,并对家族成员的基因结构、染色体定位、保守结构域及进化关系等方面进行分析。结果表明,雷蒙德氏棉和亚洲棉中Alfin-like PHD finger转录因子具有高度保守的DUF3594结构域和PHD结构域,两个二倍体棉花中该家族基因成员之间为一对一关系;雷蒙德氏棉中的12个成员基因分布在5条染色体上,亚洲棉中的10个成员基因也分布在5条染色体上;亚细胞定位预测发现,该家族的基因分别定位于细胞核、叶绿体基质、过氧化物酶体和细胞质基质;根据结构域差异和系统发育分析结果,将Alfin-like PHD finger转录因子家族分为3个进化分支。上述结果为分离鉴定棉花中新的逆境胁迫响应基因提供参考。     

雷蒙德氏棉Argonaute基因家族的生物信息学预测与分析

Argonaute(AGO)蛋白是参与小RNA调控通路的重要元件,在生命体的生长发育过程中发挥着重要作用。本研究利用AGO蛋白的保守域在雷蒙德氏棉基因组中进行同源比对,鉴定出15个成员,并对其进行进化关系、染色体定位、基因结构、保守域、时空表达模式等分析。结果表明:该家族成员基因长度从3335到9086bp不等,其中11个基因被定位到7条染色体上;该家族成员可分为3个亚族,包含5个小组,各亚族内、小组间成员也存在很高的保守性;发现每个基因都有不同的时空表达模式,且各小组内成员之间存在协同和互补2种表达模式,找到在花器官特异表达的基因1个,胚珠中特异表达的基因3个。本文首次对棉花中AGO基因家族进行了鉴定和生物信息学分析,为进一步研究AGO基因家族在棉花中的功能奠定了基础。     

雷蒙德氏棉一段单拷贝序列的FISH分析

雷蒙德氏棉基因组草图的完成为棉花的基础研究奠定基础,然而该基因组草图仍需要后续的补充和完善。利用雷蒙德氏棉基因组草图信息,分别在6条较长染色体的端部选取了4 kb的序列。通过生物信息学分析这些序列在基因组中的拷贝情况,发现2号染色体一端的序列Chr2D属于单拷贝序列,且其内部没有重复序列。随后以该段序列为探针,对雷蒙德氏棉有丝分裂中期染色体进行荧光原位杂交,结果显示在1号染色体和4号染色体的一端有明显的杂交信号,信号大小远远大于4 kb序列所能产生信号的大小,而信号的强度则比正常的杂交信号暗弱。试验结果说明该4 kb序列Chr2D可能在1号染色体和4号染色体的1个端部有较高的拷贝数,而信号强度的暗弱则说明该序列在染色体上的分布方式可能为散漫分布。杂交信号在1号染色体和4号染色体上的相似性说明,这2对染色体可能有一定的亲缘关系。该结果将对雷蒙德氏棉基因组草图的补充完善有帮助。     

雷蒙德氏棉Argonaut基因家族的生物信息学预测与分析

Argonaute(AGO)蛋白是参与小RNA调控通路的重要元件,在生命体的生长发育过程中发挥着重要作用.本研究利用AGO蛋白的保守域在雷蒙德氏棉基因组中进行同源比对,鉴定出15个成员,并对其进行进化关系、染色体定位、基因结构、保守域、时空表达模式等分析.结果表明:该家族成员基因长度从3335到9086bp不等,其中11个基因被定位到7条染色体上;该家族成员可分为3个亚族,包含5个小组,各亚族内、小组间成员也存在很高的保守性;发现每个基因都有不同的时空表达模式,且各小组内成员之间存在协同和互补2种表达模式,找到在花器官特异表达的基因1个,胚珠中特异表达的基因3个.本文首次对棉花中AGO基因家族进行了鉴定和生物信息学分析,为进一步研究AGO基因家族在棉花中的功能奠定了基础.     

雷蒙德氏棉扩展蛋白基因家族的鉴定和特征分析

扩展蛋白具有松驰细胞壁和增加细胞壁柔韧性的功能。为了弄清该基因家族在雷蒙德氏棉中的特征,利用隐马尔科夫模型(HMM)在雷蒙德氏棉基因组中进行扩展蛋白家族基因成员的鉴定,获得了39个扩展蛋白基因家族成员,分布在12条染色体上。系统发育分析将其归入EXPA、EXPB、EXLA和EXLB共4个亚家族,分别含有26,4,3,6个基因。各亚家族中扩展蛋白基因具有相对多样化的基因结构;扩展蛋白基因家族在进化中经历了3次扩张;染色体片段重复是该基因家族扩张的主要方式;扩张后纯化选择占主导地位。比较棉纤维发育不同时期及叶片、花瓣的深度测序和基因芯片表达谱,发现大部分扩展蛋白基因参与了雷蒙德氏棉纤维、叶片和花瓣的生长发育,在不同的时空范围均表现出表达多样性。Gr EXLA1、Gr EXLA2和Gr EXPA16在花瓣中优势表达,Gr EXPA23和Gr EXPA24在叶片中表达水平较高,推测这些基因的表达分别参与了花瓣和叶片的发育进程;其余的基因,在纤维的不同发育阶段,表现出不同的表达丰度。研究结果有助于了解棉属扩展蛋白基因家族的特征及功能,为深入剖析棉纤维发育过程中的分子调控机理提供了基础。     

雷蒙德氏棉KNOX基因家族全基因组鉴定及表达分析

为探究KNOX基因家族在棉花生长发育中的调控作用,本研究以雷蒙德氏棉为材料,利用生物信息学的方法全基因组鉴定KNOX家族成员,并对其保守结构域、进化模式、染色体定位、基因结构和基因表达情况进行分析。共鉴定到22个KNOX基因,分布于10条染色体上,其中13个基因发生了片段复制。除GrKNOX9和GrKNOX15外,其余GrKNOX蛋白均含有KNOX1,KNOX2,ELK和HOX四个典型结构域。Gr KNOX基因家族进化聚类成两组：ClassⅠ和ClassⅡ。ClassⅠ组包含13个基因,ClassⅡ组含有9个基因。GrKNOX基因在叶片、花瓣、开花后10、20、30和40 d的种子中的表达分析显示,ClassⅠ组成员表达模式差别较大,ClassⅡ组成员表达模式较相似。GrKNOX12、GrKNOX1、GrKNOX17、GrKNOX2、GrKNOX11、GrKNOX3和GrKNOX22在测定的组织中表达量均较高;GrKNOX6、GrKNOX16和GrKNOX19在开花后20、30和40 d的种子中表达量较高,推测这3个基因参与调控棉花种子发育过程。本研究为进一步探究KNOX基因家族在棉花...     

雷蒙德氏棉Plant U-box(GrPUBs)基因家族生物信息学分析

PUBs蛋白调控了作物的生长发育及响应非生物胁迫和生物胁迫的过程。为探讨棉花中U-box类型泛素连接酶家族,本研究利用生物信息学方法分析了二倍体雷蒙德氏棉中PUBs的数目、进化、基因结构、结构域分布及基因表达模式。结果表明,雷蒙德氏棉中有93个Gr PUBs基因家族成员,基因长度为1 101~11 191 bp。亚细胞定位预测结果表明,Gr PUBs编码产物大部分定位在细胞质和细胞核中,少数定位在胞外基质线粒体中。根据除U-box以外所含结构域将该家族成员分为7类,分别含有UFD2结构域、ARM结构域、激酶结构域、只含U-box、WD-40、TPR以及异构酶结构域。Gr PUBs基因家族染色体定位显示,基因在13条染色体上均有分布,但分布不均匀。在第5条染色体最多,有11条基因序列,第4、第12和Scaffold染色体上的基因最少,仅有2条。基因结构分析表明,基因内含子的数目变化较大,在0~17之间,且具有相似结构的基因,其编码蛋白聚为一类。基因表达模式分析发现。几乎1/3的基因在花中优势表达,个别基因在开花后10 d、20 d、30 d和40 d的种子中表达量高于在叶和花中的表达,如Gorai.006G251300。本试验为深入研究U-box类型泛素连接酶在棉花生长发育及抗逆的机理提供了理论指导。     

雷蒙德氏棉和亚洲棉SSR重复序列类型和丰度差异比较

 利用生物信息学相关方法对NCBI数据库中39277条亚洲棉（Gossypium arboretum L.）及63588条雷蒙德氏棉（Gossypium raimondii L.）的EST序列共计64.08 Mb（约相当于基因组的6.02％）分别进行拼接,比较分析了两棉种简单重复序列的重复类型及丰度差异。结果表明：拼接后的一致性序列中,亚洲棉比雷蒙德氏棉存在较高比例的单条序列簇;亚洲棉一至六碱基6种重复类型的SSR间隔距离分别比雷蒙德氏棉的大;亚洲棉中二到六碱基等5种重复类型的比例高于雷蒙德氏棉,但单碱基重复类型比例低于雷蒙德氏棉;两棉种的单碱基、四碱基和六碱基重复类型的优势重复基序和丰度也不同。因此,认为利用四、五、六碱基三种重复类型设计的SSR引物可以有效地鉴定亚洲棉和雷蒙德氏棉的基因组差异。对四倍体棉种的A、D亚组供体棉种中SSR的差异分析,为SSR标记开发、棉种起源和进化的深入研究提供更多有用的信息。     

雷蒙德氏棉LBD基因家族的鉴定及进化表达分析

家族转录因子是后基因组时代的研究热点。植物中的家族转录因子参与调控了许多重要的生物学过程,包括形态建成、信号转导、环境应激反应。植物特有的(lateral organ boundaries domain,LBD)/ASL(ASYMMETRIC LEAVES2-LIKE)家族转录因子包含保守的类似锌指结构CX2CX6CX3C基序,在调控拟南芥、水稻、玉米等模式植物生长发育过程中起到至关重要的作用。然而,对于棉花LBD基因的功能目前我们还知之甚少。本研究从雷蒙德氏棉基因组中鉴定出66个LBD基因,不均匀的分布在13条染色体上。这些基因可分为ClassⅠ和ClassⅡ两大类,细分为Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc、Ⅰd、Ⅱa和Ⅱb等6个亚类。该家族基因结构简单,外显子数目不超过3个。从雷蒙德氏棉LBD家族成员中共找出15段保守基序,并对(lateral organ boundaries,LOB)结构域的保守性进行了分析。基因表达模式分析揭示出雷蒙德氏棉LBD基因家族的表达具有一定时空特异性。本研究为今后雷蒙德氏棉LBD基因功能的验证奠定了基础。